CN110093298A - 酯香微杆菌mcda02及其产几丁质脱乙酰酶的方法 - Google Patents

酯香微杆菌mcda02及其产几丁质脱乙酰酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明是一种酯香微杆菌(Microbacterium esteraromaticum)MCDA02，其保藏号为CGMCC NO.16933。酯香微杆菌MCDA02为革兰氏阴性无芽孢短杆菌，在LB固体培养上培养48h后菌落呈圆形，边缘齐整，中心稍突起，亮黄色，不透明，表面光滑湿润，易挑取。本发明还公开了利用菌株MCDA02产几丁质脱乙酰酶的方法。本发明的酯香微杆菌MCDA02是一种新的可以产的几丁质脱乙酰酶的海洋细菌，所产几丁质脱乙酰酶的最适温度为30℃，温度较低，在工业应用中可以节约能量，降低成本。

Description

酯香微杆菌MCDA02及其产几丁质脱乙酰酶的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株分离自中国连云港连云区高公岛码头泥样的酯香微杆菌MCDA02；该菌株已经于2018年12月12号保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC NO.16933；本发明还涉及该菌株产几丁质脱乙酰酶的方法。
背景技术
几丁质又名甲壳素、甲壳质，存在于无脊椎动物的外骨骼、表皮以及真菌和藻类的细胞壁中，是在自然界中仅次于纤维素的天然再生多糖(魏丽蓉等，2018)。几丁质不溶于水、弱酸和弱碱和有机溶剂，难以开发利用。几丁质脱乙酰基得到壳聚糖，溶解性好、有良好的生物相容性、生物可降解性、抗菌性、吸附性、降低胆固醇等，广泛应用于食品、医药、轻工、印染、环保和农业等领域(Monikaet.al，2019)。
目前，壳聚糖制备有化学法和生物酶法。化学法使用大量浓碱处理几丁质，产品质量不稳定、均一性差，而且生产过程中造成了巨大环境污染(秦汪艳等，2017)。几丁质脱乙酰酶可以催化几丁质脱乙酰基，反应条件温和，产物脱乙酰程度一致，而且环境友好。此外，将几丁质脱乙酰酶与几丁质酶联用，可以生产出具有特定乙酰化位置或者分子质量分布范围较窄的壳聚糖(王皓等，2015)。
几丁质脱乙酰酶是生物酶法制备壳聚糖的关键酶。自日本研究者1974年首次报道了Mucor rouxii几丁质脱乙酰酶后，研究者从真菌、细菌和昆虫中分离获得了几丁质脱乙酰酶。微生物酶在工业应用中优势显著。目前报道的产几丁质脱乙酰酶微生物菌株大多数为真菌，鲜有细菌报道，在发酵产酶中，细菌更容易实现规模化发酵，酶更容易分离(Suryawanshiet.al,2019)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的可以产几丁质脱乙酰酶的源于海洋的酯香微杆菌(Microbacterium esteraromaticum)MCDA02。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供了前述酯香微杆菌MCDA02产的几丁质脱乙酰酶的方法，所产几丁质脱乙酰酶作用温度相对较低，发酵水平较高，在工业应用中具有节省能源，降低成本的优势。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种酯香微杆菌(Microbacterium esteraromaticum)MCDA02，其特点是：其保藏号为CGMCCNO.16933。
本发明涉及的菌株MCDA02是在中国连云港连云区高公岛码头的泥样中分离得到，该菌株已经与2018年12月12号保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.16933。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。联系电话为010-64806086。
