CN105624080B - 产多糖絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法 - Google Patents

产多糖絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法 Download PDF

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Abstract

多糖絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法，属于基因工程及微生物发酵技术领域。基因工程菌是在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中过表达epsDEF基因的基因工程菌。epsDEF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No 1。基因工程菌制备：将epsDEF基因克隆到表达载体上获得重组表达载体，将重组表达载体通过电转化方法导入产胞外多糖的地衣芽孢杆菌中即得多糖絮凝剂的基因工程菌。多糖絮凝剂的制备：将基因工程菌发酵培养，收集发酵液，提纯，即得多糖絮凝剂。基因工程菌在发酵过程中发酵液絮凝活性显著提高，多糖絮凝剂产量显著提高。多糖絮凝剂在污水处理和食品工程中应用。

Description

产多糖絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法
技术领域
本发明属于基因工程及微生物发酵技术领域，具体涉及一种产多糖絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法。
背景技术
微生物絮凝剂(Microbial flocculant,MBF)是微生物分泌的能够使悬浮液中的固体颗粒、菌体、细胞和胶状物絮凝沉淀的大分子化合物,主要成分有多糖、糖蛋白、蛋白质、纤维素和DNA等。微生物絮凝剂具有安全、高效、可生物降解和对环境无污染等优势，且能产生絮凝剂的微生物种类多、生长快、易于采用工程手段而实现产业化，因此微生物絮凝剂的开发前景十分看好。在过去的20多年中，研究人员陆续从土壤、淤泥、工业废水、船舶沉积物和生物分泌物等来源中筛选得到许多能产多糖生物絮凝剂的细菌、霉菌、藻类和酵母菌(Molecules,2011,16(3):2431-2442；Bioresource Technology,2013,137:226-232.)。目前，多糖生物絮凝剂已经应用于去除纺织印染废水中的色素(Colloids and SurfacesB-Biointerfaces,2005,44(4):179-186.)，还可以去除工业废水中的重金属离子和其它悬浮污染物(Bioresource Technology,2007,98(2):361-367.)。
然而絮凝剂产量低、成本较高，制约着它的大规模工业化应用。目前，对于培养基、培养条件、生长因子等外部因素影响多糖絮凝剂合成的报道已经很多(ProcessBiochemistry,2014,49(4:576-582；Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2014,116:257-264)。选择廉价原材料、优化发酵过程或利用随机诱变进行菌种改进等方法对絮凝剂产量的提高有效但效果非常有限，而且具有一定的盲目性。要实现生物代谢产物的有效调控，必须定向施加必要的遗传变化来改进细胞的性能。
而从微生物细胞的遗传及生理学角度对多糖絮凝剂合成影响的报道甚是少见。由于多糖絮凝剂结构复杂，且大多数针对多糖的研究并不关注絮凝活性，所以有关多糖絮凝剂代谢途径的研究还较少，而通过分子生物学技术改造菌株提高多糖絮凝剂产量的报道几乎没有。因此通过基因工程技术构建高产优良菌株，进一步提高多糖絮凝剂活性及产量，具有重要的经济价值及社会意义。
本申请人在中国专利CN101503709中公开利用地衣芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法，其中，微生物地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)已于2009年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.2876。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中多糖絮凝剂絮凝活性不高，调控机理不明等问题，提供一种产多糖絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法，以及利用所述地衣芽孢杆菌基因工程菌制备产多糖絮凝剂的方法。
本发明采用的微生物为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，该微生物已于2009年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.2876(参见本申请人的在先专利CN101503709)。
所述产多糖絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌HN301-1是在产胞外多糖的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中过表达epsDEF基因的基因工程菌。
所述epsDEF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。
所述产多糖絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌的制备方法如下：
将epsDEF基因克隆到表达载体上获得重组表达载体，将所得重组表达载体通过电转化的方法导入到产胞外多糖的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中即获得多糖絮凝剂的基因工程菌Bacillus licheniformis HN301-1。
所述产多糖絮凝剂的制备方法如下：
将多糖絮凝剂的基因工程菌Bacillus licheniformis HN301-1发酵培养，收集发酵液，提纯，即得多糖絮凝剂。
所述发酵培养的温度可为30～40℃，发酵培养的时间可为48～60h；发酵培养的温度优选为35～40℃，发酵培养的时间优选为50～60h；发酵培养的温度最好为37℃，发酵培养的时间最好为56h。
所述提纯的方法可为：采用乙醇提取，离心速度为6000～8000rpm，离心时间为10～15min，离心温度为4℃；所述乙醇的用量按体积比可为发酵液的3倍。
本发明采用的表达载体为本实验室构建的表达载体PHY300PLK-PamyL-TTamyL。所述表达载体的启动子为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因的启动子。
