CN106755222A - 一种地衣芽胞杆菌高产杆菌肽的发酵培养基配方及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物工程领域，公开了一种地衣芽胞杆菌高产杆菌肽的发酵培养基配方及其应用，通过采用富含半胱氨酸，价格低廉的菜籽粕来替代部分豆粕作为发酵原料，显著提高了杆菌肽发酵产量，杆菌肽效价达到849.3U/mL，比原始培养基提高了12.4%，同时对豆粕和菜籽粕的市场价格进行调研，豆粕的价格在3200元/吨左右小范围波动，菜籽粕的平均价格在2800元/吨左右小范围波动，发酵原料的替换显著的降低了发酵成本，提高了地衣芽胞杆菌发酵杆菌肽的效益。

Description

一种地衣芽胞杆菌高产杆菌肽的发酵培养基配方及其应用

技术领域

本发明涉及微生物工程领域，特别是一种地衣芽胞杆菌高产杆菌肽的发酵培养基配方及其应用。

背景技术

杆菌肽是由10种氨基酸、12个氨基酸残基构成的多肽类抗生素，淡黄色或类白色粉末，无嗅，味苦。杆菌肽含有A、B1、B2、B3、D1、D2、D3和E等多种组分，其中，组分A的活性最高，含量也最为丰富。杆菌肽可有效抑制革兰氏阳性病原菌和部分革兰氏阴性菌。与此同时，杆菌肽具有在肠道内几乎不吸收，排泄迅速，体内不残留等优点，因此被广泛添加于饲料中。

目前，杆菌肽通过微生物发酵法生产，其主要生产菌株为地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)和枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。培养基的成分在微生物发酵生产过程中具有重要影响，尤其是对于次级代谢产物的生产。氮源是构成菌体物质和一些代谢产物的必需营养元素，氮源过多，会使菌体生长过于旺盛，易导致pH值偏高，溶氧不足，不利于代谢产物的积累；氮源不足，则影响菌体生长繁殖，易引起菌体衰老、自溶等，从而影响发酵产量。地衣芽胞杆菌发酵主要是以饼粕为氮源，饼粕中含有氨基酸、维生素、无机盐等营养成分，被作为工业发酵过程中常用的有机氮源。杆菌肽的原始培养基是以10%的豆粕为有机氮源，然而在培养基成分中，氮源除影响菌体生长和产物合成外，还决定了工业生产中的发酵成本。有机氮源能够为菌体生长提供氮元素及必需的生长因子，选择合适的有机氮源对提高杆菌肽产量以及降低原料成本具有重大意义。此外，菌种选育也是一种提高杆菌肽产量的有效策略。除了传统的诱变育种外，基因工程手段也被越来越多的应用于菌种选育。有专利报道利用基因工程手段构建了一株携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌工程菌株，提高了细胞内半胱氨酸的含量，进而提高了杆菌肽产量，这说明细胞中半胱氨酸比例的提高可以提高杆菌肽的产量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种地衣芽胞杆菌高产杆菌肽的发酵培养基配方及其应用，采用富含半胱氨酸，价格低廉的菜籽粕来替代部分豆粕作为发酵原料，优化了地衣芽胞杆菌的发酵培养基配方，杆菌肽效价达到849.3 U/mL，比原始培养基提高了12.4%，同时降低了发酵成本，提高了地衣芽胞杆菌发酵杆菌肽的效益。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明公开了一种地衣芽胞杆菌高产杆菌肽的培养基配方，培养基包括了种子培养基和生产发酵培养基，种子培养基为100g/L豆粕；2.5～7.5g/L玉米淀粉；0.5～2.5 g/L CaCO₃；0.1～1.0g/L (NH₄)₂SO₄，生产发酵培养基为100g/L豆粕、15～25g/L玉米淀粉、4～8g/L CaCO3和0.5～2g/L (NH₄)₂SO₄。

优选的，种子培养基中100g/L豆粕替换为70g/L豆粕和20g/L菜籽饼，生产发酵培养基中100g/L豆粕替换为70g/L豆粕和20g/L菜籽饼。

本发明还公开了一种地衣芽胞杆菌高产杆菌肽的培养基配方的应用，采用上述的培养基配方，应用步骤如下：

种子培养：先将地衣芽胞杆菌活化，即从甘油管以体积百分比1%接种于装有5mL LB培养基的PA瓶中，180～300rpm，温度37℃，培养10～14小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1%接种量接种与种子培养基后于180～300r/min，37℃中培养10～12小时；

杆菌肽发酵：500mL三角瓶装生产发酵培养基的液量为25～150mL，然后将种子培养的菌液以体积百分比2%接种量，180～300r/min，温度37℃，发酵培养48小时。

