CN108913645A - 一种敲除malR的地衣芽孢杆菌菌株及构建方法和应用 - Google Patents

一种敲除malR的地衣芽孢杆菌菌株及构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种敲除malR的地衣芽孢杆菌菌株及构建方法和应用，本发明通过基因工程的方法敲除了地衣芽孢杆菌DW2的基因组内的负责转录碳代谢转录因子MalR的基因—malR基因，成功得到了缺失malR基因的地衣芽孢杆菌DW2ΔmalR。相对于地衣芽孢杆菌DW2来说，本发明所构建得到的菌株在杆菌肽发酵过程中发酵液中杆菌肽的产量提高了23%以上。

Description

一种敲除malR的地衣芽孢杆菌菌株及构建方法和应用
技术领域
本发明涉及地衣芽孢杆菌菌株改造领域，尤其是一种敲除malR的地衣芽孢杆菌菌株及构建方法和应用。
背景技术
杆菌肽，又称枯草菌素，是由枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌产生的一种肽类抗生素，其由12个氨基酸残基组成，组成氨基酸包括鸟氨酸（Orn）、D-苯丙氨酸（D-Phe）、异亮组氨酸（His）、D-天冬氨酸（D-Asp）、天冬酰胺（Asn）、赖氨酸（Lys）、D-谷氨酸（D-Glu）、半胱氨酸（Cys）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）和缬氨酸（Val）11种氨基酸。杆菌肽可以抑制或杀灭某些致病菌，强烈抑制革兰氏阴性菌的生长，并与其它抗生素（如青霉素、庆大霉素等）具有协同增强效应；并且，其几乎不会在动物的肠道内被吸收，而且排泄迅速，没有残留，因此被广泛应用于饲料添加。
杆菌肽是以氨基酸为前体物质，通过非核糖体合成酶进行合成的。目前的研究主要集中在通过增加杆菌肽的几种前体氨基酸的供应来提高杆菌肽的产量上，而对于通过改造转录调节因子来提高杆菌肽的产量的报道很少。
地衣芽孢杆菌中存在着众多与菌株代谢产物的合成息息相关的基因，而，杆菌肽的产量与何种基因相关仍然是个未知数，通过何种基因改造的方式得到高产杆菌肽的工程菌也有待进一步的研究。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种敲除碳代谢转录因子MalR的基因—malR的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法，成功得到缺失了malR基因的地衣芽孢杆菌菌株。
一种敲除malR的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的构建方法，包括以下步骤：
（1）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出malR基因的上游同源臂和malR基因的下游同源臂；
（2）通过重叠延伸PCR将malR基因的上游同源臂和malR基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段；
（3）采用XbaI和BamHI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；
（4）准备质粒 T2(2)-ori，并采用XbaI和BamHI限制性内切酶对质粒 T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；
（5）将步骤（3）得到的酶切基因片段和步骤（4）得到的线性质粒片段经DNA 连接酶进行连接，得到敲除质粒T2(2)-ΔmalR；
（6）将敲除质粒T2(2)-ΔmalR转入地衣芽孢杆菌DW2中，以卡那青霉素作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；
（7）将阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到malR基因的上游同源臂或malR基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
（8）挑选malR基因的上游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与malR基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除了malR基因的地衣芽孢杆菌DW2ΔmalR（简称：Bacillus licheniformisDW2ΔmalR）；
其中，所述的地衣芽孢杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏编号为CCTCC NO：M2011344；
所述地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA序列中的malR基因为SEQUENCE LISTING中所示。
本发明人首次尝试构建敲除负责转录碳代谢转录因子MalR的基因—malR基因的地衣芽孢杆菌DW2ΔmalR，成功得到了缺失malR基因的地衣芽孢杆菌菌株，为提高杆菌肽产量提供了一种新策略。
本发明的目的之二在于根据上述通过敲除malR来构建地衣芽孢杆菌的方法构建得到的地衣芽孢杆菌DW2ΔmalR。
本发明的目的之三在于上述地衣芽孢杆菌DW2ΔmalR在抗菌肽生产中的应用，其应用步骤包括：A种子发酵，B生产发酵。
所述种子发酵的培养基配方为：6-10g/L蛋白胨，2-6g/L酵母浸出粉，6-10g/L氯化钠，pH 7.0 ~ 7.2。
所述生产发酵的培养基配方为：60-100g/L豆粕；15-40g/L玉米淀粉；4-8 g/LCaCO3和0.5-2 g/L (NH4)2SO4。
