CN106277242A - 一种微生物多糖絮凝剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种微生物多糖絮凝剂，所述微生物多糖絮凝剂为主要由阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸组成的酸性杂多糖。本发明的微生物多糖絮凝剂分子量大，可达到0.8～3.2×10⁷Da，因此絮凝活性好，使用时只需添加污水中悬浮物质量或污泥质量的0.2％～0.4％即可达到96％的絮凝活性或使板框压滤脱水的泥饼含水率降低到60％以下，污泥的脱水效果与同样添加量的聚丙烯酰胺相当，相比聚丙烯酰胺更加环保。

Description

一种微生物多糖絮凝剂及其应用

技术领域

本发明总地涉及微生物技术领域，更具体地，涉及一种微生物多糖絮凝剂及其应用。

背景技术

絮凝剂分为无机絮凝剂、有机合成高分子絮凝剂和天然絮凝剂。无机絮凝剂主要有聚合氯化铝、聚合氯化铁等，存在使用量大，铝盐有毒性，可致老年性痴呆症等问题。有机合成高分子絮凝剂主要为聚丙烯酰胺及其衍生物。由于聚丙烯酰胺单体是很强的神经毒素，并具有强致癌性，发达国家严格规定了其使用浓度。天然絮凝剂主要为改性淀粉、壳聚糖和微生物絮凝剂等。改性淀粉絮凝效果欠佳，使用较少。壳聚糖价格昂贵。

微生物絮凝剂是具有絮凝活性的微生物次生代谢产物或具有絮凝活性的菌体，是一类新型絮凝剂，其化学成份主要是多糖、蛋白质、纤维素和核酸等物质，分子量可达到为几十万甚至以上，具有高效、无毒、易降解、无二次污染等特点，有效地克服了无机絮凝剂和人工合成有机絮凝剂在安全和环境方面存在的问题，是环境友好型的绿色絮凝剂，越来越受到各国水处理工作者的重视，其中研究较多的是微生物多糖。微生物多糖又称为多聚糖，是一类至少由10个碳组成的天然高分子碳水化合物，分子量一般在5000～10⁶Da之间。高分子量的生物多糖可以用于增稠剂、悬浮剂、稳定剂等，除了应用于环保领域还广泛应用于食品、化妆品、建筑、石油开采等行业。

根据现有文献报道，现有的的微生物多糖絮凝剂的分子量大部分在10⁴～10⁶Da范围，尚未见更高分子量的微生物多糖絮凝剂的报道。絮凝剂的絮凝活性受分子量的影响很大。通常，絮凝剂分子量大，吸附位点多，网捕和卷扫作用明显，絮凝活性高，使用时添加量少。

目前的微生物多糖絮凝剂有单纯的多糖、也有糖和蛋白、脂的混合物。糖蛋白中糖和蛋白的比例差别较大，其中糖的含量变化范围为5％-98.4％， 蛋白的含量变化范围在0.87％-69％之间。这些多糖、糖蛋白或者脂多糖对高岭土的絮凝活性范围在85-95％之间，且绝大多数多糖絮凝剂需要添加钙离子或者镁离子等助凝剂才能发挥最佳的絮凝效果。

总之，目前市场上的多糖生物絮凝剂在使用时通常添加量较大，且需要添加辅助离子。

发明内容

本发明提供了一种微生物多糖絮凝剂及其应用，该絮凝剂主要由阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸组成的酸性杂多糖，分子量大，絮凝效果好，且使用时不需添加辅助离子。

本发明的一个方面，提供一种微生物多糖絮凝剂，所述微生物多糖絮凝剂为主要由阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸组成的酸性杂多糖，所述絮凝剂分子量为0.8～3.2×10⁷Da。

在上述技术方案中，所述甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的摩尔比为26～54：1：80～110：10～23：2～6。