本发明具有以下有益效果：

本发明通过发酵培养基优化，通过采用富含半胱氨酸，价格低廉的菜籽粕来替代部分豆粕作为发酵原料，显著提高了杆菌肽发酵产量，杆菌肽效价达到849.3 U/mL，比原始培养基提高了12.4%，同时对豆粕和菜籽粕的市场价格进行调研，豆粕的价格在3200元/吨左右小范围波动，菜籽粕的平均价格在2800元/吨左右小范围波动，发酵原料的替换显著的降低了发酵成本，提高了地衣芽胞杆菌发酵杆菌肽的效益。

附图说明

图1为本发明实施例3单一氮源分析结果示意图。

图2为本发明实施例4一种原料复配结果示意图。

图3为本发明实施例4多种原料复配结果示意图。

图4为本发明实施例5中50L发酵罐验证复合氮源结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例1

本发明公开了一种地衣芽胞杆菌高产杆菌肽的培养基配方及应用，培养基包括了种子培养基和生产发酵培养基：

种子培养基为100g/L豆粕或70g/L豆粕和20g/L菜籽饼；2.5～7.5g/L玉米淀粉；0.5～2.5g/L CaCO₃；0.1～1.0g/L (NH₄)₂SO₄。

生产发酵培养基为100g/L豆粕或70g/L豆粕和20g/L菜籽饼、15～25g/L玉米淀粉、4～8g/L CaCO₃和0.5～2g/L (NH₄)₂SO₄。

地衣芽胞杆菌培养杆菌肽步骤如下：

种子培养：先将地衣芽胞杆菌活化，即从甘油管以体积百分比1%接种于装有5mL LB培养基的PA瓶中，180～300rpm，温度37℃，培养10～14小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1%接种量接种与种子培养基后于180～300r/min，37℃中培养10～12小时；

杆菌肽发酵：500mL三角瓶装生产发酵培养基的液量为25～150mL，然后将种子培养的菌液以体积百分比2%接种量，180～300r/min，温度37℃，发酵培养48小时。

实施例2

实验目的及方法：为了验证本发明中不同种子培养基和生产发酵培养基搭配使用对杆菌肽发酵产量的影响，本实施例以实施例1中所述的培养基配方及实施方法进行实验验证，具体实验组别如下：

表1 不同种子培养基和生产发酵培养基搭配使用对杆菌肽效价影响结果

实验结果：

通过上述不同种子培养基和生产发酵培养基搭配使用培养可以发现，在相同的培养情况下，采用菜籽饼代替部分豆粕进行培养基改机可以有效提高杆菌肽效价。

实施例3

实验目的及方法：为了研究单一氮源对地衣芽胞杆菌发酵培养的影响，本实施例在发酵培养基中除氮源外其他成分不变的基础上，分别添加100g/L的豆粕、花生饼粉、黄豆饼粉、低蛋白菜籽饼、高蛋白菜籽饼、棉籽饼、芝麻饼、鱼粉作为单一氮源，比较它们对杆菌肽发酵的影响。其中低蛋白菜籽饼、高蛋白菜籽饼来自中国农业科学院油料作物研究所，豆粕、花生饼粉、黄豆饼粉、棉籽饼、芝麻饼和鱼粉购自湖北省国营三湖农场饲料厂。考虑到氮源种类不同，发酵周期可能会有差异，因此在发酵39、42、46、48、50小时，分别用高效液相色谱测定杆菌肽产量。

实验结果：

如图1所示，实验结果表明杆菌肽发酵的最佳唯一氮源为豆粕，且发酵48小时，杆菌肽产量达到最高值。

实施例4

实验目的及方法：为了研究复合氮源对地衣芽胞杆菌发酵培养的影响，本实施例以豆粕与一种原料复配、豆粕与多种原料复配进行研究，其中豆粕与一种原料复配的实验方法如下：

10%和9%豆粕分别添加1%其它原料（包括花生饼粉、黄豆饼粉、低蛋白菜籽饼、高蛋白菜籽饼、棉籽饼、芝麻饼、鱼粉）作为复合氮源，10%豆粕单一氮源的设为对照，比较它们对杆菌肽发酵的影响。用高效液相色谱测定杆菌肽产量。

豆粕与多种原料复配的实验方法如下：

采用9%豆粕和8%豆粕分别添加1%低蛋白菜籽饼（或高蛋白菜籽饼）和1%鱼粉（或芝麻饼），未添加的设为对照，比较他们对杆菌肽发酵的影响。用高效液相色谱测定杆菌肽产量。

实验结果：

如图2所示，发酵结果表明：与10%豆粕相比，豆粕与菜籽饼复配效果最好。9%豆粕分别与1%低蛋白菜籽饼、1%高蛋白菜籽饼、1%鱼粉和1%芝麻饼复配后，效价增加了8.4%、5.2%、1.6%和0.6%。其中菜籽饼1指低蛋白菜籽饼，菜籽饼2指高蛋白菜籽饼。

