CN111139208A

CN111139208A - 一种伊短菌素高产工程菌及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111139208A
Application number: CN201910834176.XA
Authority: CN
Inventors: 刘清术; 陈武; 黎定军; 张亮; 雷平; 郭照辉; 黄军
Original assignee: HUNAN PROVINCE MICROBIOLOGY INSTITUTE
Current assignee: HUNAN PROVINCE MICROBIOLOGY INSTITUTE
Priority date: 2019-09-04
Filing date: 2019-09-04
Publication date: 2020-05-12
Anticipated expiration: 2039-09-04
Also published as: CN111139208B

Abstract

本发明涉及工程菌株领域，公开了一种伊短菌素高产工程菌及其制备方法和应用。以野生型短短芽孢杆菌X23为出发菌株，将短短芽孢杆菌的中层细胞壁蛋白基因启动子Pmwp与抗性基因ApraR连接，获得ApraR‑Pmwp融合片段，构建同源重组整合载体，利用同源重组技术将野生型短短芽孢杆菌X23中伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede替换为短短芽孢杆菌的中层细胞壁蛋白基因启动子Pmwp，得到一种高产伊短菌素的短短芽孢杆菌工程菌，该菌株的保藏编号为CCTCC NO：M2019681。该短短芽孢杆菌工程菌通过定向遗传修饰，能够提高伊短菌素的产量，培养方式简单、生产效率高，为实现伊短菌素在微生物源农药和医药中的开发与利用奠定了坚实的基础。

Description

一种伊短菌素高产工程菌及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及工程菌株领域，具体涉及一种伊短菌素高产工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

伊短菌素(Edeines)是由短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)产生的线性非核糖体抗菌天然产物，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性菌、支原体和真菌都强烈抑菌活性，对肿瘤细胞也有抑制效果，还具有免疫抑制活性。

伊短菌素的抗菌作用机理完全不同于短短芽孢杆菌产生的另外两种抗菌肽，即短杆菌肽(Gramicidin)和短杆菌酪肽(Tyrocidine)，后两者主要是改变细胞膜的通透性，而伊短菌素的作用机理具有明显的浓度依赖性，低浓度时(<15μg/ml)可逆性地抑制DNA聚合酶II和III的活性进而抑制DNA合成，但是不影响蛋白质的合成，表现为抑菌活性；在高浓度(>150μg/ml)时，伊短菌素结合到核糖体小亚基(30S亚基)的P位点，竞争性抑制fMet-tRNA在核糖体上的结合，抑制蛋白质转录翻译的起始，进而抑制蛋白合成，表现为杀菌活性。基于转录抑制作用机理，伊短菌素已经被广泛用作转录抑制剂研究核糖体功能和蛋白合成。此外，有研究发现伊短菌素还具有消除质粒编码的细菌抗药性和抑制枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞分裂的作用。因此，伊短菌素在农业生产和医药开发领域具有应用前景。

然而，在野生型短短芽孢杆菌中伊短菌素的产量较低，极大地阻碍了伊短菌素作为微生物源农药和医药的开发与应用。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种伊短菌素高产工程菌及其制备方法和应用，该工程菌通过对短短芽孢杆菌进行定向遗传修饰，有效提高伊短菌素的产量。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种伊短菌素高产工程菌，所述工程菌为短短芽孢杆菌工程菌(Brevibacillus brevis)，于2019年9月2日送交中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武汉大学保藏中心)进行保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2019681。

本发明第二方面提供一种伊短菌素高产工程菌的制备方法，包括以下步骤：将短短芽孢杆菌的中层细胞壁蛋白基因启动子Pmwp与阿伯拉霉素抗性基因ApraR连接，获得ApraR-Pmwp融合片段，构建同源重组整合载体，利用同源重组技术将野生型短短芽孢杆菌X23中伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede替换为短短芽孢杆菌的中层细胞壁蛋白基因启动子Pmwp，得到一种短短芽孢杆菌工程菌，该菌株的保藏编号为CCTCC NO：M2019681。

优选地，所述短短芽孢杆菌的中层细胞壁蛋白基因启动子Pmwp的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述抗性基因ApraR的核苷酸序列如SEQID NO：2所示；所述伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