本发明菌株MCDA02的形态特征与生理生化特征如下：
1.1形态特征：
该菌株为革兰氏阴性短杆菌，无芽孢。该菌株在LB固体培养上培养48h后：黄色，不透明，表面光滑湿润，圆形，边缘齐整，中心稍突起，易挑取。在含有胶体几丁质和对硝基-N-乙酰苯胺的筛选培养基上能够产生黄色变色圈。
1.2生理生化特征：
该菌株吲哚试验、硫化氢产生、VP试验、硝酸盐还原试验均呈阴性，氧化酶、接触酶试验均为阳性。部分生理生化结果见表1。
表1 MCDA02菌株的生理生化试验结果
注：+：阳性；-：阴性；
1.3菌株MCDA02 16S rDNA序列的扩增和分析
用Axygen试剂盒提取得到MCDA02的基因组，选用扩增原核微生物16SrDNA序列的通用引物于PCR mix体系中反应。
所述用于PCR反应的通用引物：27F：5’–AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。所述反应体系为：PCR mix(21μL)，上下游引物(各1μL)，DNA模板(2μL)。反应程序：94℃变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸90S，32个循环；72℃终延伸10min。将PCR产物送至南京思普金公司测序，所得序列1395bp。将该序列与GenBank数据库中的序列进行同源性比对，与菌株Microbacterium profundi(登录号：KU204866.1)16S rDNA相似性达100％。用MEGA7.0软件进行16S rDNA序列的比对分析，并构建系统发育树，菌株MCDA02与Microbacterium profundi亲缘关系最近。
本发明还公开了一种酯香微杆菌(Microbacterium esteraromaticum)MCDA02产几丁质脱乙酰酶的方法，其特点是，其步骤如下：将酯香微杆菌(Microbacteriumesteraromaticum)MCDA02接种到种子培养基中，180rpm，30℃培养24h，得到种子液；将种子液以1％的接种量接种于发酵培养基中，180rpm，30℃培养72h，12000×g离心2min，上清液即为几丁质脱乙酰酶粗酶液；所述种子培养基为：酵母粉0.1％，蛋白胨0.5％，陈海水配制，pH7.0；发酵培养基：蛋白胨1％，木薯淀粉1％，ZnSO4 0.05％，陈海水配制，pH7.0。
与现有技术相比，本发明的酯香微杆菌MCDA02是一种新的可以产的几丁质脱乙酰酶的来自海洋的细菌，该酯香微杆菌MCDA02菌在发酵产酶中，很容易实现规模化发酵，所产的酶更容易分离。本发明方法所产几丁质脱乙酰酶的最适温度为30℃，温度较低，在工业应用中可以节约能量，降低成本。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行进一步的描述：
实施例1，一种酯香微杆菌(Microbacterium esteraromaticum)MCDA02，其保藏号为CGMCC NO.16933。菌株为革兰氏阴性无芽孢短杆菌，在LB固体培养上培养48h后菌落呈圆形，边缘齐整，中心稍突起，亮黄色，不透明，表面光滑湿润，易挑取。
所述的酯香微杆菌(Microbacterium esteraromaticum)MCDA02产几丁质脱乙酰酶的方法，其步骤如下：将酯香微杆菌(Microbacterium esteraromaticum)MCDA02接种到种子培养基中，180rpm，30℃培养24h，得到种子液；将种子液以1％的接种量接种于发酵培养基中，180rpm，30℃培养72h，12000×g离心2min，上清液即为几丁质脱乙酰酶粗酶液；所述种子培养基为：酵母粉0.1％，蛋白胨0.5％，陈海水配制，pH7.0；发酵培养基：蛋白胨1％，木薯淀粉1％，ZnSO40.05％，陈海水配制，pH7.0。
发明人对菌株MCDA02发酵生产几丁质脱乙酰酶的方法进行了研究实验：
