CN103013977A

CN103013977A - 一种离子束诱变杀真菌素链霉菌选育恩拉霉素菌株的方法

Info

Publication number: CN103013977A
Application number: CN2012105336611A
Authority: CN
Inventors: 李荣杰; 尚海涛; 郑辉; 杨金环
Original assignee: Anhui BBCA Fermentation Technology Engineering Research Co Ltd
Current assignee: Anhui BBCA Fermentation Technology Engineering Research Co Ltd
Priority date: 2012-12-12
Filing date: 2012-12-12
Publication date: 2013-04-03

Abstract

本发明提供了一种离子束诱变杀真菌素链霉菌选育恩拉霉素菌株的方法，包括如下步骤：(1)在室温下，将杀真菌素链霉菌斜面孢子制成的孢子悬液均匀涂布于无菌平皿上；(2)用氮离子束对孢子悬液进行脉冲注入；(3)把经步骤(2)处理后的孢子悬液稀释后，涂布于固体培养基中培养；(4)选取生长良好的单菌株接种于液体发酵培养基中培养，选取遗传性状稳定的高产菌株，即得恩拉霉素菌株。本发明的优点在于采用离子束诱变设备简单、方法易行、操作安全，其诱变效果远较传统的物理化学诱变方法好，用此方法诱变得到的杀真菌素链霉菌，同原始菌株相比，发酵单位提高20～40％。

Description

一种离子束诱变杀真菌素链霉菌选育恩拉霉素菌株的方法

技术领域

本发明涉及微生物诱变技术领域，具体地说，涉及一种离子束诱变杀真菌素链霉菌选育恩拉霉素菌株的方法。

背景技术

恩拉霉素(Enramycin)，又名恩来霉素、恩霉素、持久霉素，是一种环状多肽类抗生素，由13个不同种类的17个氨基酸分子和脂肪酸分子组成，氨基酸组成环状多肽，脂肪酸分子连在末端的天冬氨酸上，根据末端脂肪酸分子的不同分为恩拉霉素A和恩拉霉素B，恩拉霉素是这两种组分的混合物。该药于1966年由日本武田药品工业株式会社研发，1974年在日本正式注册，其后在许多国家被注册和广泛使用。1993年，我国农业部批准该药在我国注册。恩拉霉素能改变肠道内的细菌群落分布，有利于饲料营养成分的消化吸收，促进动物增重和提高饲料利用率。

恩拉霉素是目前饲料添加剂中广泛使用的抗生素之一，具有广谱、无残留、不产生耐药性等优点。作为肽类抗生素，即使在胃液的低pH条件下恩拉霉素也表现出很高的稳定性，能抑制革兰氏阳性菌的活性，而且具有抑制梭状芽孢杆菌和杆菌类菌属形成芽孢的能力。

由于恩拉霉素独特的优点，使其具有良好的社会效益和环境效益，成为新型抗生素的重要来源，具有广阔的市场前景。

恩拉霉素是由土壤中分离出来的杀真菌素链霉菌Streptomycesfungicidious发酵产生的，但生产水平较低，以往的筛选仅局限于从环境中筛选野生型菌株，不但工作量大、效率低，结果也不理想。而采用离子束注入进行微生物诱变育种具有对生物体生理损伤小、突变谱广、突变频率高，并有一定的重复性和方向性的新特点。而把离子束注入在生产恩拉霉素菌株的选育，还未有相关专利和文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种离子束诱变杀真菌素链霉菌选育恩拉霉素高产菌株的方法。

本发明另一目的是提供一种通过上述方法获得的恩拉霉素菌株。

为了实现本发明目的，本发明提供了一种离子束诱变杀真菌素链霉菌选育恩拉霉素菌株的方法，其包括如下步骤：

(1)在室温下，将杀真菌素链霉菌斜面孢子制成的孢子悬液均匀涂布于无菌平皿上；

(2)用氮离子束对孢子悬液进行脉冲注入；

(3)把经步骤(2)处理后的孢子悬液稀释后，涂布于固体培养基中培养；

(4)选取生长良好的单菌株接种于液体发酵培养基中培养，选取遗传性状稳定的高产菌株，即得恩拉霉素菌株。

所述恩拉霉素菌株链霉素Streptomyces sp.FYFJ06已于2012年11月09号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101)保藏，保藏号为CGMCC No.6797。