在上述技术方案中，糖苷键构型为β型，包括β-1,2糖苷键,β-1,3糖苷键和β-1,6糖苷键。

在上述技术方案中，所述β-1,2糖苷键,β-1,3糖苷键和β-1,6糖苷键的比例为20:10:1。

在上述技术方案中，所述絮凝剂中总糖含量为95％～98％。

本发明的另一个方面，还提供了以上所述的微生物多糖絮凝剂在处理污水中的用途。

本发明的再一个方面，还提供了以上所述微生物多糖絮凝剂在污泥板框压滤深度脱水中的用途，可达到与聚丙烯酰胺相同的污泥脱水效果。

本发明的微生物多糖絮凝剂分子量大，可达到0.8～3.2×10⁷Da，因此絮凝活性好，使用时只需添加污水中悬浮物质量或污泥质量的0.2％～0.4％即可达到96％的絮凝活性或使板框压滤脱水的泥饼含水率降低到60％以下，并且在使用时无需添加任何助剂，污泥的脱水效果与同样添加量的聚丙烯酰胺相当，相比聚丙烯酰胺更加环保。

附图说明

图1为本发明实施例提供的多糖絮凝剂的红外扫描结果；

图2为本发明实施例提供的多糖絮凝剂的β-葡萄糖苷酶水解物核磁共振H谱；

图3为本发明实施例提供的多糖絮凝剂的β-葡萄糖苷酶水解物核磁共振C谱；

图4为本发明实施例提供的多糖絮凝剂的单糖组成HPLC分析图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：多糖絮凝剂制备

使用地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis LZ-1(于2012年11月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，菌种保藏号为：CGMCC No.6782)发酵生产多糖絮凝剂，发酵生产条件为温度37℃，空速0.5L/L/min，搅拌速率200rpm，采用毛细管粘度计测定发酵液粘度，当发酵液粘度不再增加时停止发酵，总发酵时间为46小时，发酵液中多糖浓度为10g/L。

所用培养基组成为蔗糖30g/L，硝酸钠3.0g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，pH 10。

发酵液中多糖浓度测定方法如下：取3mL发酵液，加3mL去离子水稀释，离心(10000rpm，60min)去菌体，取3mL上清液加4倍体积乙醇沉淀产物，轻轻振荡后，4℃过夜，1000×g离心15min，弃上清；用75％乙醇清洗沉淀2次，沉淀用去离子水溶解，采用蒽酮-硫酸比色法测定溶液中的多糖浓度为10g/L。

测定发酵液中总糖含量:

取上述发酵液，离心(10000rpm，60min)去除菌体或采用0.2μm微滤膜过滤；在上清液或滤液中加入4倍体积无水乙醇沉淀产物；沉淀用75％ 乙醇水溶液清洗2次；沉淀重溶于去离子水后，用4倍体积无水乙醇再次沉淀产物；沉淀物用去离子水重溶；重溶液采用Sevage法除蛋白3次；除蛋白后的地衣芽孢杆菌LZ-1多糖溶液采用透析膜(截留分子量100,000Da)于4℃去离子水中透析除盐和小分子；透析液采用4倍无水乙醇沉淀；沉淀物重溶于水，真空冷冻干燥，得地衣芽孢杆菌LZ-1多糖絮凝剂纯品。多糖絮凝剂纯品经蒽酮法测总糖的含量为95-98％。

实施例2：多糖絮凝剂结构分析

对实施例1中得到的多糖絮凝剂纯品的结构进行以下的分析：

1、元素分析

元素分析采用型号为Vario ELⅢ元素分析系统(德国Elementar公司)分析C、H、N、S和O。取经过充分干燥的多糖絮凝剂纯品样品15～20mg包在锡容器内，在1200℃进行分解，采用TCD-热导检测器(德国Elementar公司)对气化后的气体进行检测，其中载气为He气，纯度≥99.995％；燃烧气为O₂，纯度≥99.995％，每个样品做二个平行。

提纯产物元素分析结果如下表所示，C、H、O的含量超过92％，说明该多糖絮凝剂纯品主要以多糖为主，含有少量的蛋白，蛋白含量占多糖含量的0.5-1％。

表1多糖提取物元素分析结果

元素名称	C	H	N	O	S	合计
							提取样品，％	39.57	6.28	2.54	46.3	<0.30	94.69
提取样品，％	37.28	6.85	2.92	47.31	<0.30	94.66