本发明的重组表达载体的构建方法为：将所述epsDEF基因的核酸分子与表达载体PHY300PLK-PamyL-TTamyL质粒分别用限制性内切酶Kpn I和Spe I双酶切，形成互补的粘性末端，分别纯化后经T4DNA连接酶，形成本发明所述重组表达载体，将所得的重组表达载体命名为PHY300-epsDEF。将所得重组表达载体通过电转化的方法导入到产胞外多糖的地衣芽孢杆菌中获得多糖絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌HN301-1，利用所得多糖絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌HN301-1发酵制备多糖絮凝剂。
本发明所述epsDEF基因为糖基转移酶基因，所述epsDEF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。该基因的制备方法为本领域常规的制备方法，为从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CGMCC 2876的基因组中分离获得，或者从含有该SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的重组表达载体中获得，也可以全基因人工合成获得。
本发明所述将重组表达载导入地衣芽孢杆菌的方法为本领域常规的技术方法，较佳地为原生质体转化法或者电击转化法，更佳地为电击转化法。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
其中所述从发酵液中制得多糖絮凝剂的方法为本领域常规的制备方法，所述制备方法较佳地包括以下步骤：将所得发酵液离心收集上清液，将所得上清液用乙醇法沉淀，沉淀溶解于水后冷冻真空干燥即得。
本发明所述试剂和原料均市售可得。
本发明的技术效果在于：本发明提供的地衣芽孢杆菌基因工程菌在发酵过程中发酵液絮凝活性显著提高，多糖絮凝剂产量显著提高。所制得的多糖絮凝剂在污水处理和食品工程的应用方面具有广阔的前景。
附图说明
图1为过表达重组载体构建方法示意图。
图2为重组载体的PCR验证结果图。
图3为重组载体的双酶切验证结果图。
图4为过表达epsDEF基因工程菌生长曲线图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好理解本发明。然而本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅限于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：重组表达载体PHY300-epsDEF的构建
设计PCR引物，用于扩增espDEF基因片段。
上下游引物分别为：
上游引物：GGGGTACCATGACAAGAACGGTTTTGT(下划线为KpnI酶切位点)
下游引物：GGACTAGTTCACTGTCCTTCTGCCGC(下划线为SpeI酶切位点)
以Bacillus licheniformis CGMCC 2876基因组DNA为模板，进行如下PCR程序:(1)94℃,5min；(2)94℃,30s；(3)55℃,30s(4)72℃,1min，(2)～(4)步重复35个循环；(5)72℃,10min，4℃保存。
PCR反应体系如表1所示。
表1
将PCR产物和表达载体PHY300PLK-PamyL-TTamyL分别用限制性内切酶Kpn I和SpeI双酶切，回收后，将PCR产物和表达载体以(3～5)∶1的比例用T4DNA连接酶在16℃连接12h构建重组表达载体PHY300-epsDEF(如图1)。
实施例2：地衣芽孢杆菌基因工程菌HN301-1的构建
将PHY300-epsDEF过表达质粒经提取及浓缩后，电击转化地衣芽孢杆菌，37℃复苏5h后，涂布四环素抗性平板，再在37℃培养12h，筛选转化子。转化子经质粒提取后，利用PCR及双酶切进行验证(如图2和3)。从而获得过表达糖基转移酶基因epsDEF的地衣芽孢杆菌工程菌HN301-1。
电转化具体步骤如下：
地衣芽孢杆菌感受态的制备：
(1)在50mL LB培养基中接种一环B.licheniformis,37℃，200r min-1过夜培养12h；
(2)取过夜培养液1mL接入50mL生长培养基中，于37℃，200r/min培养至对数中后期，直到细胞OD600达到0.85～0.95；
(3)细胞冰浴30min，停止生长后，(取预先预冷的50mL干净离心管，加入40mL停止生长的培养液)再于4℃以6 000r/min离心收获细胞；
(4)用冰冷(0℃冰水浴)的EP缓冲液40mL悬浮细胞四次(每次都在0℃冰水浴中晃动，使沉淀悬浮，可用枪轻轻吹吸)，并最终将细胞悬浮于1mL EP缓冲液中,使细胞浓度达到1～1.3×1010CFU mL-1；
(5)将感受态细胞分装于1.5mL离心管(预冷过的)中，每管100μL，再直接进行下一步实验或-70℃保存感受态；
地衣芽孢杆菌的电转：
(1)将感受态细胞和1～5μg质粒混合物转移到冰冷的0.1cm间隙的电击池中；
(2)以1800V、5ms脉冲转化；
(3)迅速往电击池中加入1mL复苏培养基，将菌悬液回收到5mL离心管中,于37℃，200r min-1培养5h；
(4)将菌液涂布在抗性平板上，于37℃培养直到平板上出现菌落。
实施例3：利用地衣芽孢杆菌及其基因工程菌发酵制备多糖絮凝剂
将地衣芽孢杆菌CGMCC 2876出发菌株和实施例2所述基因工程菌接种于液体种子培养基中，37℃，200r min-1培养16h，制备种子培养液，以4％(V/V)的接种量接种于多糖絮凝剂发酵培养基中，37℃，200r min-1培养，进行发酵产多糖絮凝剂实验。56h后分别测定发酵液絮凝活性及多糖絮凝剂产量，并绘制生长曲线图(如图4)。epsDEF基因过表达重组基因工程菌发酵液的最终絮凝活性为5332U/mL，比原菌株发酵液最终絮凝活性2806U/mL提高90％；epsDEF基因过表达重组基因工程菌多糖絮凝剂的粗提产量为10.44g/L，较原菌株粗提产量8.17g/L提高了27.8％。
生物絮凝剂的絮凝活性可采用以下方法测定：
称取高岭土粉末0.2g与50mL刻度试管中，依次加入2.5mLCaCl2溶液(10g/L)和1mL待测液，蒸馏水加至与刻度线平齐。充分混合后，迅速置于比色皿中，静置5min后，用紫外可见分光光度计在波长550nm下测定吸光度。以蒸馏水做空白测定。计算公式如下：
絮凝活性(U/mL)＝(B-A)/B×100×D
式中，A:待测样品的OD550值，B:空白培养基的OD550值，D:发酵液稀释倍数。
生物絮凝剂的提取纯化方法：
(1)取10mL发酵液8000rpm离心5min，除菌体，收集上清液，重复操作两次。
(2)上清液中加入3倍体积的无水乙醇，4℃条件下静置12h。
(3)8000rpm离心10min，弃上清液，加10mL去离子水溶解。上清液中加入3倍体积的无水乙醇，4℃条件下静置12h后，离心弃上清液。
(4)冷冻真空干燥。
本发明所述产多糖絮凝剂的基因工程菌HN301是在产胞外多糖的地衣芽孢杆菌中过表达epsDEF基因的基因工程菌，其中所述epsDEF基因为糖基转移酶基因epsD、epsE、epsF三个串联在一起的基因簇，其核苷酸序列如序列表中所述。本发明构建的产多糖絮凝剂的基因工程菌经发酵56h后絮凝活性可达到5332U mL-1，比出发菌株的絮凝活性(2806U mL-1)提高了1.9倍，多糖絮凝剂粗产量提高了27.8％。可望用于多糖絮凝剂的工业化生产，提高产量降低成本。