如图3所示，发酵结果表明：与9%的豆粕相比，8%豆粕中同时添加1%低蛋白菜籽饼和1%鱼粉效果最好，效价提升22.4%，其次是8%豆粕中同时添加1%高蛋白菜籽粕和1%芝麻饼，效价提升14.2%。

前面实验表明豆粕、低蛋白菜籽饼和鱼粉复配后可以提高杆菌肽产量，为了进一步优化三者的比例，设计了豆粕、低蛋白菜籽饼和鱼粉的三因素三水平（参见表2）的正交试验（参见表3），进一步优化氮源配比，并对正交试验进行方差分析（参见表4），发现豆粕对杆菌肽效价影响极显著，低蛋白菜籽饼对杆菌肽效价影响显著，鱼粉对杆菌肽效价影响不显著。并通过考察豆粕与低蛋白菜籽饼的比例分别为8:1、7:2和6:3时杆菌肽的产量，从而确定杆菌肽发酵的最佳复合氮源为：豆粕7%+低蛋白菜籽饼2%。

表2 主要因素的正交实验设计

表3 正交试验结果

表4 正交试验的方差分析

因素	偏差平方和	自由度	F比	显著性
					豆粕	12233.9	2	139.6	**
低蛋白菜籽饼	4061.9	2	46.4	*
					鱼粉	150.1	2	1.7
空列	87.6	2	1.0
					误差	87.6	2

注：F_0.05(2,2)＝19.0，F_0.01(2,2)＝99.0

实施例5

实验目的及方法：本实施例以50L发酵罐验证复合氮源的效果，实施方法为以复合氮源豆粕7%+低蛋白菜籽饼2%为优化组，以原始氮源豆粕10%为对照组，在50 L发酵罐中对优化组的效果进行验证，对照组和优化组除氮源外，其他条件完全相同。

实验结果：

如图4所示，对照组与优化组效价分别为755.3U/mL和849.3U/mL，与对照组相比，发酵结束时杆菌产量增加了12.4%。

实施例6

实验目的及方法：本实施例进行菜籽粕的氨基酸组成分析，实施方法如下：分别称取豆粕和低蛋白菜籽饼各0.1 g于10 mL水解管中，每种原料设三个平行，加6 mol/L盐酸5 mL，密封好后放入100℃水浴锅中水解24 h,水解结束后定容并调节水解液的PH至中性。衍生化后进行GC-FID检测。

实验结果：

表5 豆粕和菜籽饼中氨基酸的组成

分析结果发现，菜籽粕中半胱氨酸的比例远高于豆粕。同时我们对豆粕和菜籽粕的市场价格进行调研，豆粕的价格在3200元/吨左右小范围波动，菜籽粕的平均价格在2800元/吨左右小范围波动。

以上实施例表明本发明通过发酵培养基优化，通过采用富含半胱氨酸，价格低廉的菜籽粕来替代部分豆粕作为发酵原料，显著提高了杆菌肽发酵产量，杆菌肽效价达到849.3 U/mL，比原始培养基提高了12.4%，同时降低了发酵成本，显著提高了地衣芽胞杆菌发酵杆菌肽的效益。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种地衣芽胞杆菌高产杆菌肽的发酵培养基配方，其特征在于，所述的培养基包括了种子培养基和生产发酵培养基，所述的种子培养基为100g/L豆粕；2.5～7.5g/L玉米淀粉；0.5～2.5 g/L CaCO₃；0.1～1.0g/L (NH4)₂SO₄，所述的生产发酵培养基为100g/L豆粕、15～25g/L玉米淀粉、4～8g/L CaCO₃和0.5～2g/L (NH4)₂SO₄。

2.如权利要求1所述的一种地衣芽胞杆菌高产杆菌肽的发酵培养基配方，其特征在于：所述的种子培养基中100g/L豆粕替换为70g/L豆粕和20g/L菜籽饼，所述的生产发酵培养基中100g/L豆粕替换为70g/L豆粕和20g/L菜籽饼。

3.一种地衣芽胞杆菌高产杆菌肽的发酵培养基配方的应用，其特征在于：采用权利要求1-2任一项所述的培养基配方，应用步骤如下：

种子培养：先将地衣芽胞杆菌活化，即从甘油管以体积百分比1%接种于装有5mL LB培养基的PA瓶中，180～300rpm，温度37℃，培养10～14小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1%接种量接种与种子培养基后于180～300r/min，37℃中培养10～12小时；

杆菌肽发酵：500mL三角瓶装生产发酵培养基的液量为25～150mL，然后将种子培养的菌液以体积百分比2%接种量，180～300r/min，温度37℃，发酵培养48小时。