CN103194499A - 利用地衣芽孢杆菌制备γ-聚谷氨酸生物絮凝剂的方法 - Google Patents

Abstract

利用地衣芽孢杆菌制备γ-聚谷氨酸生物絮凝剂的方法，涉及一种生物絮凝剂。提供利用地衣芽孢杆菌制备γ-聚谷氨酸生物絮凝剂的方法。将地衣芽孢杆菌转接于斜面培养基培养；用接种环挑取活化的菌种，接入装有种子培养基的锥形瓶中培养；接入装有种子培养基的锥形瓶中培养；取二级种子，以3%的接种量接种于发酵培养基中培养；将生物絮凝剂发酵液离心，除去沉淀，收集上清液；在上清液中加入乙醇后静置，离心除去上清液；将沉淀物溶于去离子水中，透析袋透析；向透析后溶液中加入无水乙醇，搅拌均匀，离心后除去上清，将沉淀物冷冻真空干燥得到纯品γ-聚谷氨酸生物絮凝剂。发酵周期短以及合成出的絮凝剂活性高、热稳定性好、工业应用潜力大。

Description

利用地衣芽孢杆菌制备γ-聚谷氨酸生物絮凝剂的方法

技术领域

本发明涉及一种生物絮凝剂，尤其是涉及利用地衣芽孢杆菌制备γ-聚谷氨酸生物絮凝剂的方法。

背景技术

生物絮凝剂（Bioflocculant）是一类由微生物产生的可使液体中不易降解的固体悬浮颗粒、菌体细胞及胶体粒子等凝集、沉淀的特殊高分子代谢产物。不同的微生物在特定条件下产生絮凝剂的种类不同，按其化学组成分类，生物絮凝剂大多为多糖类和蛋白质类物质，另外还有少量属于脂类和DNA等其它类型。

自1942年Bovarnick等发现γ-PGA作为一种多肽，能自由地分泌到培养基中以来，人们发现γ-PGA能在多种芽孢杆菌胞外积累，如：Bacillus.subtilis IFO3335、Bacillus.subtilis(Chungkookjang)、Bacillus.subtilis TAM-4和Bacillus.1icheniformisA35。γ-PGA作为一种生物高分子材料，具有生物可降解性好、可食、对人体和环境无毒害的优点，因此γ-PGA及其衍生物在食品、化妆品、医药和水处理等方面引起了人们的广泛关注。同时，γ-PGA具有水溶性聚羧酸的性质，有强吸水和可螯合金属等特点，可作为微生物合成的高分子絮凝剂使用。Taniguchi等(Journal of Bioscience and Bioengineering2005,99:130-135)利用交联γ-PGA处理河流和池塘污水有显著的絮凝和沉降作用。姚俊等(生物加工过程2004,2:35-39)还利用γ-PGA处理电镀废水中Cr⁺³、Ni⁺²等离子。γ-PGA作为生物絮凝剂不仅用在污水处理领域，在饮用水处理、食品和发酵工业等都有广阔的应用前景(Journal of Chromatography2011,879:3096-3101)。

研究表明，多种细菌发酵合成的γ-PGA具有絮凝活性。

Shih等(Bioresoure Technology2001,78:267-372)利用Bacillus licheniformis CCRC12826在培养基(g L^-1)：谷氨酸20、柠檬酸12、甘油120、NH₄Cl7、MgSO₄·7H₂O0.5、FeCl₃·H₂O0.004、K₂HPO₄0.5和CaCl₂0.15中发酵96h后得到γ-PGA的粘度为17cp，其处理Ca(OH)₂溶液絮凝率达到11OD^-1。

Bacillus sp.PY-90在基础培养基(m/v)：葡萄糖2.0%、K₂HPO₄0.2%、MgS0₄·7H₂00.05%、多蛋白胨1.0%、酵母提取物0.05%和琼脂2.0%中发酵48h，所得γ-PGA在高岭土溶液絮凝活性为15OD^-1，当温度到100℃时，絮凝活性开始降低(Journal of Fermentation andBioengineering1995,79:378-380)。