与地衣芽孢杆菌DW2相比，通过本发明构建得到的地衣芽孢杆菌DW2ΔmalR的杆菌肽产量提高了23%以上。本发明的研究结果表明：敲除地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA中的碳代谢转录因子基因malR是一种十分有效的提高杆菌肽产量的方法。
附图说明
图1为步骤（1）得到的malR基因上游同源臂和malR基因下游同源臂的琼脂糖凝胶图；其中，泳道M为DNA marker，泳道1为malR基因的上游同源臂，泳道2为malR基因的下游同源臂；
图2为步骤（2）得到的目的基因片段的琼脂糖凝胶图；其中，泳道M为DNA marker，泳道1为步骤（2）得到的目的基因片段；
图3为步骤（5）得到的敲除质粒T2(2)-ΔmalR进行菌落PCR验证图；其中，泳道M为DNAmarker，泳道1为敲除质粒T2(2)-ΔmalR进行菌落PCR验证的条带；
图4为步骤（6）得到的阳性转化子菌株进行菌落PCR验证图，其中，泳道M为DNA marker，泳道1为阳性转化子菌株的验证条带；
图5为步骤（8）得到的敲除了malR基因的地衣芽孢杆菌DW2ΔmalR的验证条带，泳道M为DNA marker，泳道1为地衣芽孢杆菌DW2ΔmalR的验证条带；
其中，上述DNA marker泳道中从上到下的条带对应的分子量依次为：5000 bp，3000bp，2000 bp，1500 bp，1000 bp，750bp，500 bp，250 bp，100 bp。
具体实施方式
现根据附图具体说明本发明的较佳实施方式：
一种敲除malR（即碳代谢转录因子MalR的转录基因）的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤：
（1）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出malR基因的上游同源臂和malR基因的下游同源臂；
（2）通过重叠延伸PCR将malR基因的上游同源臂和malR基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段；
（3）采用XbaI和BamHI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；
（4）准备质粒 T2(2)-ori，并采用XbaI和BamHI限制性内切酶对质粒 T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；
（5）将步骤（3）得到的酶切基因片段和步骤（4）得到的线性质粒片段经DNA 连接酶进行连接，得到敲除质粒T2(2)-ΔmalR；
（6）将敲除质粒T2(2)-ΔmalR转入地衣芽孢杆菌DW2中，以卡那青霉素作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；
（7）将阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到malR基因的上游同源臂或malR基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
（8）挑选malR基因的上游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与malR基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除了malR基因的地衣芽孢杆菌DW2ΔmalR（简称：Bacillus licheniformis DW2ΔmalR）；
其中，所述的地衣芽孢杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344；
所述地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA序列中的malR基因为SEQUENCE LISTING中所示。
上述碳代谢转录因子MalR公布于美国国立生物技术信息中心—NCBI的基因库中。
一种敲除malR的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法的具体实施方式如下：
1、步骤（1）的具体操作步骤为：
根据地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA序列中的malR基因的基因序列，设计malR基因的上游同源臂引物（malR-F1、malR-R1）和下游同源臂引物（malR-F2、malR-R2）；并以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，分别以malR基因的上游同源臂引物、下游同源臂引物进行PCR扩增得到malR基因的上游同源臂片段和malR基因的下游同源臂片段（malR基因的上游同源臂片段为515bp；malR基因的下游同源臂片段为537bp）；
其中，malR-F1、malR-R1、malR-F2、malR-R2的序列为：
malR-F1 ：CGGGATCCACGGAGCGATCCAAAACTTC、
malR-R1：AGAGACTGTGCCTGCGGAATTGTCTTGATGGTTCAAAATAT、
malR-F2：ATATTTTGAACCATCAAGACAATTCCGCAGGCACAGTCTCT、
malR-R2：GCTCTAGAAAGGTCAGATAGGTGGTAAG；
2、步骤（2）的具体操作步骤为：
以malR基因的上游同源臂和malR基因的下游同源臂片段为模板，上游同源臂引物malR-F1、下游同源臂引物malR-R2为引物，通过重叠延伸PCR将malR基因的上游同源臂和malR基因的下游同源臂连接到一起，得到目的基因片段1052 bp；
3、步骤（3）的具体操作步骤为：
采用XbaI和BamHI限制性内切酶对步骤（2）中的目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段（1050 bp）；
4、步骤（4）的具体操作步骤为：
