CN102268389B - 一种甲基营养芽孢杆菌及其发酵生产γ-聚谷氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一种甲基营养芽孢杆菌及其发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，属于食品生物技术领域。本发明人等从土壤中筛选出一株能生产γ-聚谷氨酸的芽孢杆菌，经中国典型培养物保藏中心鉴定为甲基营养芽孢杆菌（Bacillusmethylotrophicus），保藏编号为CCTCCNO：M2011201。以此菌株为发酵菌株，在含有碳源、氮源、MgSO4、K2HPO4和MnSO4的培养基中培养，得到发酵液，将发酵液通过有机溶剂沉淀，透析，干燥得到γ-聚谷氨酸产品，产量可达17g/L以上。本发明方法得到的新菌株甲基营养芽孢杆菌可不依赖谷氨酸发酵，工艺简单，费用低，产量高，可用于大规模生产，生产的γ-聚谷氨酸无毒，可以直接应用于食品工业、化妆品工业、环境工程、医药工程以及农业等领域。
Description
技术领域
本发明涉及非谷氨酸依赖型γ-聚谷氨酸产生菌甲基营养芽孢杆菌，能够不依赖谷氨酸发酵生产γ－聚谷氨酸的一种新微生物菌株，及其培养发酵生产γ－聚谷氨酸的方法，属于食品生物技术领域。
背景技术
γ－聚谷氨酸（Poly γ-Glutamate，γ-PGA）是一种多聚氨基酸类的环保型多功能生物可降解高分子材料。γ－聚谷氨酸(γ-PGA)主要由D－谷氨酸和L－谷氨酸通过γ－酰胺键聚合而成，γ-PGA中大量的游离羧基提供了阳离子结合的基团，使其对金属离子有良好的吸附性。羧基也是容易发生酯化、交联等反应的活性基团，利用这一性质可以使γ-PGA与交联剂发生交联反应生成性能优良的吸水树脂；如果使羟基与某些药物成分的基团发生反应，γ-PGA可成为药物载体或缓释剂；除了这些性质，作为一种高分子聚合物，γ－聚谷氨酸还具有一些独特的物理、化学和生物学特性如良好的水溶性，超强的吸附性，能彻底被生物降解，无毒无害，可食用等，可作为诸如保水剂、增稠剂、絮凝剂、重金属吸附剂、药物／肥料缓释剂及药物载体等的原料，在农业、食品、医药、化妆品、环保、合成纤维和涂膜等领域具有广泛的应用前景。
γ－聚谷氨酸最初由炭疽芽孢杆菌中发现，在高CO2浓度的诱导下，炭疽芽孢杆菌可产生γ-D-聚谷氨酸，产生的γ-D-聚谷氨酸附着在细胞壁上并在微生物细胞外面形成荚膜，炭疽芽孢菌株的毒性限制了其在工业上的应用。由于枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的易培育性和安全性，现在γ－聚谷氨酸的生产大多报道由此类菌株产生。γ－聚谷氨酸一般以游离形式直接分泌到培养基中，可静态发酵也可动态发酵，可称为游离型γ－聚谷氨酸。γ－聚谷氨酸可作为细胞外营养物存储，可促进细胞膜的形成，在非常时期为微生物提供生存所需，可防止噬菌体的侵袭，并在高盐环境下对金属离子进行包裹从而对细胞具有保护作用。
根据细胞生长的营养要求是否需要谷氨酸，可以把γ-PGA产生菌分为两大类：一种为谷氨酸依赖型，如Bacillus licheniformis ATCC9945, B.subtilis IFO3335 等，另一种为非谷氨酸依赖型。对于谷氨酸依赖型菌株，培养基中加入的谷氨酸通过细胞膜的运输成为合成的主要底物，而对于非谷氨酸依赖型菌株，合成底物谷氨酸的产生主要依靠培养基中碳源如甘油、葡萄糖、柠檬酸的转化得到。国内外对于谷氨酸依赖型菌株的研究工作做得较多，而对于非谷氨酸依赖型菌株产γ－聚谷氨酸的报道较少。从节约成本角度来讲，筛选一株不依赖谷氨酸发酵的优良菌株，对工业化大规模生产至关重要。基于上述发现提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够在不含谷氨酸的培养基中发酵生产γ－聚谷氨酸的新的微生物，以及利用该微生物发酵生产γ－聚谷氨酸的方法。
本发明的技术方案：为了实现上述目的，本发明提供一种来源于土壤的甲基营养芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）SK 19.001，其为能够产生γ－聚谷氨酸的菌株。该菌株已保藏于中国 武汉 武汉大学 中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2011201。
