CN107012107A - 一株硝基还原假单胞菌及其发酵产物和用途 - Google Patents

一株硝基还原假单胞菌及其发酵产物和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及纤维素降解领域，公开了一株硝基还原假单胞菌及其发酵产物和用途。本发明的硝基还原假单胞菌的保藏编号为CGMCC No.13412。还公开了培养所述硝基还原假单胞菌的方法，包括：将所述硝基还原假单胞菌接种至发酵培养基中进行发酵。还公开了一种降解纤维素的方法，包括：将降解剂与含纤维素的原料接触，所述降解剂为所述硝基还原假单胞菌和/或所述硝基还原假单胞菌的发酵产物。此外，本发明公开了所述硝基还原假单胞菌和/或硝基还原假单胞菌的发酵产物在降解纤维素中的用途。本发明的硝基还原假单胞菌能够高效降解纤维素，其发酵产物同时具有多种酶活，且酶活性较高。

Description

一株硝基还原假单胞菌及其发酵产物和用途
技术领域
本发明涉及纤维素降解领域，具体地，涉及一株硝基还原假单胞菌(Pseudomonasnitroreducens)及其发酵产物和在降解纤维素中用途。
背景技术
我国是农业大国，各类农作物秸秆资源十分丰富，但当秸秆直接还田后在土壤中分解转化的周期长，难以作为当季作物的肥源。同时，每年约有30％的剩余作物秸秆不能有效得到处理和利用，在收割季节秸秆被集中焚烧的现象日益突出，污染空气并危害人们的身体健康。使用传统的物化方法，如酸处理、碱处理以及蒸汽加热等方法处理秸秆等纤维素，存在反应条件剧烈、设备昂贵、成本较高、带来新的环境污染等问题。而利用投加纤维素高效降解菌的方法经济、有效，正逐渐成为当前的研究热点。
目前获得的产纤维素酶微生物的纤维素内切酶活和滤纸酶活均较低，例如，张淑红从青藏高原筛选一株低温产纤维素酶的假单胞菌LHG-C9，内切酶活为3.02U/ml(张淑红,刘秀花,梁峰,等.低温纤维素降解菌的筛选及其酶学性质初步研究)；赵方圆等人的研究表明：纤维素降解菌Aspergillus sp.YN1内切酶活及总酶活可达到0.553U/ml和0.15U/ml(见赵方圆和范宁杰等,纤维素降解菌Aspergillus sp.YN1的产酶条件及酶学特性[J].微生物学通报,2010,37(8):1194-1199)；黄宁珍等研究的纤维素降解真菌34内切酶和总酶活能达到325.67U/L和144.14U/L(见黄宁珍和付传明等,纤维素降解真菌分离筛选、产酶特性及高效水解菌系的初步构建[J].西南农业学报,2010,23(5):1489-1496)。
发明内容
本发明的目的是提供一株能够高效降解纤维素的硝基还原假单胞菌及其发酵产物和用途。
为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种硝基还原假单胞菌，该硝基还原假单胞菌的保藏编号为CGMCC No.13412。
第二方面，本发明提供了培养第一方面所述的硝基还原假单胞菌的方法，包括：将所述硝基还原假单胞菌接种至发酵培养基中进行发酵。
第三方面，本发明提供了根据第二方面所述的方法得到的发酵产物。
第四方面，本发明提供了一种降解纤维素的方法，包括：将降解剂与含纤维素的原料接触，所述降解剂为第一方面所述的硝基还原假单胞菌和/或第一方面所述的硝基还原假单胞菌的发酵产物。
第五方面，本发明提供了第一方面所述的硝基还原假单胞菌和/或第一方面所述的硝基还原假单胞菌的发酵产物在降解纤维素中的用途。
本发明的硝基还原假单胞菌能够高效降解纤维素，其发酵产物同时具有纤维素内切酶、纤维素外切酶、β-葡萄糖苷酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶酶活，且酶活性较高。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物保藏