优选地，所述同源重组整合载体以载体pE194为出发载体，与所述ApraR-Pmwp融合片段及Ede簇操纵子中天然启动子区的上、下游同源臂序列构建得到同源重组整合载体pBR322-ErmB-194ori-edePC-ApraR-Pmwp；所述同源重组技术包括将所述同源重组整合载体导入野生型短短芽孢杆菌X23中，将伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede替换为短短芽孢杆菌的中层细胞壁蛋白基因启动子Pmwp；其中，Ede簇操纵子中天然启动子区的上游同源序列片段核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；Ede簇操纵子中天然启动子区的下游同源序列片段核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

优选地，还包括对利用同源重组技术处理后的短短芽孢杆菌进行鉴定，所述鉴定的过程包括以抗性基因ApraR的引物为探针对利用同源重组技术处理后的短短芽孢杆菌进行菌液PCR检测，其中，所述抗性基因ApraR的引物核苷酸序列如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示。

本发明第三方面提供一种伊短菌素的制备方法，该方法包括将伊短菌素高产工程菌发酵制得，所述工程菌为短短芽孢杆菌工程菌，保藏编号为CCTCC NO：M2019681。

优选地，所述伊短菌素高产工程菌发酵包括将伊短菌素高产工程菌活化后，接种于NB液体培养基中进行发酵。

优选地，该方法还包括将所述发酵得到的发酵液上清液进行阳离子交换树脂吸附、氨水洗脱后，经旋转蒸发后，再进行高效液相色谱分离后得到所述伊短菌素。

本发明第四方面提供一种菌剂，该菌剂含有伊短菌素高产工程菌，所述工程菌为短短芽孢杆菌工程菌，保藏编号为CCTCC NO：M2019681。

通过上述技术方案，本发明的有益效果为：

1、本发明通过构建同源重组整合载体，将野生型短短芽孢杆菌X23中伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede替换为短短芽孢杆菌的中层细胞壁蛋白基因启动子Pmwp，构建了能够高产伊短菌素的短短芽孢杆菌工程菌；

2、本发明构建的短短芽孢杆菌工程菌经发酵后伊短菌素的产量与出发菌株野生型短短芽孢杆菌X23相比提高了17倍；

3、本发明的短短芽孢杆菌工程菌培养方式简单、生产效率高，为实现伊短菌素在微生物源农药和医药中的开发与利用奠定了坚实的基础。

附图说明

图1是本发明中启动子Pmwp和PxylA-ApraR的PCR扩增及重叠延伸PCR图谱，其中，A为PxylA-ApraR-Pmwp融合片段PCR图，B为PxylA-ApraR片段PCR图，C为启动子Pmwp片段PCR图；

图2是本发明中同源重组整合载体的构建流程图；

图3是本发明中同源重组整合载体的酶切鉴定图；

图4是本发明中同源重组整合载体同源臂部分测序图谱；

图5是本发明中ApraR-Pmwp融合片段整合到短短芽孢杆菌染色体上稳定遗传的示意图；

图6是本发明获得的短短芽孢杆菌工程菌的菌落PCR鉴定图，其中，a为双引物对鉴定示意图，b为PCR鉴定图；

图7是本发明获得的短短芽孢杆菌工程菌与野生型短短芽孢杆菌X23生成的伊短菌素HPLC检测图；

图8是本发明获得的短短芽孢杆菌工程菌发酵液对枯草芽孢杆菌的抑制图，其中，1-6为本发明获得的短短芽孢杆菌工程菌，7为野生型短短芽孢杆菌X23。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

第一方面，本发明提供一种伊短菌素高产工程菌，所述工程菌为短短芽孢杆菌工程菌，保藏编号为CCTCC NO：M2019681。

第二方面，本发明提供一种伊短菌素高产工程菌的制备方法，包括以下步骤：将短短芽孢杆菌的中层细胞壁蛋白基因启动子Pmwp与抗性基因ApraR连接，获得ApraR-Pmwp融合片段，构建同源重组整合载体，利用同源重组技术将野生型短短芽孢杆菌X23中伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede替换为短短芽孢杆菌的中层细胞壁蛋白基因启动子Pmwp，得到一种短短芽孢杆菌工程菌，该菌株的保藏编号为CCTCC NO：M2019681。

优选地，所述短短芽孢杆菌的中层细胞壁蛋白基因启动子Pmwp的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述抗性基因ApraR的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