Bacillus subtilis IFO3335以培养基(m/v)：谷氨酸3.0%、NH₄Cl1.0%、葡萄糖1.0%、K₂HPO₄0.2%、酵母提取物0.2%和MgSO₄·7H₂O0.2%发酵72h后在酸性黏土中絮凝率为14OD^-1(Journal of Fermentation and Bioengineering1996,82:84-87)。

Bacillus subtilis R23在培养基(g L^-1)：葡萄糖52.5、柠檬酸15.5、NaCl20、(NH₄)₂SO₄4.75、L-谷氨酸20、KCl0.66、K₂HPO₄1、MgSO₄·7H₂O6.8、CaCl₂·2H₂O0.18、NaHCO₃0.18、MgCl₂·6H₂O4.7、α-酮戊二酸5mM和MnSO₄·7H₂O0.05中发酵48h后处理高岭土的絮凝率达到30.32OD^-1(Food and Bioprocess Technology2009,4:745-752)。

在国内，曹小红等利用培养基(m/v)：葡萄糖2.5%、蛋白胨3%、味精2%、Mg SO₄·7H₂O0.05%和K₂HPO₄0.26%发酵Bacillus natto TK-2，24h后最高絮凝率为95%，在80℃以下都能保持很高的絮凝活性(环境保护科学2007,33:17-20)。

张毅等以培养基(g L^-1)：蔗糖20、(NH₄)₂SO₄20、谷氨酸钠20、MgSO₄1、NaCl10和K₂HPO₄0.5发酵Bacillus subtilis ZJUTZY24h后所得絮凝率为46.99%(浙江工业大学学报2008,36:647-650)。

赵东风等以培养基(g L^-1)：蔗糖20、KH₂PO₄2、K₂HPO₄5、(NH₄)₂SO₄0.2、NaCl0.1、尿素0.5、酵母膏0.5和MgSO₄·7H₂O0.2发酵Enterobacter sp.W16-c28h后最大絮凝率达到96.2%(中国石油大学学报(自然科学版)2001,36:164-168)。

宁雪等从活性污泥中分离筛选出一株高效絮凝剂产生菌TJ-3，以培养基(g L^-1)：葡萄糖20、尿素0.5、酵母膏0.5、KH₂PO₄2、(NH₄)₂SO₄0.2、K₂HPO₄5和MgSO₄·7H₂O0.2合成的γ-PGA最大絮凝率为98.2%(微生物学通报2009,36:640-643)。

惠明等利用培养基(g L^-1)：L-谷氨酸20、柠檬酸9.86、甘油80.36、(NH₄)₂SO₄7、MgSO₄·7H₂O0.5、FeCl₃·6H₂O0.02、K₂HPO₄0.89、CaCl₂0.03和MnSO₄·H₂O0.3发酵Bacillussubtilis B5396h后得到γ-PGA的最大絮凝活性为90%(生物技术2006,16:68-70)。

曾晓希等从铝土矿中分离出胶质芽孢杆菌，利用培养基(g L^-1)：蔗糖5、(NH₄)₂SO₄1.0、Na₂HPO₄2.0、MgSO₄·7H₂O0.5、NaCl0.1、酵母膏0.5和CaCO₃1.0产生的γ-PGA絮凝剂在30℃～90℃范围内有较好的热稳定性，絮凝率在85%～90%之间(生命科学仪器2008,6:30-32)。

林炜铁等利用培养基(g L^-1)：葡萄糖7、蛋白胨1.3、KH₂PO₄2、K₂HPO₄5、MgSO₄·7H₂O0.1、NaCl0.3和FeSO₄·7H₂O0.02发酵Pseudomonas fluorescens JX18所产生的γ-PGA絮凝剂在100℃时絮凝率为93%左右(化工进展2010,29:1186-1190)。

尽管国内外对γ-PGA的研究已经相当成熟，而且γ-PGA作为生物絮凝剂独特的优越性已经显示了其广阔的应用前景，但日前γ-PGA生物絮凝剂尚未在实际生产中得到推广。主要原因为：①发酵周期长；②絮凝活性弱；③热稳定性差。