其中，步骤(1)所述孢子悬液浓度优选为10⁵～10⁷个孢子/mL。

步骤(2)中所述氮离子束能量优选为10～30Kev，剂量优选为1.5×10¹⁴～6×10¹⁴ions/cm²。

步骤(3)中所述固体培养基的成分为：麦芽糖0.5～1.0w/v％，酵母粉0.05～0.1w/v％，胰蛋白胨0.05～0.1w/v％，磷酸二氢钾0.01～0.2w/v％，氯化钠0.1～0.5w/v％，琼脂粉1.8～2.0w/v％，其余为水。培养基的pH值优选为6.8～7.0，培养条件优选为28℃培养7～10天。

步骤(4)中所述生长良好的单菌株为菌落直径大、产孢子量大的单菌株。

步骤(4)中所述液体发酵培养基的成分为：葡萄糖2.0～5.0w/v％、玉米淀粉1.0～3.0w/v％、玉米蛋白粉2.0～5.0w/v％、棉籽饼粉0.5～2.5w/v％、尿素0.1～0.5w/v％、磷酸二氢钾0.01～0.2w/v％、氯化钠0.1～0.5w/v％和碳酸钙0.5～1.5w/v％，其余为水。培养基的pH值优选为6.5～7.0，发酵条件优选为28℃，200～220rpm摇床培养144～168h。

所述杀真菌素链霉菌为菌株FYFJ03，其保藏号为CGMCCNo.4113。(该菌株的保藏证明及其保藏号已经在专利申请号为201010528367.2专利上公开)

本发明的技术方案具体步骤如下：在室温下，取斜面孢子制成10⁵～10⁷个孢子/mL孢子悬液，均匀涂布于无菌平皿上，在无菌状态下吹干，采用能量为10～30Kev氮离子束，剂量为1.5×10¹⁴～～6×10¹⁴ions/cm²的条件下进行脉冲注入，然后用无菌水洗下诱变处理过的孢子，稀释至10³～10⁵倍后涂布于固体培养基中，28℃培养7～10天，选取生长良好的单菌株接种于液体发酵培养基中，于28℃，200～220rpm摇床培养144～168h，获得遗传性状稳定的高产菌株，发酵单位提高20～40％。所述杀真菌素链霉菌为菌株FYFJ03，保藏号CGMCC No.4113。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：采用离子束诱变设备简单、方法易行、操作安全，其诱变效果远较传统的物理化学诱变方法好，在微生物菌种选育中有较大的推广价值。本发明通过氮离子束脉冲注入进行诱变，得到高产恩拉霉素的杀真菌素链霉菌突变株，突变株正突变率5％～30％。发酵单位同原始菌株相比提高20～40％。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中培养基配方中的各组分均为市售商品。

实施例1

在室温25℃下，取菌株FYFJ03接种于液体发酵培养基中，于28℃，200～220rpm摇床培养160h，检测发酵液中恩拉霉素产量，发酵单位为910U/mL。

实施例2

在室温25℃下，取菌株FYFJ03的斜面孢子制成10⁵～10⁷个孢子/mL孢子悬液，均匀涂布于无菌平皿上，在无菌状态下吹干，采用能量为10Kev氮离子束，剂量为1.5×10¹⁴ions/cm²的条件下进行脉冲注入，然后用无菌水洗下诱变处理过的孢子，稀释至10⁵倍后涂布于固体培养基中，28℃培养9天，选取生长良好的单菌株接种于液体发酵培养基中，于28℃，200～220rpm摇床培养144h，检测发酵液中恩拉霉素产量，挑选高产恩拉霉素的遗传性状稳定的杀真菌素链霉菌突变株。突变株正突变率19％。平均发酵单位为1146.6U/mL，同原始菌株相比平均提高26％。

实施例3

在室温25℃下，取菌株FYFJ03的斜面孢子制成10⁵～10⁷个孢子/mL孢子悬液，均匀涂布于无菌平皿上，在无菌状态下吹干，采用能量为10Kev氮离子束，剂量为3×10¹⁴ions/cm²的条件下进行脉冲注入，然后用无菌水洗下诱变处理过的孢子，稀释至10⁵倍后涂布于固体培养基中，28℃培养10天，选取生长良好的单菌株接种于液体发酵培养基中，于28℃，200～220rpm摇床培养156h，检测发酵液中恩拉霉素产量，挑选高产恩拉霉素的遗传性状稳定的杀真菌素链霉菌突变株。突变株正突变率15％。平均发酵单位为1192.1U/mL，同原始菌株相比平均提高31％。