本发明的硝基还原假单胞菌，于2016年12月2日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.13412。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是液体培养本发明的硝基还原假单胞菌时纤维素内切酶活随培养时间的变化曲线图；
图2是液体培养本发明的硝基还原假单胞菌时总酶活随培养时间的变化曲线图；
图3是固体培养本发明的硝基还原假单胞菌时纤维素内切酶活随培养时间的变化曲线图；
图4是固体培养本发明的硝基还原假单胞菌时总酶活随培养时间的变化曲线图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“酶活力”的大小即酶含量的多少，用酶活力单位表示，即酶单位(U)，本发明中酶单位的定义是：对于纤维素内切酶活和滤纸酶活，采用DNS法测定，以每分钟催化纤维素水解产生1μg的葡萄糖所需要的酶量为1个酶活力单位，即1U＝1μg/min，对于木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶，采用紫外分光光度法测定，用每分钟吸光度值增加0.1的酶量来表示1个酶活力单位。“酶的比活力”代表每单位体积样品的催化能力，能够反应酶活大小，其值越大，表明酶活越高，比活力的计算公式为：比活力(U/mL)＝总酶活力单位数/mL样品，本发明中，“酶活”与“酶活力”可互换使用。“滤纸酶活”亦称总酶活，指纤维素内切酶、纤维素外切酶和β-葡萄糖苷酶的总酶活。
本发明提供的硝基还原假单胞菌的保藏编号为CGMCC No.13412。该菌株生长快速，产纤维素酶能力强，降解秸秆效果明显，可应用于大田秸秆助腐，对大田耕种启到很好的促进作用，有助于提高土壤肥力，增强农作物所需营养物质，促进植物生长，具有广阔的应用前景。
本发明提供的培养上述硝基还原假单胞菌的方法包括：将所述硝基还原假单胞菌接种至发酵培养基中进行发酵。
通常地，相对于每升的发酵培养基，所述硝基还原假单胞菌的接种量为20-30mg(以干重计)。
本发明中，所述发酵培养基可以为各种常规的能够为硝基还原假单胞菌提供营养物质的培养基，可以为LB培养基，也可以为含羧甲基纤维素钠的培养基，例如，每升的发酵培养基可以含有羧甲基纤维素钠(CMC-Na，或淀粉)12-15g，NaCl 4-5g，KH2PO4 0.5-1g，MgSO4·7H2O 0.2-0.5g，蛋白胨(或牛肉膏)12-15g，酵母粉4-5g。一般地，如果进行固体培养，每升的发酵培养基还可以含有琼脂18-20g。
对发酵的条件没有特别的要求，为了获得酶活力更优的发酵清液，优选地，所述发酵的条件包括：温度为28-35℃，时间为2-4天，pH值为6-8。
本发明中，所述方法还可以包括在发酵前对硝基还原假单胞菌依次进行活化和种子培养，活化是为了将保藏状态的菌种放入适宜的培养基中培养，使其恢复发酵性能；种子培养是为了得到较多的纯而壮的培养物，即获得活力旺盛、接种数量足够的硝基还原假单胞菌。可以采用本领域常规的方法进行活化和种子培养，例如，所述活化可以包括将硝基还原假单胞菌的菌丝体接种至LB平板上，28-32℃下培养3-5天。所述种子培养可以包括将活化后的硝基还原假单胞菌接种至种子培养基(液体)中，28-32℃培养2-3天。LB平板和种子培养基均为本领域技术人员所熟知，在此不再赘述。
本发明还提供了根据上述方法得到的发酵产物。所述发酵产物可以指分离菌体(5000-8000rpm条件下离心10-15min)后获得的发酵清液(上清液)。本发明获得的发酵产物具有较强的纤维素降解活性，可以应用于降解植物性废料(如大豆杆、玉米秸秆、麸皮、棉籽壳、花生壳、玉米芯等)。
本发明提供的降解纤维素的方法包括：将降解剂与含纤维素的原料接触，所述降解剂为如上所述的硝基还原假单胞菌和/或其发酵产物。所述发酵产物优选为如上所述的发酵产物，在此不再详述。
根据本发明，所述降解剂为硝基还原假单胞菌时，相对于每克的以纤维素计的含纤维素的原料，所述降解剂的用量优选为2-3mg。优选地，所述接触的条件包括：温度为28-35℃，时间为2-10天。