Claims (8)

1.产多糖絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌HN301-1，其特征在于是在产胞外多糖的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中过表达epsDEF基因的基因工程菌；所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)已于2009年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.2876；所述epsDEF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。
2.制备如权利要求1所述产多糖絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌HN301-1的方法，其特征在于其具体步骤如下：
将所述epsDEF基因克隆到表达载体上获得重组表达载体，将所得重组表达载体通过电转化的方法导入到地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CGMCC No.2876中即获得产多糖絮凝剂的基因工程菌HN301-1。
3.多糖絮凝剂的制备方法，其特征在于其具体步骤如下：
将权利要求1所述产多糖絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌HN301-1发酵培养，收集发酵液，提纯，即得多糖絮凝剂。
4.如权利要求3所述多糖絮凝剂的制备方法，其特征在于所述发酵培养的温度为30～40℃，发酵培养的时间为48～60h。
5.如权利要求4所述多糖絮凝剂的制备方法，其特征在于所述发酵培养的温度为35～40℃，发酵培养的时间为50～60h。
6.如权利要求5所述多糖絮凝剂的制备方法，其特征在于所述发酵培养的温度为37℃，发酵培养的时间为56h。
7.如权利要求3所述多糖絮凝剂的制备方法，其特征在于所述提纯的方法为：采用乙醇提取，离心速度为6000～8000rpm，离心时间为10～15min，离心温度为4℃；所述乙醇的用量按体积比为发酵液的3倍。
8.如权利要求2所述产多糖絮凝剂的地衣芽孢杆菌基因工程菌HN301-1的方法，其特征在于所述重组表达载体的构建方法，是将所述epsDEF基因的核苷酸序列与表达载体pHY300PLK-PamyL-TTamyL质粒分别用限制性内切酶Kpn I和Spe I双酶切，形成互补的粘性末端，分别纯化后经T4DNA连接酶，形成重组表达载体，将所得的重组表达载体命名为pHY300-epsDEF。
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地衣芽孢杆菌CGMCC2876生物絮凝剂的合成代谢途径及其基因调控研究;严珊;《万方数据》;20131231;第45页第1段 *
生物絮凝剂的最新研究进展及其应用;何宁 等;《微生物学通报》;20050430;第32卷(第2期);第104-108页 *

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