本发明所述不依赖谷氨酸发酵生产γ-聚谷氨酸的菌株甲基营养芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）SK 19.001，最初来源于农田土壤样本，样本经液体培养基富集培养和稀释涂布后，进行摇瓶发酵培养，最后对发酵液的γ-聚谷氨酸进行定性定量分析，最终得到生产γ-聚谷氨酸的菌株，并进行菌株的分离与鉴定。
甲基营养芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）SK 19.001具有以下性质：
1．形态特征
在蛋白胨葡萄糖琼脂培养基上营养细胞为(0.5～0.9)×(1.5～3.0)μm大小的杆菌，当培养基潮湿时，菌落表面光滑湿润，不透明，圆形，边缘整齐，当培养基干燥时，菌落粗糙皱褶，边缘不规则。
2. 生理生化特征见表1和表2
表1甲基营养芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）SK 19.001
生理生化特性——碳源利用
| 检测项目 （碳源同化） | 结果 | 检测项目（碳源同化） | 结果 |
| 鼠李糖 | + | 甘露醇 | + |
| N-乙酰葡萄糖胺 | + | D-葡萄糖 | + |
| D-核糖 | + | 水杨素 | + |
| 肌醇 | + | D-蜜二糖 | + |
| 蔗糖 | + | L-岩藻糖 | - |
| 麦芽糖 | + | D-山梨醇 | + |
| 衣康酸 | - | L-阿拉伯糖 | + |
| 辛二酸盐 | - | 丙酸盐 | - |
| 丙二酸盐 | - | 癸酸盐 | - |
| 乙酸盐 | - | 戊酸盐 | - |
| DL-乳酸盐 | + | 柠檬酸盐 | + |
| L-丙氨酸 | + | 组氨酸 | + |
| 5-酮基-葡萄糖酸盐 | - | 2-酮葡萄糖酸盐 | - |
| 糖原 | + | 3- 羟基-丁酸盐 | - |
| 3-羟基-苯甲酸盐 | - | 4-羟基-苯甲酸盐 | - |
| L-丝氨酸 | - | L-脯氨酸 | + |
| 甘露糖 | + | 已二酸 | W |
| 苹果酸 | + | 苯乙酸 | W |
+：阳性反应； -：阴性反应； W：弱阳性反应
表2 甲基营养芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）SK 19.001
生理生化特性——酶活
| 检测项目 | 结 果 | 检测项目 | 结 果 |
| 革兰氏染色 | + | 硝酸盐还原到亚硝酸盐 | + |
| 细胞形状 | 杆状 | 吲哚反应 | - |
| 芽孢 | + | 酸化葡萄糖 | + |
| 10% NaCl 生长 | - | 精氨酸水解酶 | - |
| 50℃ 生长 | - | 脲酶 | - |
| 厌氧生长 | - | 水解七叶灵(β-葡萄糖甙酶) | + |
| 接触酶 | + | 水解明胶(蛋白酶) | + |
| 氧化酶 | + | β-半乳糖甙酶 | - |
+：阳性反应； -：阴性反应
利用该类菌株生产γ-聚谷氨酸的方法为：对γ-聚谷氨酸产生菌甲基营养芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）SK 19.001进行斜面、种子、发酵三级培养：
斜面培养 (g／L)：蛋白胨5～8，牛肉膏5～8，氯化钠2～3，琼脂20～25，用蒸馏水定容，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20 min，培养条件为：培养温度35～37℃，培养时间12～14小时；
种子培养 (g／L)：葡萄糖15～20，酵母膏20～15， MgSO4·7H2O 0.4～0.6，K2HPO40.5～1.5，用蒸馏水定容，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20 min，培养条件为：250 ml三角瓶装液30ml，摇瓶转速200 rpm, 培养温度35～37℃，培养时间8～12小时；