根据本发明，所述发酵产物为发酵清液与菌体的混合物或者发酵清液。
所述降解剂为发酵清液时，相对于每克的以纤维素计的含纤维素的原料，所述降解剂以蛋白计的用量可以为0.4-0.5mg。优选地，所述接触的条件包括：温度为28-30℃，时间为3-4天。
所述降解剂为发酵清液与菌体的混合物时，相对于每克的以纤维素计的含纤维素的原料，所述降解剂以硝基还原假单胞菌计的用量可以为2-3mg。优选地，所述接触的条件包括：温度为28-35℃，时间为2-10天。
根据本发明的降解纤维素的方法，所述发酵产物优选为如上所述的发酵产物。
根据本发明，所述含纤维素的原料可以为各种常见的植物性废料(如秸秆、种子壳、木质废料、纸屑、棉屑、玉米芯和甘蔗渣等)。
根据本发明，为了促进纤维素的降解，所述接触还可以在无机盐的存在下进行，例如磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铵和酵母粉等中的至少一种。相对于每克的含纤维素的原料(以干重计)，磷酸氢二钾的用量可以为4-6mg，磷酸二氢钾的用量可以为4-6mg，七水硫酸镁的用量可以为0.5-1.5mg，硫酸铵的用量可以为5-10mg，酵母粉的用量可以为3-40mg。
本发明还提供了如上所述的硝基还原假单胞菌和/或其发酵产物在降解纤维素中的用途。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实施例1
(1)将菌株GM(即保藏编号为CGMCC No.13412的硝基还原假单胞菌)接种至GU-PDA平板(葡萄糖：20g，马铃薯浸粉3g，磷酸二氢钾：3g，硫酸镁：1.5g，琼脂：15g，愈创木酚：1g)，于30℃在恒温培养箱中培养7d，菌落周围出现红棕色变色圈，分别测得菌落直径(D)为7mm和变色圈的直径(H)为13mm，比值(H/D)为1.86，说明本发明的菌株具有较好的木质素酶活。
(2)将菌株GM(以干重计，接种量为25mg/L)于恒温(30℃)振荡器(170rpm)中培养4d，使用的培养基(1L)组成为：CMC-Na 10g，KH2PO44g，MgSO4·7H2O 0.3g，蛋白胨3g，酵母粉0.5g，(NH4)2SO4 2g，CaCl2·2H2O 0.3g，吐温-80 0.2g，pH为6.5-7；将得到的培养物在6000rpm条件下离心15min，取上清液(即发酵清液)为粗酶液。通过DNS法(参照文献纤维素降解菌Aspergillus sp.YN1的产酶条件及酶学特性,微生物学通报,2010,37(8):1194-1199)对粗酶液进行纤维素内切酶活和滤纸酶活测定。通过紫外分光光度计(参照文献高效木质素降解菌株的分离筛选,浙江大学学报(农业与生命科学版),2011,37(3):259-262)测量粗酶液的木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶的酶活。结果显示，纤维素内切酶活力和滤纸酶活力分别达到78.61U/ml，13.74U/ml；木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶的酶活力分别为0.087U/ml、0.12U/ml和0.035U/ml。
实施例2
(1)按照实施例1步骤(2)培养菌株GM，不同的是，每隔24h采样测定纤维素内切酶活和总酶活(也即滤纸酶活)，并制作以时间为横坐标，以酶活为坐标的酶活性曲线。得出其酶活与培养时间的关系，结果分别如图1和图2所示，可以看出，在液体培养条件下，两种酶活均在第3天达最大值，分别为82.35U/ml和11.87U/ml。
(2)将菌株GM(以干重计，接种量为25mg/L)于恒温(30℃)下进行培养，使用的培养基组成为：小麦秸秆(2mm左右，取自河北保定)50g，磷酸二氢钾1g，七水硫酸镁0.025g，硫酸铵1g，去离子水100ml。每隔24h按照实施例1步骤(2)的方法采样测定纤维素内切酶活和滤纸酶活，并制作以时间为横坐标，以酶活为坐标的酶活性曲线。得出其酶活与培养时间的关系，结果分别如图3和图4所示，可以看出，在固体培养条件下，两种酶活在第5天达最大值，分别为1187.26U/ml和208.43U/ml。