本申请人在公开号为CN101503709的专利申请中提供一种具有较高絮凝活性、原料成本低、工业应用潜力较大的利用地衣芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法。微生物为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），该微生物已于2009年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.2876。该方法将新鲜斜面上的菌苔转接至种子培养基培养后，转接至发酵培养基培养，得生物絮凝剂发酵液，离心除去沉淀收集上清液，加入乙醇静置后离心，除去上清液，向沉淀物中再加入无水乙醇，搅拌，离心，除去上清液，向乙醇沉淀物中加入十六烷基三甲基溴化铵，离心，除去上清液得沉淀物，将沉淀物溶解于NaCl溶液中，加入无水乙醇，搅拌，静置，离心除去上清液得沉淀物，将沉淀物冷冻真空干燥得到纯品生物絮凝剂。

发明内容

本发明的目的在于针对目前生物絮凝剂生产所存在的发酵周期长、絮凝剂效率低、热稳定性差、难以推广等问题，提供利用地衣芽孢杆菌制备γ-聚谷氨酸生物絮凝剂的方法，该方法具有发酵周期短以及合成出的絮凝剂活性高、热稳定性好、工业应用潜力大的优点。

本发明采用的微生物为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，该微生物已于2009年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.2876（公开号为CN101503709）。

本申请人在公开号为CN101503709的发明专利申请中公开一种利用地衣芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法，该方法将新鲜斜面上的菌苔转接至种子培养基培养后，转接至发酵培养基培养，得生物絮凝剂发酵液，离心除去沉淀收集上清液，加入乙醇静置后离心，除去上清液，向沉淀物中再加入无水乙醇，搅拌，离心，除去上清液，向乙醇沉淀物中加入十六烷基三甲基溴化铵，离心，除去上清液得沉淀物，将沉淀物溶解于NaCl溶液中，加入无水乙醇，搅拌，静置，离心除去上清液得沉淀物，将沉淀物冷冻真空干燥得到纯品生物絮凝剂。

本发明的具体步骤如下：

1）菌种活化：将地衣芽孢杆菌转接于斜面培养基培养；

2）一级种子：用接种环挑取活化的菌种，接入装有种子培养基的锥形瓶中培养；

3）二级种子：接入装有种子培养基的锥形瓶中培养；

4）发酵培养：取二级种子，以3%的接种量接种于发酵培养基中培养；

5）将生物絮凝剂发酵液离心，除去沉淀，收集上清液；

6）在上清液中加入乙醇后静置，离心除去上清液；

7）将沉淀物溶于去离子水中，透析袋透析；

8）向透析后溶液中加入无水乙醇，搅拌均匀，离心后除去上清，将沉淀物冷冻真空干燥得到纯品γ-聚谷氨酸生物絮凝剂。

在步骤1）中，所述斜面培养基为斜面培养基：酵母膏1～3g/L、牛肉膏1～3g/L、胰蛋白胨2～7g/L、葡萄糖10～20g/L、FeSO₄微量、琼脂15～20g/L、pH7.2～7.5；所述培养的条件可为37℃下200r/min培养12～18h。

在步骤2）中，所述种子培养基为：葡萄糖10g/L、酵母膏0.5g/L、尿素0.5g/L、K₂HPO₄0.1g/L、KH₂PO₄0.1g/L、NaCl0.1g/L、MgSO₄·7H₂O0.2g/L；所述培养的条件可为37℃下200r/min培养16h。

在步骤3）中，所述种子培养基为：葡萄糖10g/L、酵母膏0.5g/L、尿素0.5g/L、K₂HPO₄0.1g/L、KH₂PO₄0.1g/L、NaCl0.1g/L、MgSO₄·7H₂O0.2g/L；所述培养的条件可为37℃下200r/min培养16h。

在步骤4）中，所述发酵培养基为：柠檬酸三钠15～25g/L、甘油10～30g/L、NH₄Cl7～11g/L、谷氨酸钠5～15g/L、MgSO₄0.3～0.7g/L、K₂HPO₄0.5～1.5g/L、pH7.2～7.5；所述培养的条件可为37℃下200r/min培养20～24h。