准备质粒 T2(2)-ori（其中，质粒T2(2)-ori的构建方法为：将来自pE194质粒的194-ori、来自于pDG780质粒的卡那霉素抗性基因、来自质粒pBluescript II SK(+)-X52328的pUC-ori通过PCR反应扩增，并回收、酶切。按照194-ori，卡那霉素抗性基因，pUC-ori的顺序连接。此构建方法参考文献：郭兴华,熊占等(1991)枯草杆菌-大肠杆菌多功能穿梭载体的构建.生物工程学报7(3):224-229和彭清忠,张惟材等(2002)短小芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭分泌表达载体的构建.生物工程学报18(4):438-441），并采用XbaI和BamHI限制性内切酶对质粒 T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段（4250bp）；其中，所述的限制性内切酶XbaI和BamHI限制性内切酶均购自北京全式金生物技术有限公司；
5、步骤（5）的具体操作步骤为：
将步骤（3）的酶切基因片段和步骤（4）的线性质粒片段经DNA 连接酶（通常为T4 DNA连接酶）进行连接，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证（所用引物为：T2-F和T2-R）。若转化子的PCR验证结果为：在1304 bp处出现电泳条带，说明敲除载体构建成功，上述转化子为阳性转化子(命名为：敲除载体T2(2)-ΔmalR)；
6、步骤（6）的具体操作步骤为：
将敲除载体T2(2)- ΔmalR转入地衣芽孢杆菌DW2中，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证（所用引物为：T2-F和T2-R）。若转化子的PCR验证结果为：在1304bp处出现电泳条带，证明：敲除载体T2(2)- ΔmalR成功转入地衣芽孢杆菌DW2中，此时，该转化子为阳性转化子（即转入了敲除载体T2(2)- ΔmalR的地衣芽孢杆菌DW2）；
其中，T2-F和T2-R的序列为:
T2-F： ATGTGATAACTCGGCGTA、
T2-R： GCAAGCAGCAGATTACGC；
7、步骤（7）的具体操作步骤为：
将步骤（7）得到的阳性转化子在45℃条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基上转接培养3次，每次培养12 h，并以T2-F和ΔmalR -KYR为引物（或以T2-R与ΔmalR -KYF为引物）进行菌落PCR检测单交换菌株，扩增出1819bp或2896bp长度的条带，即证明为单交换菌株；
其中，ΔmalR-KYF和ΔmalR -KYR的序列为:
ΔmalR -KYF： GACGCTTCCAAATACGTATT、
ΔmalR -KYR： ATGATAACGACAAATGAAGAGC；
8、步骤（8）的具体操作步骤为：
将步骤（7）得到的PCR检测出现1819 bp条带的单交换菌株和步骤7）得到的PCR检测出现2896 bp条带的单交换菌株混合接种培养，在37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，挑转化子进行菌落PCR验证（引物为ΔmalR -KYF和ΔmalR -KYR）。若转化子的PCR验证结果为：在2003bp处出现电泳条带时，说明基因回复突变，该转化子为地衣芽孢杆菌DW2；在1550 bp处出现电泳条带时，说明DW2的基因组上的malR基因成功敲除，该转化子为阳性转化子。随后针对阳性转化子进行DNA测序进一步验证，得到双交换成功的malR敲除菌株（即地衣芽孢杆菌DW2ΔmalR）。
本发明还提供了根据上述敲除malR的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法构建得到的地衣芽孢杆菌DW2ΔmalR。
本发明还提供了上述地衣芽孢杆菌DW2ΔmalR在杆菌肽生产中的应用，其应用步骤包括：A种子发酵，B生产发酵。
本发明人根据上述地衣芽孢杆菌DW2ΔmalR在杆菌肽生产中的应用步骤提供了14种实施例，并在表1中分别列举了实施例1-实施例14的种子培养基和发酵培养基的配方。
表1
其中，上述实施例中均采用本发明专利方法构建得到的地衣芽孢杆菌DW2-ΔmalR菌株；种子发酵的具体步骤为：先将地衣芽孢杆菌活化，即从甘油管以体积百分比1%接种于装有5mL LB培养基中，180～300r/min、温度37℃，培养10～14小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1%接种量接种于种子发酵的培养基（实施例1-14中的种子发酵的培养基均为液体培养基，若需要种子发酵培养基为固体培养基时，仅需在原有的种子发酵的培养基（即液体培养基）的配方的基础上加琼脂 15 ~ 18 g/L即可）后于180～300r/min、37℃中培养10～12小时，得到种子培养的菌液；生产发酵的具体步骤为：向500mL三角瓶中装入25～150mL的生产发酵的培养基，然后将种子培养的菌液以接种量为2%（体积百分比），转速180～300r/min，温度37℃，发酵培养48小时，得到生产发酵的菌液。上述种子发酵的具体步骤和生产发酵的具体步骤均为现有技术。
本发明人采用高效液相色谱(HPLC)方法对上述实施例中生产发酵的菌液中杆菌肽的产量进行测定。测定条件具体为：使用Agilent 1200液相色谱仪检测；色谱柱为Hypersil BDS C18(5μm,4.6 mm×250 mm) ；流动相为A:B＝35:65(A相：100 mL pH6.0磷酸盐缓冲液到300 mL水中混合均匀；B相：520 mL甲醇与40 mL乙腈混合均匀)；流速：1.0mL/min；柱温30°C；紫外检测器波长：254 nm；进样量20μL。根据杆菌肽标准品制作的标准曲线计算出生产发酵的菌液中杆菌肽的产量（见表2）。