实施例3
将50ml锥形瓶和研磨好的小麦秸秆(2mm左右，取自河北保定)高温烘干后称重，精确到0.1mg，记为W1(锥形瓶)和W2(小麦秸秆)。小麦秸秆称取1g，含0.5重量％酵母粉的无机盐溶液(含5mg磷酸氢二钾、5mg磷酸二氢钾、1mg七水硫酸镁和5mg硫酸铵)7.5g，放入50ml锥形瓶中在121℃下灭菌15min。加入菌株GM接种液1ml(以硝基还原假单胞菌计的用量为2.5mg)，放入恒温培养箱，在30℃下培养10d。菌株作一个平行对照组，结果取平均值。在121℃下灭菌15min，烘干称重，记为W3(锥形瓶和培养物的总重)。按照“降解率＝(W1+W2-W3)/W2×100％”计算菌株降解秸秆的降解率，结果为37.2％。
从以上结果可以看出，本发明的硝基还原假单胞菌的发酵产物同时具有纤维素内切酶、纤维素外切酶、β-葡萄糖苷酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶酶活，且活性较高，将其用于降解秸秆时能够获得较高的降解率。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一株硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)，该硝基还原假单胞菌的保藏编号为CGMCC No.13412。
2.一种培养权利要求1所述的硝基还原假单胞菌的方法，其特征在于，该方法包括：将所述硝基还原假单胞菌接种至发酵培养基中进行发酵。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，每升的发酵培养基中含有羧甲基纤维素钠12-15g，NaCl 4-5g，KH2PO4 0.5-1g，MgSO4·7H2O 0.2-0.5g，蛋白胨12-15g，酵母粉4-5g。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述发酵的条件包括：温度为28-35℃，时间为2-4天，pH值为6-8。
5.根据权利要求2-4中任意一项所述的方法得到的发酵产物。
6.一种降解纤维素的方法，其特征在于，该方法包括：将降解剂与含纤维素的原料接触，所述降解剂为权利要求1所述的硝基还原假单胞菌和/或权利要求1所述的硝基还原假单胞菌的发酵产物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述降解剂为硝基还原假单胞菌时，相对于每克的以纤维素计的含纤维素的原料，所述降解剂的用量为2-3mg；
所述接触的条件包括：温度为28-35℃，时间为2-10天。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述发酵产物为发酵清液与菌体的混合物或者发酵清液；
所述降解剂为发酵清液时，相对于每克的以纤维素计的含纤维素的原料，所述降解剂以蛋白计的用量为0.4-0.5mg，所述接触的条件包括：温度为28-30℃，时间为3-4天；
或者，所述降解剂为发酵清液与菌体的混合物时，相对于每克的以纤维素计的含纤维素的原料，所述降解剂以硝基还原假单胞菌计的用量为2-3mg；所述接触的条件包括：温度为28-35℃，时间为2-10天。
9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述发酵产物为权利要求5所述的发酵产物；
和/或，所述含纤维素的原料为秸秆、种子壳、木质废料、纸屑、棉屑、玉米芯和甘蔗渣中的至少一种。
10.权利要求1所述的硝基还原假单胞菌和/或权利要求1所述的硝基还原假单胞菌的发酵产物在降解纤维素中的用途。
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