优选地，所述同源重组整合载体以载体pE194为出发载体，与所述ApraR-Pmwp融合片段及Ede簇操纵子中天然启动子区的上、下游同源序列片段构建得到同源重组整合载体pBR322-ErmB-194ori-edePC-ApraR-Pmwp；所述同源重组技术包括将所述同源重组整合载体导入野生型短短芽孢杆菌X23中，将伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede替换为短短芽孢杆菌的中层细胞壁蛋白基因启动子Pmwp；其中，Ede簇操纵子中天然启动子区的上游同源序列片段核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；Ede簇操纵子中天然启动子区的下游同源序列片段核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

在本发明的实施方式中，所述伊短菌素高产工程菌是按照如下方法构建得到的：

(1)PCR扩增短短芽孢杆菌的中层细胞壁蛋白启动子Pmwp，通过重叠延伸PCR将启动子Pmwp序列与抗性基因ApraR连接，获得ApraR-Pmwp融合片段；

(2)采用Red-ET重组技术将Ede簇操纵子中天然启动子区上游同源序列片段、ApraR-Pmwp融合片段、Ede簇操纵子中天然启动子区下游同源序列片段，克隆入线性化的温敏型载体pE194中，构建出同源重组整合载体pBR322-ErmB-194ori-edePC-ApraR-Pmwp；

(3)通过电转化方法将同源重组整合载体pBR322-ErmB-194ori-edePC-ApraR-Pmwp导入野生型短短芽孢杆菌X23中，将ApraR-Pmwp片段整合到野生型短短芽孢杆菌X23的染色体上，替换伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede，得到基因重组的短短芽孢杆菌；

(4)设计引物鉴定出正确的将Pede替换为Pmwp的短短芽孢杆菌工程菌；

(5)利用HPLC-MS分析短短芽孢杆菌工程菌合成伊短菌素的能力，同时采用平板抑菌试验来测定发酵液的抑菌活性。

第三方面，本发明提供一种伊短菌素的制备方法，该方法包括将伊短菌素高产工程菌发酵制得，所述工程菌为短短芽孢杆菌工程菌，保藏编号为CCTCC NO：M2019681。

第四方面，本发明提供一种菌剂，该菌剂含有伊短菌素高产工程菌，所述工程菌为短短芽孢杆菌工程菌，保藏编号为CCTCC NO：M2019681。

本发明中的生物材料来源如下：

野生型短短芽孢杆菌X23：由湖南农业大学植物保护学院提供；

载体pE194，即pBR322-ErmB-194ori：由湖南省微生物研究院保存；

抗性基因ApraR：含有阿伯拉霉素抗性基因ApraR的质粒pSET152由湖南省微生物研究院保存；

限制性内切酶Bam HI/Hind III/Kpn I购自NEB公司。

实施例1

利用野生型短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)X23作为出发菌株，将短短芽孢杆菌的中层细胞壁蛋白基因启动子(强启动子基因)Pmwp，通过构建同源重组整合载体PBR322-ErmB-194ori-edePC-ApraR-Pmwp，将ApraR-Pmwp片段整合到短短芽孢杆菌X23基因组中，实现伊短菌素的高效表达。

(1)PCR扩增短短芽孢杆菌的中层细胞壁蛋白基因启动子Pmwp

提取短短芽孢杆菌X23菌株的总DNA，根据GenBank中登录的登记号为No.CP023474.1的B.brevis Pmwp fragment序列，设计引物Pmwp-ede-1和Pmwp-ede-2，序列如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示：

Pmwp-ede-1:CGCTCGCCAGTCGATTGGCTGAAGTCCGAAGAAGCGTTGT

Pmwp-ede-2:ATTGCTTCTTATCCTGATGCATAACCTTGTGTTCTCCTCCTCT

以短短芽孢杆菌X23菌株的总DNA为模板，Pmwp-ede-1/Pmwp-ede-2为引物，扩增长为0.55kp的启动子Pmwp，其PCR图谱见图1中C所示，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s；35个循环；72℃延伸10min；启动子Pmwp序列如SEQ ID NO：1所示。

(2)PCR扩增筛选标记ApraR(ApraRmycin抗性)

以质粒PBR322-ErmB-194ori-ApraR为模板，用ApraR1(edePC)和ApraR2(edePmwp)为引物，扩增1kp左右的筛选标记抗性基因ApraR，其PCR图谱见图1中B所示；反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性39s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。

抗性基因ApraR、引物ApraR1(edePC)和ApraR2(edePmwp)序列如SEQID NO：2、SEQID NO：10和SEQ ID NO：11所示：