在步骤5）中，所述离心的条件可为转速4000～4500r/min，离心的时间可为20min。

在步骤6）中，所述乙醇的加入量按质量比可为上清液的2～3倍，所述离心的条件可为转速9000～10000r/min，离心的时间可为15min，最好重复一遍。

在步骤7）中，所述透析的条件可为7000Da的透析袋4℃透析12h。

在步骤8）中，所述无水乙醇的加入量按质量比可为透析后溶液的2～3倍，所述离心的条件可为转速9000～10000r/min，离心的时间可为15min。

本发明以合成γ-PGA培养基(g L^-1)：柠檬酸三钠15～25、甘油10～30、NH₄Cl7～11、谷氨酸钠5～15、MgSO₄0.3～0.7、K₂HPO₄0.5～1.5，pH7.2～7.5于摇瓶培养地衣芽孢杆菌，装液量为100mL/250mL，发酵时间为20～24h，所得生物絮凝剂以γ-PGA为主要活性成分（94.43%），絮凝活性达到11670U mL^-1，将其在120℃处理1h后絮凝活性仍维持为原来的82%。由地衣芽孢杆菌制备的该生物絮凝剂的方法，与现有技术中各种生物絮凝剂的制备方法相比具有发酵周期短以及合成出的絮凝剂活性高、稳定性好等特点，该生物絮凝剂无毒无害、无二次污染、其生产工艺适合大规模生产及工业应用，具有很好的推广价值。

附图说明

图1为本发明实施例不同柠檬酸三钠浓度对Bacillus licheniformis CGMCC2876发酵合成生物絮凝剂的影响。

图2为本发明实施例不同NH₄Cl浓度对Bacillus licheniformis CGMCC2876发酵合成生物絮凝剂的影响。

图3本发明实施例不同谷氨酸钠浓度对Bacillus licheniformis CGMCC2876发酵合成生物絮凝剂的影响。

图4为本发明实施例不同Mg²⁺浓度对Bacillus licheniformis CGMCC2876发酵合成生物絮凝剂的影响。

图5为本发明实施例不同K₂HPO₄浓度对Bacillus licheniformis CGMCC2876发酵合成生物絮凝剂的影响。

图6为本发明实施例不同甘油浓度对Bacillus licheniformis CGMCC2876发酵合成生物絮凝剂的影响。

图7为本发明实施例温度对絮凝活性的影响。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明，以便为更好地理解本发明提供依据。

实施例1.地衣芽孢杆菌合成生物絮凝剂

将新鲜斜面上的菌体转接至100mL种子培养基中，37℃摇床培养，转速200r min^-1，16h后，按4%的接种量转接至发酵培养基中培养。

实施例2.如实施例1所述培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中柠檬酸三钠的浓度为15g L^-1。

实施例3.如实施例1所述培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中柠檬酸三钠的浓度为20g L^-1。

实施例4.如实施例1所述培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中柠檬酸三钠的浓度为25g L^-1。

实施例5.如实施例1所述培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中NH₄Cl的浓度为7g L^-1。

实施例6.如实施例1所述培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中NH₄Cl的浓度为9g L^-1。

实施例7.如实施例1所述培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中NH₄Cl的浓度为11g L^-1。

实施例8.如实施例1所述培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中谷氨酸钠的浓度为5g L^-1。

实施例9.如实施例1所述培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中谷氨酸钠的浓度为10g L^-1。

实施例10.如实施例1所述培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中谷氨酸钠的浓度为15g L^-1。

实施例11.如实施例1所述培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中Mg²⁺的浓度为0.3g L^-1。

实施例12.如实施例1所述培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中Mg²⁺的浓度为0.5g L^-1。

实施例13.如实施例1所述培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中Mg²⁺的浓度为0.7g L^-1。

实施例14.如实施例1所述培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中K₂HPO₄的浓度为0.5g L^-1。

实施例15.如实施例1所述培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中K₂HPO₄的浓度为1.0g L^-1。