发酵培养基(g／L)：碳源10～100，氮源10～60， MgSO4·7H2O 0.4～1，K2HPO4 0.5～1.5，MnSO4：0.5～1.5mM，用蒸馏水定容，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20 min，接种量为1%～10％，培养条件为：250mL三角瓶装液30mL，搅拌转速200 rpm, 培养温度35～40℃，培养时间12～24小时。
将制得的发酵液经离心去除菌体，制得发酵液上清液，加入2～4倍体积的无水乙醇、甲醇或丙酮等有机溶剂沉淀聚谷氨酸，轻微搅拌后4℃静置过夜，将聚谷氨酸沉淀以少量上述有机溶剂洗涤，用少量去离子水溶解，经透析除去盐、糖等小分子，最后冷冻干燥，得到γ-聚谷氨酸。
γ-聚谷氨酸的定性分析通过水解液薄层层析法（TLC）分析：将纯化后的γ-聚谷氨酸以6M HCl，100℃水解过夜，水解液以6M NaOH中和后以谷氨酸为对照用薄层层析法分析其成分。
γ-聚谷氨酸的定量分析通过高效液相色谱法（HPLC）分析：将发酵液离心去除菌体后，取一定量以6M HCl，100℃水解过夜，分别用HPLC测定水解液和发酵液中游离谷氨酸的含量，两者之差即为γ-聚谷氨酸的产量。
本发明中使用的碳源可以是葡萄糖、甘油、蔗糖、麦芽糖、甘露糖，柠檬酸或谷氨酸，以甘油和葡萄糖较为合适；氮源可以是有机氮源蛋白胨、酵母膏或玉米浆，或是无机氮源NH4Cl或(NH4)2SO4，上述氮源可以单独使用，也可混合使用。
本发明得到的γ-聚谷氨酸具有以下理化性质：
（1）本产品溶于水，不溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂；
（2）本产品茚三酮反应呈阴性，用6M HCl水解后茚三酮反应呈阳性；
（3）6M HCl水解后用HPLC和薄层层析法分析，发现水解物中生成单一的氨基酸谷氨酸。证明本产品为谷氨酸的高分子聚合物。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
（1）本发明得到的甲基营养芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）SK 19.001微生物菌株为一株产γ-聚谷氨酸的新菌株，在此之前未有报道。
（2）本发明得到的甲基营养芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）SK 19.001微生物菌株为一株非谷氨酸依赖型的产γ-聚谷氨酸的菌株，在此之前鲜有报道。
（3）本发明得到的甲基营养芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）SK 19.001微生物菌株培养条件粗放，可以利用多种不同的碳源和氮源进行培养。
（4）培养液色泽浅，有利于后期的产物分离纯化。
生物材料样品保藏：一种来源于土壤的甲基营养芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）SK 19.001，其为能够发酵产生γ－聚谷氨酸的菌株。该菌株已保藏于中国 武汉 武汉大学 中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2011201，保藏日期2011年6月17日。
具体实施方式
以下是甲基营养芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）SK 19.001进行发酵生产γ-聚谷氨酸的实施例，但本发明并不限于所列出的几个实例。
实施例1 产γ-聚谷氨酸菌的分离
将无菌采集的农田土壤，取少许加入到无菌去离子水中，搅拌，取适量接种到含有葡萄糖1.5%～2.0%，酵母膏2.0%～1.5%， MgSO4·7H2O 0.04%～0.06%，K2HPO4 0.05%～0.15%，pH 7.0～7.2的培养基中，在37℃，200rpm的条件下培养12~14h，经稀释涂布后，37℃培养12~14h，选定菌落粘稠有滴液的菌株作为实验菌株，即CCTCC NO：M 2011201。
实施例2 γ-聚谷氨酸的发酵培养
将芽孢杆菌SK19.001在下述条件下进行发酵：
斜面培养 (g／L)：蛋白胨5～8，牛肉膏5～8，氯化钠2～3，琼脂20～25，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20 min，培养条件为：培养温度35～37℃，培养时间12～14小时；