ApraR1(edePC):TGACACTATAGAAGAGTCATCGGATCTGCAATTTGAATAATAACC

ApraR2(edePmwp):ACAACGCTTCTTCGGACTTCAGCCAATCGACTGGCGAGCG

(3)重叠延伸拼接启动子Pmwp与抗性基因ApraR

用PCR回收试剂盒回收两次PCR的产物，并以两种回收产物为模板，以Pmwp-ede-1/ApraR2(edePmwp)为引物，采用重叠延伸拼接的方法扩增1.55kb的融合片段(ApraR-Pmwp)，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸10min，得到ApraR-Pmwp融合片段，其PCR图谱见图1中A所示。

(4)PCR扩增Ede簇操纵子中天然启动子区的上下游两端同源臂

设计引物edePC-F1、edePC-F2、Pmwp-ede-R1和edePC-R2，序列如SEQID NO：12、SEQID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示：

edePC-F1:CGAAAAACAAGTTAAGGGATGCAGTTTATGCATCCCTTAACGGATCCGGAGATAGTGAAGTGGCTAAAC

edePC-F2:GGTTATTATTCAAATTGCAGATCCGATGACTCTTCTATAGTGTCA

Pmwp-ede-R1:AGAGGAGGAGAACACAAGGTTATGCATCAGGATAAGAAGCAAT

edePC-R2:ATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTGTTCCAATTCTTGAGCCAGCAA

以短短芽孢杆菌X23菌株总DNA为模板，edePC-F1/edePC-F2和Pmwp-ede-R1/edePC-F2为引物，分别扩增长为1kp的上下游同源臂，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；35个循环；72℃延伸10min，用PCR回收试剂盒回收，得到上游同源序列片段HAF和下游同源序列片段HAR，序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。

(5)同源重组整合载体PBR322-ErmB-194ori-edePC-ApraR-Pmwp的构建

如图2所示，将HAF、ApraR-Pmwp、HAR和出发载体PBR322-ErmB-194ori(pE194)片段适量混合，加入适量DNA polymerase和缓冲液，通过程序：30℃、20min，75℃、20min，50℃、30min进行体外连接，然后连接产物进行过膜去除盐离子，再将产物通过电击转入E.coliGB05-dir细胞，ApraR抗性筛选阳性转化子，转化子经限制性内切酶BamHI/HindIII/Kpn I酶切鉴定正确，酶切鉴定图见图3，再进行测序进一步鉴定，得到同源重组整合载体PBR322-ErmB-194ori-edePC-ApraR-Pmwp，其同源臂部分测序图谱见图4；

(6)基因重组短短芽孢杆菌工程菌的构建

制备短短芽孢杆菌感受态细胞：从-80℃冰箱中取适量野生型短短芽孢杆菌X23甘油菌液，划线于LB平板，30℃培养24h；挑取单菌落接种于1mL的LB培养基中，放置于恒温振荡器上，30℃，900rpm，培养过夜；取40μL过夜培养菌液，转接到1.3mL新鲜LB液体培养基中，900rpm，培养4h，OD600约2.0；将培养液在4℃，9000rpm，离心1分钟，去上清，获得感受态细胞；

将步骤(5)中正确构建的同源重组整合载体PBR322-ErmB-194ori-edePC-ApraR-Pmwp，参考Brevibacillus ExpressionSystemII&#x2d(宝生物工程：短短芽孢杆菌表达系统II宝生物工程)的方法转入野生型短短芽孢杆菌X23中，ApraR-Pmwp融合片段整合到短短芽孢杆菌染色体上稳定遗传的示意图见图5，将转化子在含有ApraR(10ug/mL)的固体LB上筛选，30℃倒置培养48h；挑取转化子做菌液PCR，采用ApraR抗性基因的引物(ApraR-F和ApraR-R)作为探针，有对应条带的为阳性转化子，如图6所示，表明同源重组整合载体PBR322-ErmB-194ori-edePC-ApraR-Pmwp已经成功转入短短芽孢杆菌X23中引物，ApraR-F和ApraR-R的序列如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示；