2、分子量测定

分子量采用凝胶排阻色谱测定(委托北京市理化分析测试中心测定)，多角度激光光散射仪：DAWN HELEOS-II(美国Wyatt公司)，示差折光检测器Optilab(美国wyatt公司)，色谱柱型号：Shodex SB-806m-HQ，色谱柱规格：8.0mmID×300mmL。

提取的多糖絮凝剂纯品经检测，数均分子量Mn为0.8～3.2×10⁷Da，重均分子量Mw为1.0～3.2×10⁷Da，多分散度Mw/Mn为1.0～1.2，Mw/Mn比值小，说明分子量分布较窄，分子的大小相对匀一。

3、红外光谱检测

采用的红外扫描仪器型号为Spectrum GX(美国Pekin-Elmer公司)。首先制备溴化钾空白片和样品压片，将压制好的溴化钾空白片放入红外扫描仪样品仓的样品架上，确认采集参比背景光谱，然后将待测样品放入光谱仪内，对样品进行扫描。样品每次用量为2～5mg，结果如图1所示：

红外光谱结果显示，1000～1300cm^-1是C-O和C-O-C常见的吸收峰，脂肪醚的峰在1150～1060cm^-1，而多糖以C-O-C连接；1500～1680cm^-1是苯环的骨架振动；2100～2400是C≡N键的吸收峰，属于多糖类物质。另外，β-型的C-H取直立键，在891±7cm^-1处有一个吸收峰，在图中也可以看到这个位置附近峰比较明显。因此，可以看出该产物符合多糖的特征峰。

4、核磁共振

高分辨核磁共振波谱仪系统Bruker AVANCE III 500(瑞士布鲁克公司)；将50mg的多糖絮凝剂纯品溶于D₂O，H谱的频率为500赫兹，C谱的频率为125赫兹。

多糖产物由于分子量比较大，在分析前先用β-葡萄糖苷酶进行水解(配制1g/L的多糖溶液，加入1ml10ku的β-葡萄糖苷酶水解2h，温度为50)，水解后的产物经过sephadex-G200(美国通用电气公司)层析，取10-15min样品进行检测。

核磁共振结果：H谱的核磁如图2所示。

异头碳的构型对应的峰通常在4.3～5.9ppm(δ>5.00为α-型,δ<5.00为β-型)，在图2中没有发现相应的峰，在2.0～2.2ppm处为乙酰氨基的甲基峰。从H谱上不能确定糖苷键是α还是β构型。

C谱的结果如图3所示，异头碳的共振峰一般出现在90～112ppm，在图3中有四个峰出现，说明存在四个异头碳。β-型糖苷键的位置为103～105ppm，而上述四个异头碳在103～105的范围内，属于β型。另外170～176ppm范围的低场信号反映有己糖醛酸的羧基或乙酰基的存在。所以该多糖是含有四个异头碳的β型的糖苷键连接而成，同时含有羧基和乙酰基结构。

5、单糖组成

对单糖组成的测定采用硫酸水解多糖样品后用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)进行衍生，然后用高压液相仪(Agilent 1260，C18柱：Agilent， Eclipse plus C18，3.5UM，4.6×100MM)进行检测。多糖的水解条件是将98％浓硫酸稀释400倍，取80mg实施例1中的多糖絮凝剂纯品溶解于5ml稀释后的硫酸，然后120℃水解2h。水解后的液体用碳酸钡进行中和至pH＝7左右，然后进行冻干，冻干后的水解物重溶于1ml去离子水后用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮进行衍生，然后对衍生后的单糖在C18的柱子上分离，得到各单糖清晰的峰，结果如图4所示。色谱条件：流动相采用水和乙腈，体积比为78：22，流速为1ml/min，柱温为30℃，检测器为示差检测器(30℃)，进样量6微升。