种子培养 (g／L)：葡萄糖15～20，酵母膏20～15， MgSO4·7H2O 0.4～0.6，K2HPO4 0.5～1.5，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20 min，培养条件为：250 mL三角瓶装液30mL，摇瓶转速200 rpm，培养温度35～37℃，培养时间8～12小时；
发酵培养基(g／L)：甘油15～30，蛋白胨15～20， MgSO4·7H2O 0.4～0.6，K2HPO4 0.5～1.5，MnSO4：1mM，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20 min，接种量3%，培养条件为：250mL三角瓶装液30mL，搅拌转速200 rpm，培养温度35～37℃，培养时间12～20小时。
实施例3 γ-聚谷氨酸的分离纯化
将制得的发酵液经离心去菌体，制得发酵液上清液，加入4倍体积的4℃无水乙醇沉淀γ-聚谷氨酸，轻微搅拌后4℃静置过夜，将γ-聚谷氨酸沉淀以少量无水乙醇洗涤，用少量去离子水溶解，经透析除去盐、糖等小分子，最后冷冻干燥，即得γ-聚谷氨酸，产量可达17g/L。
Claims (2)
1.一株非谷氨酸依赖型产γ-聚谷氨酸的菌株，分类命名为甲基营养芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）SK19.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2011201。
2.用权利要求1所述甲基营养芽孢杆菌SK19.001发酵产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于出发菌株为甲基营养芽孢杆菌SK19.001，即CCTCC NO：M 2011201；利用该菌株生产γ-聚谷氨酸的方法为：对γ-聚谷氨酸产生菌甲基营养芽孢杆菌SK 19.001进行斜面、种子、发酵三级培养：
斜面培养：培养基以g／L计：蛋白胨5～8，牛肉膏5～8，氯化钠2～3，琼脂20～25，用蒸馏水定容，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20 min，培养条件为：培养温度35～37℃，培养时间12～14小时；
种子培养：培养基以g／L计：葡萄糖15～20，酵母膏20～15， MgSO4·7H2O 0.4～0.6，K2HPO4 0.5～1.5，用蒸馏水定容，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20 min，培养条件为：250 mL三角瓶装液30mL，摇瓶转速200 rpm, 培养温度35～37℃，培养时间8～12小时；
发酵培养：培养基以g／L计：碳源10～100，氮源10～60， MgSO4·7H2O 0.4～1，K2HPO4 0.5～1.5，MnSO4：0.5～1.5mM，用蒸馏水定容，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20 min，接种量为1%～10%，培养条件为：250mL三角瓶装液30mL，搅拌转速200 rpm，培养温度35～40℃，培养时间12～24小时；
将制得的发酵液经离心去除菌体，制得发酵液上清液，加入2～4倍体积的无水乙醇、甲醇或丙酮沉淀聚谷氨酸，轻微搅拌后4℃静置过夜，将聚谷氨酸沉淀以少量有机溶剂无水乙醇、甲醇或丙酮洗涤，用少量去离子水溶解，经透析除去盐、糖小分子，最后冷冻干燥，得到γ-聚谷氨酸；
发酵培养基中碳源选用葡萄糖、甘油、蔗糖、麦芽糖、甘露糖，柠檬酸或谷氨酸；
发酵培养基中氮源选用有机氮源蛋白胨、酵母膏或玉米浆，或选用无机氮源NH4Cl或(NH4)2SO4；上述氮源单独使用，或混合使用。
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Granted publication date: 20130102 Termination date: 20150707 |
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| EXPY | Termination of patent right or utility model |