将正确的转化子，接种于37℃、不含抗生素的LB培养基中培养14h，以丢失温敏型替换载体，然后在LB平板上划线，长出单菌落后，挑取单菌落分别划线到阿伯拉霉素(Apra)平板和红霉素(Erm)平板上划线，筛选只能在阿伯拉霉素抗性上生长、不能在红霉素平板上生长的转化子，即有可能是正确的启动子替换的转化子；将筛选得到的转化子于1mL含Apra的LB培养基中进行两对引物(ApraR-F和ApraR-R)的菌液PCR检测，结果都能检测出理论大小的条带，说明短短芽孢杆菌X23中伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede成功替换为短短芽孢杆菌的中层细胞壁蛋白基因启动子Pmwp，得到短短芽孢杆菌工程菌，于2019年9月2日在中国典型培养物保藏中心进行保藏，编号为CCTCC NO：M2019681，其中Pede的序列如SEQ ID NO：3所示。

测试例1

将短短芽孢杆菌工程菌(CCTCC NO：M2019681)和出发菌株短短芽孢杆菌X23在LB液体培养基中发酵2d后，分别将发酵液上清采用阳离子交换树脂吸附，氨水洗脱后进行旋转蒸发，获得伊短菌素粗样品；将伊短菌素粗样品溶解后粗样品直接进行HPLC检测，检测伊短菌素A(结构式如式Ⅰ所示)的含量，图谱见图7，通过对比分析发现，本发明得到的短短芽孢杆菌工程菌(CCTCC NO：M2019681)与短短芽孢杆菌X23相比，伊短菌素A的产量提高约17倍，能够实现短短芽孢杆菌发酵高效生产伊短菌素，使得短短芽孢杆菌的抗菌肽产量更高，抗菌效果更优，

测试例2

抑菌试验：将短短芽孢杆菌工程菌(CCTCC NO：M2019681)和出发菌株短短芽孢杆菌X23在LB液体培养基中发酵2d的发酵液高速离心，上清液经过孔径为0.22μm的细菌过滤器进行过滤获得发酵滤液，将滤纸片均匀放于添加了枯草芽孢杆菌的LB平板上，分别将10μL短短芽孢杆菌工程菌(CCTCC NO：M2019681)和出发菌株短短芽孢杆菌X23的发酵滤液加入滤纸片上，37℃过夜培养，测定和比较抑菌圈大小，结果见图8，本发明得到的短短芽孢杆菌工程菌(CCTCC NO：M2019681)对枯草芽孢杆菌的抑制效果明显优于短短芽孢杆菌X23。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南省微生物研究院

<120> 一种伊短菌素高产工程菌及其制备方法和应用

<130> JSI00966WSWYJ

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 548

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agtccgaaga agcgttgtct actagcgaga acgagtacca aaaggctgta ttgtcataca 60

acctggctgt tgtagctttt gaaacagctc tgggtaacta actgaaaaca agatttgtaa 120

gctttcgaat ccaattggaa aaaggttcag tcgtgacagc ccgccatatg tcccctataa 180

tacggattgt ggcggatgtc acttcgtaca taatggacag gtgaataacg aaccacgaaa 240

aaaactttaa ttttttttcg aaggcgccgc aacttttgat tcgctcaggc gtttaatagg 300

atgtcacacg aaaaacgggg aattgtgtaa aaaagattca cgaattctag cagttgtgtt 360

acactagtga ttgttgcatt ttacacaata ctgaatatac tagagatttt taacacaaaa 420

agcgaggctt tcctgcgaaa ggaggtgaca cgcgcttgca ggattcgggc tttaaaaaga 480

aagatagatt aacaacaaat attccccaag aacaatttgt ttatactaga ggaggagaac 540

acaaggtt 548

<210> 2

<211> 1119

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctgtcaaaga accatcaaac ccttgataca caaggctttg acctaatttt gaaaaatgat 60