实施例4

在室温25℃下，取菌株FYFJ03的斜面孢子制成10⁵～10⁷个孢子/mL孢子悬液，均匀涂布于无菌平皿上，在无菌状态下吹干，采用能量为10Kev氮离子束，剂量为6×10¹⁴ions/cm²的条件下进行脉冲注入，然后用无菌水洗下诱变处理过的孢子，稀释至10⁵倍后涂布于固体培养基中，28℃培养10天，选取生长良好的单菌株接种于液体发酵培养基中，于28℃，200～220rpm摇床培养160h，检测发酵液中恩拉霉素产量，挑选高产恩拉霉素的遗传性状稳定的杀真菌素链霉菌突变株。突变株正突变率11％。平均发酵单位为1274U/mL，同原始菌株相比平均提高40％。该菌株FYFJ06已于2012年11月09号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101)保藏，保藏号为CGMCC No.6797。

实施例5

在室温25℃下，取菌株FYFJ03的斜面孢子制成10⁵～10⁷个孢子/mL孢子悬液，均匀涂布于无菌平皿上，在无菌状态下吹干，采用能量为20Kev氮离子束，剂量为1.5×10¹⁴ions/cm²的条件下进行脉冲注入，然后用无菌水洗下诱变处理过的孢子，稀释至10⁵倍后涂布于固体培养基中，28℃培养9天，选取生长良好的单菌株接种于液体发酵培养基中，于28℃，200～220rpm摇床培养144h，检测发酵液中恩拉霉素产量，挑选高产恩拉霉素的遗传性状稳定的杀真菌素链霉菌突变株。突变株正突变率30％。平均发酵单位为1119.3U/mL，同原始菌株相比平均提高23％。

实施例6

在室温25℃下，取菌株FYFJ03的斜面孢子制成10⁵～10⁷个孢子/mL孢子悬液，均匀涂布于无菌平皿上，在无菌状态下吹干，采用能量为20Kev氮离子束，剂量为3×10¹⁴ions/cm²的条件下进行脉冲注入，然后用无菌水洗下诱变处理过的孢子，稀释至10⁵倍后涂布于固体培养基中，28℃培养10天，选取生长良好的单菌株接种于液体发酵培养基中，于28℃，200～220rpm摇床培养165h，检测发酵液中恩拉霉素产量，挑选高产恩拉霉素的遗传性状稳定的杀真菌素链霉菌突变株。突变株正突变率12％。平均发酵单位为1092U/mL，同原始菌株相比平均提高20％。

实施例7

在室温25℃下，取菌株FYFJ03的斜面孢子制成10⁵～10⁷个孢子/mL孢子悬液，均匀涂布于无菌平皿上，在无菌状态下吹干，采用能量为30Kev氮离子束，剂量为1.5×10¹⁴ions/cm²的条件下进行脉冲注入，然后用无菌水洗下诱变处理过的孢子，稀释至10⁵倍后涂布于固体培养基中，28℃培养10天，选取生长良好的单菌株接种于液体发酵培养基中，于28℃，200～220rpm摇床培养168h，检测发酵液中恩拉霉素产量，挑选高产恩拉霉素的遗传性状稳定的杀真菌素链霉菌突变株。突变株正突变率12％。平均发酵单位为1128.4U/mL，同原始菌株相比平均提高24％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种离子束诱变杀真菌素链霉菌选育恩拉霉素菌株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)用氮离子束对孢子悬液进行脉冲注入；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述孢子悬液浓度为10⁵～10⁷个孢子/mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述氮离子束能量为10～30Kev，剂量为1.5×10¹⁴～6×10¹⁴ions/cm²。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述氮离子束能量为10Kev，剂量为3×10¹⁴ions/cm²。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述固体培养基的成分为：麦芽糖0.5～1.0w/v％，酵母粉0.05～0.1w/v％，胰蛋白胨0.05～0.1w/v％，磷酸二氢钾0.01～0.2w/v％，氯化钠0.1～0.5w/v％，琼脂粉1.8～2.0w/v％，其余为水。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述生长良好的单菌株为菌落直径大、产孢子量大的单菌株。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述液体发酵培养基的成分为：葡萄糖2.0～5.0w/v％、玉米淀粉1.0～3.0w/v％、玉米蛋白粉2.0～5.0w/v％、棉籽饼粉0.5～2.5w/v％、尿素0.1～0.5w/v％、磷酸二氢钾0.01～0.2w/v％、氯化钠0.1～0.5w/v％和碳酸钙0.5～1.5w/v％，其余为水。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杀真菌素链霉菌为菌株FYFJ03，其保藏号为CGMCC No.4113。

9.权利要求1～8任意一项所述方法所获得的恩拉霉素菌株。

10.根据权利要求9所述的恩拉霉素菌株，其保藏号为CGMCCNo.6797。