CN103604884A - 一种检测海藻生物质内还原性糖类物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种检测海藻生物质中还原性糖类物质的方法，其包括：（1）将所述海藻生物质粉碎，以便获得样品粉末；（2）利用酸对所述样品粉末进行水解处理，以便得到含有所述还原性糖类物质的水解液；（3）从所述水解液中纯化所述还原性糖类物质，以便得到待检测样品；以及（4）采用高效液相色谱法，通过蒸发光散射检测器检测所述待测样品中的所述还原性糖类物质。根据本发明的实施例，利用本发明的方法能够准确、高效地检测海藻生物质内还原性糖类物质。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测海藻生物质内还原性糖类物质的方法。
背景技术
近年来，利用非耕地养殖的海藻生物质来生产第三代生物能源，成为生物能源领域的热点。由于海藻中高含量的碳水化合物经过处理可被微生物利用，以其为原料产生物燃料的研究进展迅速。表1给出了干海带、干江蓠中的基本组分。从表1中可以看出，粗纤维和总糖即碳水化合物的含量非常高，因此水解后可产生大量发酵性糖，可被微生物利用进行发酵。
表1 干海带、干江蓠的基本组分（单位：%）
海带多糖包括褐藻胶、褐藻糖胶以及海藻淀粉，其中褐藻糖胶的单糖组分有岩藻糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等，而且由于海带的产地、收获季节的不同，褐藻糖胶中单糖组分即会出现较大差异。江蓠中多糖由大量半乳糖、葡萄糖组成，由于多糖含量高，江蓠是制备琼脂的常用藻类。目前利用大型海藻制备生物乙醇常用联合水解发酵的方法，即原料水解后不测定料液中的单糖组分与含量，直接投入菌种发酵。而微生物生长代谢时所利用的碳源是有选择性的，若水解液中含有大量微生物无法利用的单糖，则会影响后期生物乙醇的产量，且原料的利用率将会大大降低。
此外，传统检测还原性糖的方法，如苯酚-硫酸法和DNS法，都只能检测出还原糖总量而不能确定其种类与含量。因此，目前检测海藻生物质中还原性糖类物质的方法仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。
根据本发明的实施例，本发明提出了一种检测海藻生物质中还原性糖类物质的方法，其包括：
（1）将所述海藻生物质粉碎，以便获得样品粉末；
（2）利用酸对所述样品粉末进行水解处理，以便得到含有所述还原性糖类物质的水解液；
（3）从所述水解液中纯化所述还原性糖类物质，以便得到待检测样品；以及
（4）采用高效液相色谱法(HPLC)，通过蒸发光散射(ELSD)检测器检测所述待测样品中的所述还原性糖类物质。
根据本发明的实施例，利用本发明的方法能够准确、高效地检测海藻生物质内还原性糖类物质。根据本发明的实施例，本发明为高效液相色谱检测海藻水解液提供了可靠的样品预处理方法和液相检测条件。在以往的藻基乙醇原料制备生物乙醇的文献中，没有对海藻水解液中发酵性糖制备以及检测的具体实施步骤，特别是水解样品在进行液相色谱检测之前的预处理方式非常单一，而实践证明若样品只是通过0.22微米过滤膜，或使用超滤、固相萃取等传统去除水解液中杂质的方法，仍然会出现大量杂质峰和基线漂移的问题。因此，一般的样品预处理方法不适用于海带这类结构复杂物质的水解液，应该采用合适的分离方法将水解液中的杂质去除，才可以准确地鉴定出单糖的种类与含量。
根据本发明的实施例，上述方法还可以具有下列附加技术特征：
在本发明的一个实施例中，所述海藻生物质为选自海带和江蓠的至少一种，所述还原性糖类物质为选自海藻糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和甘露醇的至少一种。由此，可以进一步提高利用本发明的方法检测海藻生物质内还原性糖类物质的效率和准确性。
在本发明的一个实施例中，在步骤（1）中，所述样品粉末的粒度为177~840微米范围内，其中，当所述海藻生物质为海带时，在进行粉碎之前，预先对其依次进行洗净、去盐和风干处理。当所述海藻生物质为江蓠时，将其干燥后直接进行粉碎。由此，可以进一步提高利用本发明的方法检测海藻生物质内还原性糖类物质的效率和准确性。
在本发明的一个实施例中，在步骤（2）中，所述酸为浓度为1~3重量%的稀硫酸，所述水解处理是在110~130摄氏度下进行30~60分钟，并且所述稀硫酸与所述样品粉末的液固比为100：1~5。由此，可以进一步提高利用本发明的方法检测海藻生物质内还原性糖类物质的效率和准确性。
在本发明的一个实施例中，在步骤（2）中，所述水解处理是在110摄氏度下进行60分钟，并且在所述水解处理过程中施加微波进行辅助水解。由此，可以进一步提高利用本发明的方法检测海藻生物质内还原性糖类物质的效率和准确性。
在本发明的一个实施例中，在步骤（3）中，从所述水解液中纯化所述还原性糖类物质进一步包括：对所述含有还原性糖类物质的水解液依次进行中和、离心去除沉淀、旋转蒸发、水提醇沉、离心去除沉淀和蒸发乙醇预处理，以便得到所述待检测样品。由此，可以进一步提高利用本发明的方法检测海藻生物质内还原性糖类物质的效率和准确性。