gttgtttcta tatagtatca agataagaaa gaaaaggatt tttcgctacg ctcaaatcct 120

ttaaaaaaac acaaaagacc acatttttta atgtggtctt tattcttcaa ctaaagcacc 180

cattagttca acaaacgaaa attggataaa gtgggatatt tttaaaatat atatttatgt 240

tacagtaata ttgactttta aaaaaggatt gattctaatg aagaaagcag acaagtaagc 300

ctcctaaatt cactttagat aaaaatttag gaggcatatc aaatgcaata cgaatggcga 360

aaagccgagc tcatcggtca gcttctcaac cttggggtta cccccggcgg tgtgctgctg 420

gtccacagct ccttccgtag cgtccggccc ctcgaagatg ggccacttgg actgatcgag 480

gccctgcgtg ctgcgctggg tccgggaggg acgctcgtca tgccctcgtg gtcaggtctg 540

gacgacgagc cgttcgatcc tgccacgtcg cccgttacac cggaccttgg agttgtctct 600

gacacattct ggcgcctgcc aaatgtaaag cgcagcgccc atccatttgc ctttgcggca 660

gcggggccac aggcagagca gatcatctct gatccattgc ccctgccacc tcactcgcct 720

gcaagcccgg tcgcccgtgt ccatgaactc gatgggcagg tacttctcct cggcgtggga 780

cacgatgcca acacgacgct gcatcttgcc gagttgatgg caaaggttcc ctatggggtg 840

ccgagacact gcaccattct tcaggatggc aagttggtac gcgtcgatta tctcgagaat 900

gaccactgct gtgagcgctt tgccttggcg gacaggtggc tcaaggagaa gagccttcag 960

aaggaaggtc cagtcggtca tgcctttgct cggttgatcc gctcccgcga cattgtggcg 1020

acagccctgg gtcaactggg ccgagatccg ttgatcttcc tgcatccgcc agaggcggga 1080

tgcgaagaat gcgatgccgc tcgccagtcg attggctga 1119

<210> 3

<211> 208

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aattttttcc attctatgca gcgctagaaa atggaaaaaa gagatggaat tcatctaatt 60

ttcagaaata acatttaatg gaaaattcat ttgacactat agaagagtca tcgatatagt 120

tgggatggaa gtatttgtaa tcaattagat tttttgccat atccgaattg tgattacatc 180

tgcacaattc cgaaaggggg gaaatgca 208

<210> 4

<211> 1011

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggagatagtg aagtggctaa acacggcaga ctgtaaatct gctccctccg ggttcggcgg 60

ttcgaatccg tctctcccca ccattgattt tctattgatg atgtgctatt ttttcatagt 120

ttcacatgcc ggtgtggcgg aatggcagac gcgcgcgact caaaatcgtg agggaaaccg 180

tgggggttca agtcccttca ccggcaccat attaaaaacg aatgcacact aaccatgatg 240

tttacagaca catggaaggt gtgctttttt catatacgga aaacaattca aacagcggcg 300

agtctaagac ttgattttta ggtcttaggt cgccgctgtt tcattttcgg ggaacgaaaa 360

tagctagctt aaaagttcaa ttctgcaatc gtctcgccaa acagaaccat gccatttttt 420

tgaaatccga gtgaagcgta aaggttttct gctgcgatat tggctggagc ataaccaatg 480

acaatttttt gacaatcgtc ttttgctttc agtatatcaa tgacttgcga aatcgcagca 540

cgtccgtagc cttggcgttg atagttggca tcaactaaga gtctgtaaat ccagtagttt 600

ccatcgtcgg ggtcaagccc atacatgaca aagccaacca tcgtgtcctc atggtatatg 660

gccaaaggga caaatgtagt ttgaaacttt gcttcggcta tggagtagag gttcggggca 720

acaaactcac tctgttcagg agtaggttcc agttcaatac actcttccca gttttccagg 780

gttacttcac gaagtgtcac agacatctaa tcacattcat ccttccaggg ggtgtttttg 840

ccaatatatt acattttatc ctacgtgaaa agacagccaa aatcaatagc gtgcacaaaa 900

ttttttccat tctatgcagc gctagaaaat ggaaaaaaga gatggaattc atctaatttt 960

cagaaataac atttaatgga aaattcattt gacactatag aagagtcatc g 1011

<210> 5

<211> 1010

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgcatcagga taagaagcaa tggaatggcg gatatccttt aagtcatcca caaaagcgta 60