实施例16.如实施例1所述培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中K₂HPO₄的浓度为1.5g L^-1。

实施例17.如实施例1所述培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中甘油的浓度为10g L^-1。

实施例18.如实施例1所述培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中甘油的浓度为20g L^-1。

实施例19.如实施例1所述培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中甘油的浓度为30g L^-1。

Claims (10)

1.利用地衣芽孢杆菌制备γ-聚谷氨酸生物絮凝剂的方法，其特征在于具体步骤如下：

1）菌种活化：将地衣芽孢杆菌转接于斜面培养基培养；所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，已于2009年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.2876；

2）一级种子：用接种环挑取活化的菌种，接入装有种子培养基的锥形瓶中培养；

3）二级种子：接入装有种子培养基的锥形瓶中培养；

4）发酵培养：取二级种子，以3%的接种量接种于发酵培养基中培养；

5）将生物絮凝剂发酵液离心，除去沉淀，收集上清液；

6）在上清液中加入乙醇后静置，离心除去上清液；

7）将沉淀物溶于去离子水中，透析袋透析；

8）向透析后溶液中加入无水乙醇，搅拌均匀，离心后除去上清，将沉淀物冷冻真空干燥得到纯品γ-聚谷氨酸生物絮凝剂。

2.如权利要求1所述利用地衣芽孢杆菌制备γ-聚谷氨酸生物絮凝剂的方法，其特征在于在步骤1）中，所述斜面培养基为斜面培养基：酵母膏1～3g/L、牛肉膏1～3g/L、胰蛋白胨2～7g/L、葡萄糖10～20g/L、FeSO₄微量、琼脂15～20g/L、pH7.2～7.5；所述培养的条件可为37℃下200r/min培养12～18h。

3.如权利要求1所述利用地衣芽孢杆菌制备γ-聚谷氨酸生物絮凝剂的方法，其特征在于在步骤2）和3）中，所述种子培养基为：葡萄糖10g/L、酵母膏0.5g/L、尿素0.5g/L、K₂HPO₄0.1g/L、KH₂PO₄0.1g/L、NaCl0.1g/L、MgSO₄·7H₂O0.2g/L；所述培养的条件可为37℃下200r/min培养16h。

4.如权利要求1所述利用地衣芽孢杆菌制备γ-聚谷氨酸生物絮凝剂的方法，其特征在于在步骤4）中，所述发酵培养基为：柠檬酸三钠15～25g/L、甘油10～30g/L、NH₄Cl7～11g/L、谷氨酸钠5～15g/L、MgSO₄0.3～0.7g/L、K₂HPO₄0.5～1.5g/L、pH7.2～7.5。

5.如权利要求1所述利用地衣芽孢杆菌制备γ-聚谷氨酸生物絮凝剂的方法，其特征在于在步骤4）中，所述培养的条件为37℃下200r/min培养20～24h。

6.如权利要求1所述利用地衣芽孢杆菌制备γ-聚谷氨酸生物絮凝剂的方法，其特征在于在步骤5）中，所述离心的条件为转速4000～4500r/min，离心的时间为20min。

7.如权利要求1所述利用地衣芽孢杆菌制备γ-聚谷氨酸生物絮凝剂的方法，其特征在于在步骤6）中，所述乙醇的加入量按质量比为上清液的2～3倍。

8.如权利要求1所述利用地衣芽孢杆菌制备γ-聚谷氨酸生物絮凝剂的方法，其特征在于在步骤6）中，所述离心的条件为转速9000～10000r/min，离心的时间为15min。

9.如权利要求1所述利用地衣芽孢杆菌制备γ-聚谷氨酸生物絮凝剂的方法，其特征在于在步骤7）中，所述透析的条件为7000Da的透析袋4℃透析12h。

10.如权利要求1所述利用地衣芽孢杆菌制备γ-聚谷氨酸生物絮凝剂的方法，其特征在于在步骤8）中，所述无水乙醇的加入量按质量比为透析后溶液的2～3倍，所述离心的条件可为转速9000～10000r/min，离心的时间可为15min。

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