测得多糖絮凝剂纯品中的单糖组成是：葡萄糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖，还有葡萄糖醛酸。这几种糖和糖醛酸的摩尔比例是(平均值)：甘露糖：葡萄糖醛酸：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖＝40：1：94：16：4。其中葡萄糖和甘露糖的比例接近2：1。

6、高碘酸氧化

高碘酸可以选择性地断裂糖分子中连二羟基或连三羟基处，生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸。反应定量地进，每开裂一个C-C键消耗一分子高碘酸。由于高碘酸在波长223nm处呈最大吸收，因此可通过分光光度法测定高碘酸消耗及甲酸的释放量，据此可以判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度、支链多糖的分枝数目等。以葡聚糖为例，具有1-2糖苷键或1-4糖苷键的糖基经高碘酸氧化，平均每个糖基仅消耗一分子高碘酸，并且无甲酸释放；具有1-3糖苷键的的糖基不被高碘酸氧化；具有1-6糖苷键的糖基或非还原末端经高碘酸氧化，消耗两分子高碘酸，同时释放一分子甲酸。

取0.5g实施例1中的多糖絮凝剂纯品加入5ml去离子水，溶胀后再用30mmol的高碘酸溶液溶解，定容至50ml。每隔4h取0.2ml稀释50倍，测高碘酸含量的变化；当高碘酸含量不变时，加入2ml的乙二醇结束反应去除未反应的高碘酸。通过高压液相色谱检测甲酸的含量确定1-6糖苷键的含量。甲酸测定条件：色谱柱为Hiplex-H(300*7.7mm，Agilent)，流动相：0.002M的硫酸溶液，流量0.6ml/min，柱温80℃，示差检测器，色谱仪为waters 1260。

表2多糖提取物高碘酸氧化结果

注：采用30mmol的高碘酸10ml+10ml水作为初始值

高碘酸氧化结果表明产物中含有1-6糖苷键。

7、Smith降解

Smith降解是将高碘酸氧化产物还原后进行酸水解或部分酸水解。由于糖基之间以不同的位置缩合，用高碘酸氧化后生成不同的产物。产物用硼氢化钠(钾)还原成稳定的多羟基化合物，经酸水解后用HPLC鉴定水解产物，由降解的产物可以推断糖苷键的位置。以1-3位键合的糖苷键产生葡萄糖或其它单糖，以1-2位键合的糖苷键产生甘油和甘油醛，以1-4位键合的糖苷键产生赤藓醇和乙二醇，以1-6位键合的糖苷键产生甘油和乙二醇，非还原末端基的降解产物亦为甘油。

将高碘酸氧化产物透析48h，冻干后溶于5ml水中，加入100mg硼氢化钠进行还原24h，调节pH将硼氢化钠破坏，3000Da的半透膜透析48h后冻干。用0.045M硫酸水解，直接用Hiplex-H柱子检测，RID检测器检测。平行进行两次检测，结果见下表3。水解液中存在大量的甘油(15.577min)和甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖混合物(12.140min)，少量的葡萄糖醛酸(10.721min)、葡萄糖(11.2min)和乙二醇(18.355min)。

因此，Smith降产物中除了存在1-6糖苷键，还存在1-3糖苷键(存在单糖)，1-2糖苷键(存在甘油)。糖苷键比例1-2糖苷键:1-3糖苷键:1-6糖苷键＝20:10:1。

表3多糖Smith氧化结果

样品名称	样品量	甘油含量	乙二醇含量	糖含量
					单位	mg	mmol	mmol	nmol
样品1	125.2	0.07256	0.00354	0.038267
					样品1	125.4	0.07231	0.00363	0.039547

实施例3

将高岭土配成5g/L的溶液；取实施例1中发酵至粘度为180mPa·s发酵液(其中多糖浓度为15g/L)稀释100倍，取1ml加入高岭土溶液100ml；在300rpm下搅拌0.5min，然后在100rpm搅拌2min，倒入100ml的量筒静置5min；取上清液在λ＝600nm测吸光度OD₆₀₀，和对照OD_600,0相比(不加发酵液)，加入发酵液的高岭土溶液变得澄清，絮凝率为98％，以高岭土的重量计，多糖的加入量为0.03wt％。