tctggtatac ggaaaaatta catccacagc ttcctgtcca tacgttaggg gggatggtgc 120

gggttcaagg aaaagtgaaa ctggatgtac ttgaagcggc cattcacctg ttcattcaaa 180

agaacgatgc tttgcgactc aactatcaag aagaagagac agtccttcag tttgttgggg 240

agtatgaacc gcagccattg caggtatttg atttcagaca agaaccgaat gcccctgatc 300

ggtgcagaca attcctgcaa gctttgtttg caaaaccatt ttcgatcgga caggagcctc 360

tattctactt ttgtctgatt caactgagtg acgaagaagc gggatatttt gtaaagtttc 420

atcatttgat tgctgatggt tggtccatct ccgttatgac agaacaaatt gctcactatt 480

atgacacgtt gttagcaggc ggtaccgttc atgtaggaga tgaacacgcg tatcaagctt 540

ttgtcgacag ggagcatgcc tattctcagt ctgagagatt tgaaaaggac aagagatatt 600

ggcgggacaa gtttcagagc ttgcctgtga tcacgacatt agcaaaggca acagatacga 660

ccgagggcaa gcgcaaagtc tatgcattca accgtgaaga ttcgacaaga atacgccaat 720

ttgcagacca gatgaaatgc tcgctaaatt ccttgtttgt ggctctcgtc agtctttacc 780

ttcagcgttg tacgaggcaa gaagagatcg tgattggtac gccgctgtta aatcgttcag 840

gcaaagtgga gcgcaaaata ttcgggatgt tcaccagcac tatgccattt cgtctggcag 900

ttccgatgga aatggatgcc ttcgattatg ttaaacatgt caacagggaa ttgacttcct 960

gtttttttca tcagaaatat ccgtacgatt tgctggctca agaattggaa 1010

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgcaatacga atggcgaaaa gc 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcagccaatc gactggcgag cg 22

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgctcgccag tcgattggct gaagtccgaa gaagcgttgt 40

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

attgcttctt atcctgatgc ataaccttgt gttctcctcc tct 43

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgacactata gaagagtcat cggatctgca atttgaataa taacc 45

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

acaacgcttc ttcggacttc agccaatcga ctggcgagcg 40

<210> 12

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgaaaaacaa gttaagggat gcagtttatg catcccttaa cggatccgga gatagtgaag 60

tggctaaac 69

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggttattatt caaattgcag atccgatgac tcttctatag tgtca 45

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

agaggaggag aacacaaggt tatgcatcag gataagaagc aat 43

<210> 15

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga ggcagctgtt ccaattcttg 60

agccagcaa 69

Claims

1.一种伊短菌素高产工程菌，其特征在于，所述工程菌为短短芽孢杆菌工程菌，保藏编号为CCTCC NO：M2019681。

2.一种伊短菌素高产工程菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将短短芽孢杆菌的中层细胞壁蛋白基因启动子Pmwp与抗性基因ApraR连接，获得ApraR-Pmwp融合片段，构建同源重组整合载体，利用同源重组技术将野生型短短芽孢杆菌X23中伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede替换为短短芽孢杆菌的中层细胞壁蛋白基因启动子Pmwp，得到一种短短芽孢杆菌工程菌，该菌株的保藏编号为CCTCC NO：M2019681。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述短短芽孢杆菌的中层细胞壁蛋白基因启动子Pmwp的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述抗性基因ApraR的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述同源重组整合载体以载体pE194为出发载体，与所述ApraR-Pmwp融合片段及Ede簇操纵子中天然启动子区的上、下游同源序列片段构建得到同源重组整合载体pBR322-ErmB-194ori-edePC-ApraR-Pmwp；

所述同源重组技术包括将所述同源重组整合载体导入野生型短短芽孢杆菌X23中，将伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede替换为短短芽孢杆菌的中层细胞壁蛋白基因启动子Pmwp；

其中，Ede簇操纵子中天然启动子区的上游同源序列片段核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

Ede簇操纵子中天然启动子区的下游同源序列片段核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，还包括对利用同源重组技术处理后的短短芽孢杆菌进行鉴定，所述鉴定的过程包括以抗性基因ApraR的引物为探针对利用同源重组技术处理后的短短芽孢杆菌进行菌液PCR检测，其中，所述抗性基因ApraR的引物核苷酸序列如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示。

6.一种伊短菌素的制备方法，其特征在于，该方法包括将伊短菌素高产工程菌发酵制得，所述工程菌为短短芽孢杆菌工程菌，保藏编号为CCTCC NO：M2019681。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述伊短菌素高产工程菌发酵包括将伊短菌素高产工程菌活化后，接种于NB液体培养基中进行发酵。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，该方法还包括将所述发酵得到的发酵液上清液进行阳离子交换树脂吸附、氨水洗脱后，经旋转蒸发后，再进行高效液相色谱分离后得到所述伊短菌素。

9.一种菌剂，其特征在于，该菌剂含有伊短菌素高产工程菌，所述工程菌为短短芽孢杆菌工程菌，保藏编号为CCTCC NO：M2019681。