表2
从表2可看出，在相同的种子发酵和生产发酵的条件下，相对于现有技术的地衣芽孢杆菌DW2来说，采用本发明的地衣芽孢杆菌DW2ΔmalR的生产发酵的菌液中杆菌肽效价有了大幅提升（提高23%以上），说明：本发明的技术方案在提高地衣芽孢杆菌杆菌肽产量方面具有重大应用价值。
序列表
<110> 绿康生化股份有限公司
<120> 一种敲除malR的地衣芽胞杆菌菌株及构建方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 771
<212> DNA
<213> 地衣芽胞杆菌DW2(Bacillus licheniformis)
<400> 1
atgcagttgg aagaattaat gaacaagcat tataaaaaat tgaacgaaaa cgactttcat 60
gttttgaaat atattttgaa ccatcaagac acttgctaca agctgggcat caacgaatta 120
gcaaagaaat gcaacgtatc ccgcacatcg attttaaggc tttctcaaaa attggatttc 180
agcgggtaca gcgagttcag ggtgtttctg aaatgggagg ccgagaaacg ggaagaagag 240
cgggaagatt gccgttcctt tgaatgcctc atgagggata tggaagcaag catgaagtat 300
ttgaaaaata cggatttgcg caagatgtgt cagctcattg acgaagcaga ccgcattttt 360
gtctatggtt caggtaccgc tcagaccacg tgcgcttatg agctgcagcg aatgtttgtt 420
tctcagcacc gttatttgac ggtgatcaaa gatcaaatcg atttcgacct catgtttcct 480
gattttagcc cggccgatct gatcatcatc atttcgctgt caggagaaac cccgtcgctg 540
attccgcagg cacagtctct gtcggcaaaa ggcattcctt ttatctcttt gactaatttg 600
aaaaataatc tgctcgccca gctcacgcct tacaatctct atgcgccgag ccagacggtg 660
acggtttatc caaaaacgga gctgacagct tttgcgccct tttttctcgt tggggaagcg 720
ctgtttcgca gctatgtcga ctatgctgaa gaaaagaaaa atcaggaata a 771

Claims (5)

1.一种敲除malR的地衣芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出malR基因的上游同源臂和malR基因的下游同源臂；
（2）通过重叠延伸PCR将malR基因的上游同源臂和malR基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段；
（3）采用XbaI和BamHI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；
（4）准备质粒 T2(2)-ori，并采用XbaI和BamHI限制性内切酶对质粒 T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；
（5）将步骤（3）得到的酶切基因片段和步骤（4）得到的线性质粒片段经DNA 连接酶进行连接，得到敲除质粒T2(2)-ΔmalR；
（6）将敲除质粒T2(2)-ΔmalR转入地衣芽孢杆菌DW2中，以卡那青霉素作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；
（7）将阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到malR基因的上游同源臂或malR基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
（8）挑选malR基因的上游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与malR基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除了malR基因的地衣芽孢杆菌DW2ΔmalR；
其中，所述的地衣芽孢杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344；
所述地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA序列中的malR基因为SEQUENCE LISTING中所示。
2.根据权利要求1所述的一种敲除malR的地衣芽孢杆菌的构建方法构建得到的地衣芽孢杆菌DW2ΔmalR。
3.根据权利要求2所述的一种敲除malR的地衣芽孢杆菌菌株在杆菌肽生产中的应用，其特征在于，该应用步骤包括：A种子发酵，B生产发酵。
4.根据权利要求3所述的一种敲除malR的地衣芽孢杆菌菌株在杆菌肽生产中的应用，其特征在于，所述种子发酵的培养基配方为：6-10g/L蛋白胨，2-6g/L酵母浸出粉，6-10g/L氯化钠，pH 7.0 ~ 7.2。
5.根据权利要求3所述的一种敲除malR的地衣芽孢杆菌菌株在杆菌肽生产中的应用，其特征在于，所述生产发酵的培养基配方为：60-100g/L豆粕；15-40g/L玉米淀粉；4-8 g/LCaCO3和0.5-2 g/L (NH4)2SO4。
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