絮凝率计算公式如下：

取实施例1中发酵液的粘度增加到2000mPa·s时的发酵液(多糖浓度为35g/L)，稀释400倍，按照上述方法对高岭土溶液进行絮凝，絮凝率为95％，以高岭土的重量计，多糖的加入量为0.0175wt％。

取实施例1中发酵液的粘度增加到200mPa·s时的发酵液(多糖浓度为20g/L)，稀释200倍，按照上述方法对高岭土溶液进行絮凝，絮凝率为95％，以高岭土的重量计，多糖的加入量为0.02wt％。

将实施例1中得到的多糖絮凝剂纯品配成10g/L的溶液，稀释100倍，取1ml加入100ml高岭土溶液中，在300rpm下搅拌0.5min，然后在100rpm搅拌2min，倒入100ml的量筒静置5min，取上清液在λ＝600nm测吸光度，和对照(不加多糖的高岭土溶液)相比，加入絮凝剂的高岭土溶液变得澄清，絮凝率为95％，以高岭土的重量计，多糖的加入量为0.02wt％。

实施例4：多糖絮凝剂在污泥板框压滤上的应用

对比例：

污泥来自生活污水处理厂，用板框压滤之前先将污泥的含水率调节为90％，然后加入浓度为30％聚合氯化铁作为絮凝剂，絮凝剂的加入量为10mg/L，板框压滤机(山东景津环保设备有限公司，1600型)的板框边长是1.6米，自动拆卸压滤板20块。经过现场连续60天的实验表面，再加入与污泥质量比为0.2％、0.3％和0.4％的聚丙烯酰胺作为助凝剂，经过板框压滤机的压滤，含水率变为60％、57％和56％。

实验例：

用该生物絮凝剂在大型边框压滤机上对生活污泥和工业污泥的混合物进行脱水，将实施例1中粘度为180、200、2000mPa·s的发酵液按照多糖与污泥的质量比为0.2％、0.3％和0.4％的比例添加到含水率为90％污泥中,然后加入浓度为30％聚合氯化铁作为絮凝剂，絮凝剂的加入量为10mg/L。板框压滤机(山东景津环保设备有限公司，1600型)的板框边长是1.6米，自动拆卸压滤板20块。经过现场连续60天的实验表面，加入质量比为0.2％、0.3％和0.4％的生物絮凝剂经过压滤后，污泥的含水率降低到60％、58％和55％，和使用聚丙烯酰胺相比含水率及加药剂的量基本相同，说明本发明的多糖絮凝剂可以替代聚丙烯酰胺。

Claims (8)

1.一种微生物多糖絮凝剂，其特征在于，所述微生物多糖絮凝剂为主要由阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸组成的酸性杂多糖，所述絮凝剂分子量为0.8～3.2×10⁷Da。

2.如权利要求1所述的微生物多糖絮凝剂，其特征在于，所述甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的摩尔比为26～54：1：80～110：10～23：2～6。

3.如权利要求1所述的微生物多糖絮凝剂，其特征在于，所述微生物多糖絮凝剂中多糖的糖苷键构型为β型。

4.如权利要求3所述的微生物多糖絮凝剂，其特征在于，所述糖苷键包括β-1,2糖苷键,β-1,3糖苷键和β-1,6糖苷键。

5.如权利要求4所述的微生物多糖絮凝剂，其特征在于，所述β-1,2糖苷键,β-1,3糖苷键和β-1,6糖苷键的比例为20:10:1。

6.如权利要求1所述的微生物多糖絮凝剂，其特征在于，所述絮凝剂中总糖含量为95％～98％。

7.如权利要求1至6中任一所述的微生物多糖絮凝剂在处理污水中的用途。

8.如权利要求1至6中任一所述的微生物多糖絮凝剂在污泥板框压滤深度脱水中的用途，其特征在于，所述微生物多糖絮凝剂可达到与聚丙烯酰胺相同的污泥脱水效果。