2.1本发明涉及的培养基
LB培养基：蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，琼脂2％，陈海水配置，pH7.0。
筛选培养基：粉末几丁质0.2％，K2HPO40.07％，KH2PO40.03％，MgSO40.05％，对硝基-N-乙酰苯胺0.02％，陈海水配置，pH7.0。
种子培养基：酵母粉0.1％，蛋白胨0.5％，陈海水配置，pH7.0。
发酵培养基：蛋白胨1％，，木薯淀粉1.1％，ZnSO40.05％，陈海水配制，pH7.9。
2.2种子液的制备：将菌株MCDA02的LB平板单菌落接种到种子培养基中30℃，180r/min，装液量20％，培养24h。
2.3碳源对菌株MCDA02产酶的影响
将种子液以1％接种量接种至发酵培养基，培养基初始pH7.0、30℃、180r/min、装液量20％，培养基中分别添加了不同碳源，发酵72h后取样测定酶活力，研究碳源对菌株MCDA02产酶的影响，结果表明添加木薯淀粉时产酶最高。
2.4氮源对菌株MCDA02产酶的影响
将种子液以1％接种量接种至发酵培养基，培养基初始pH7.0、30℃、180r/min、装液量20％，培养基中分别添加了不同氮源，发酵72h后取样测定酶活力，研究氮源对菌株MCDA02产酶的影响，结果表明，添加蛋白胨时产酶最高。
2.5无机盐对菌株MCDA02产酶的影响
将种子液以1％接种量接种至发酵培养基，培养基初始pH7.0、30℃、180r/min、装液量20％，分别添加不同无机盐，发酵72h取样测定酶活力，研究无机盐对菌株MCDA02产酶的影响，结果表明添加ZnSO4时产酶最高。
2.3发酵时间对菌株MCDA02产酶的影响
将种子液以1％接种量接种至发酵培养基，培养基初始pH7.0、30℃、180r/min、装液量20％，发酵96h，每隔12h取样测酶活力，结果表明72h产酶最高。
2.4发酵温度对菌株MCDA02产酶的影响
将种子液以1％接种量接种至发酵培养基，培养基初始pH7.0、30℃、180r/min、装液量20％，在不同温度下培养72h，结果显示30℃时酶产量达到最高。
2.5培养基起始pH对菌株MCDA02产酶的影响
将种子液以1％接种量接种至发酵培养基，30℃、180r/min、装液量20％，调节发酵培养基不同初始pH，培养72h后测定酶活力，结果表明，随着初始pH的升高酶产量逐渐增加，当pH达到8.0时产酶量达到最大，低于pH7.0或大于9.0时酶产量显著降低。
2.6装液量对菌株MCDA02产酶的影响
将种子液以1％接种量接种至不同装液量发酵培养基，30℃、180r/min，培养72h后测定酶活力，结果表明，250mL三角瓶中装液量在20％时产酶最高。
2.7响应面法优化发酵条件
根据单因素实验结果，以酶活为响应值，以ZnSO4、木薯淀粉及发酵初始pH为因变量，运用Design of Experiments进行三因素三水平响应面实验设计，共计17个试验点的Box-Behnken响应面分析试验(表2)。对试验数据进行回归分析，得二次多项式方程：
Y＝-52.244+8.9515*A+279.125*B+10.807*C-30.5*A*B-0.64*A*C-21*B*C-1.107*A2-817.5*B2-0.577C2。
表2 Box-Behnken试验设计及结果
表3 几丁质脱乙酰酶酶活的回归方差分析表
注：-为不显著，*为显著，**为极显著
由表3可知：从F值的大小可以得到，一次项中各因素对几丁质脱乙酰酶酶活的影响顺序是C>A>B，交互相对酶活影响的主次顺序为AC>AB>BC。对几丁质脱乙酰酶酶活的方差分析可得模型P<0.01，表明该方程模型极显著，不同处理间的差异性极显著；失拟项P>0.05，表明模型失拟项不显著；模型的R2为0.9512，说明该模型能解释95.12％响应值的变化，因而该模型拟合程度良好，试验误差小，可以用于预测最优发酵条件参数。
结果表明，最佳发酵条件为：木薯淀粉1.09％、ZnSO40.05％、pH7.86，预期酶活2.0U/mL。结合实际，我们将发酵条件调整为木薯淀粉1.1％、ZnSO40.05％、pH7.9。经过后期验证测得酶活2.012U/mL。与预期基本符合。比优化之前提高了一倍。
2.8几丁质脱乙酰酶活性测定方法
试管中加入30℃预保温的0.05mol/L pH7.0磷酸缓冲液3mL，200mg/L的对硝基乙酰苯胺水溶液1mL，酶液1mL，于30℃水浴反应15min，沸水浴终止酶促反应，3000r/min离心10min，测定上清液的吸光度。以添加1mL同样浓度沸水浴灭活15min的酶液作为对照。酶活单位(U)定义：在上述反应条件下每小时产生1μg对硝基苯胺所需要的酶量定义为一个酶活力单位。
温度和pH对菌株MCDA02几丁质脱乙酰酶活性和稳定性的影响实验如下：
3.1粗酶液的制备
将菌株MCDA02的LB斜面种子接种到种子培养基中，30℃，180r/min，装液量20％，培养24h，得到种子液。以1％接种量将种子液接种至装液量为20％的发酵培养基，30℃、180rpm摇床培养72h，12000×g离心2min，取上清即为几丁质脱乙酰酶粗酶液。
3.2温度对菌株MCDA02几丁质脱乙酰酶活性的影响
在pH7.0，0.05mmol/L磷酸缓冲液中于不同温度下测定纯化几丁质脱乙酰酶活力，确定酶的最适合作用温度，酶的最适合作用温度是30℃，在25℃和45℃仍保持80％以上相对酶活。
3.3温度对菌株MCDA02几丁质脱乙酰酶稳定性的影响
让几丁质脱乙酰酶在pH7.0，0.05mol/L磷酸缓冲液中分别于不同温度下保温10h，每隔2h测定残余酶活力，确定酶温度稳定性，酶在30℃时最稳定。
3.4pH对菌株MCDA02几丁质脱乙酰酶活性的影响
配制不同pH的0.05mol/L缓冲液，柠檬酸钠缓冲液(pH5.0-pH6.0)，柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0-pH8.0),甘氨酸缓冲液(pH8.0-pH9.0)。在30℃于不同pH的缓冲液下以对硝基乙酰苯胺为底物测定酶的活力，酶的最适pH为8.0，在pH7.0-pH9.0具有80％以上酶活性。
3.5pH对菌株MCDA02几丁质脱乙酰酶稳定性的影响
将酶在不同pH的缓冲液中分别于30℃恒温水浴锅保温2h、20h，测定残余酶活力，在pH为8.0时，酶的稳定性最好，酶在pH7.0-pH9.0具有85％以上相对酶活，在酸性条件下，酶活性显著降低。
3.6金属离子对菌株MCDA02几丁质脱乙酰酶活性的影响
在酶活测定体系中分别添加ZnSO4、KCl、NaCl等金属离子溶液，使终浓度分别为1mmol/L和2mmol/L，测定几丁质脱乙酰酶酶活力。结果显示，Sr2+、Na+等对几丁质脱乙酰酶活性有促进作用，Sr2+浓度为2mmol/L对酶活促进作用最强，Co2+、Ba2+、EDTA等对几丁质脱乙酰酶活性有抑制作用。

Claims (2)

1.一种酯香微杆菌(Microbacterium esteraromaticum)MCDA02，其特征在于：其保藏号为CGMCC NO.16933。
2.一种利用权利要求1所述的酯香微杆菌(Microbacterium esteraromaticum)MCDA02产几丁质脱乙酰酶的方法，其特征在于，其步骤如下：将酯香微杆菌(Microbacteriumesteraromaticum)MCDA02接种到种子培养基中，180rpm，30℃培养24h，得到种子液；将种子液以1％的接种量接种于发酵培养基中，180rpm，30℃培养72h，12000×g离心2min，上清液即为几丁质脱乙酰酶粗酶液；所述种子培养基为：酵母粉0.1％，蛋白胨0.5％，陈海水配制，pH7.0；发酵培养基：蛋白胨1％，木薯淀粉1％，ZnSO4 0.05％，陈海水配制，pH7.0。
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