在本发明的一个实施例中，所述中和包括使用碳酸钙将所述水解液的pH值调节至7。使用碳酸钙中和水解液中残留的酸，例如硫酸，产物例如硫酸钙沉淀可与海藻渣同时离心去除，最大程度地减少样品检测时其他化合物的存在与干扰。由此，可以进一步提高利用本发明的方法检测海藻生物质内还原性糖类物质的效率和准确性。
在本发明的一个实施例中，所述旋转蒸发包括：在55~65摄氏度的温度下，在100~200 mbar的真空度下，将所述水解液旋转蒸发至液态体积小于1 mL，以便得到浓缩液。由此，可以进一步提高利用本发明的方法检测海藻生物质内还原性糖类物质的效率和准确性。
在本发明的一个实施例中，所述水提醇沉包括：向经过所述旋转蒸发后得到的浓缩液中，加入95(v/v)%的乙醇，其中，所述浓缩液与所述乙醇的体积比为1：4~6。发明人发现水提醇沉可使水解液中杂质充分沉淀。由此，可以进一步提高利用本发明的方法检测海藻生物质内还原性糖类物质的效率和准确性。
在本发明的一个实施例中，所述蒸发光散射检测器的载气为氮气，漂移管温度为105℃，载气流速2.5 L/min，色谱柱为Benson BP-100Pb++碳水化合物分析柱，流动相为纯水，流速0.4 mL/min，以及进样量10 μL，柱温90℃。由此，可以进一步提高利用本发明的方法检测海藻生物质内还原性糖类物质的效率和准确性。
根据本发明的实施例，在本发明的方法中，发明人发现由于大型海藻多糖结构复杂，不同条件下水解液中的单糖含量甚至种类都会发生改变，采用本发明的水解条件，优选采用微波辅助水解的方式，使得该检测方法适用于任何条件下海藻水解液中单糖的鉴定与检测。
根据本发明的实施例，在本发明的检测方法中，针对大型海藻制备发酵性糖的预处理，以及对其中的单糖进行检测，其中，可制备发酵性糖的大型海藻主要有海带、马尾藻等褐藻藻类，以及江蓠、石花菜等红藻藻类。本发明方法强化了样品的预处理过程，去除检测过程中会产生干扰的杂质，减少了基线漂移、杂质峰等不良检测结果的出现，准确地检测出了海带、江蓠等海藻水解液中多种还原性糖的种类与含量。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例1的一种双糖、六种单糖标准液1 mg/mL浓度进样的ELSD检出图。其中，⒈海藻糖（双糖） ⒉葡萄糖 ⒊木糖 ⒋半乳糖 ⒌阿拉伯糖 ⒍甘露糖 ⒎甘露醇。
图2是根据本发明实施例1制得的海带水解液的HPLC-ELSD检测图。
图3是根据本发明实施例1制得的江蓠水解液的HPLC-ELSD检测图。
图4是根据本发明实施例1未经过旋转蒸发处理，仅用超滤膜离心超滤处理的海带水解样品的HPLC-ELSD图谱。
图5是根据本发明实施例1未经过旋转蒸发处理，仅用超滤膜离心超滤处理的江蓠水解样品的HPLC-ELSD图谱。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本发明。
实施例1：
1）取分别产自福建霞浦、山东日照的海带、江蓠样品，干物质表面杂质去除后粉粹，过20~80目筛，取中间筛分；
2）各取海带、江蓠粉末500 mg，分别用3%、1%（v/v）的硫酸10 mL于聚四氟乙烯微波消解罐，使用微波消解仪在110℃下反应60 min；
3）反应完成后用CaCO3粉末中和未反应完的酸，至pH为7后离心，取上清液；
4）使用旋转蒸发仪对样品进行浓缩，浓缩前后称量相关数据，计算出蒸发水的量，完成后向样品瓶内加入4~6 mL 95%(v/v)的乙醇，充分振荡使水解液中的杂质沉淀完全，再次离心取上清液，并旋转蒸发将样品中乙醇完全蒸发、回收；
5）根据上一步蒸发水的量，向样品中加入等量的水，得到江蓠样品和海带样品备用。此时样品中单糖浓度即为稀酸处理后的原始浓度；
6）取2 mL江蓠样品于10 mL容量瓶，稀释5倍，混匀；海带样品不稀释；最后使用0.22 μm一次性针头过滤膜将样品溶液过滤，取1 mL上机检测；检测结果见表2、图2、图3。
表2 原水解液中各单糖含量（单位：mg/L）
7）该检测方法在0.002~2 g/L 范围内线性良好，其中木糖与阿拉伯糖在0.005~2 g/L范围内线性良好。七种标准糖曲线的r2在0.9971~0.9996之间，相对标准偏差RSD为0.89~2.40（n=6），检测限（LOD）为10 μg/mL，其中木糖与阿拉伯糖的LOD为20 μg/mL，结果见表3。
表3 各标准样线性回归方程及方法的精确度检验
| 还原性糖 | 线性回归方程 | 浓度范围 (g/L) | r2 | RSD (n=6) |
| 海藻糖 | A=13975C-861202 | 0.002 ~ 2 | 0.999 1 | 0.97 |
| 葡萄糖 | A=19607C-8996030 | 0.002 ~ 2 | 0.999 0 | 1.10 |
| 木糖 | A=10809C-918659 | 0.005 ~ 2 | 0.995 1 | 2.40 |
| 半乳糖 | A=17727C-1090900 | 0.002 ~ 2 | 0.997 0 | 1.06 |
| 阿拉伯糖 | A=10737C-517501 | 0.005 ~ 2 | 0.999 1 | 1.94 |
| 甘露糖 | A=19661C-717114 | 0.002 ~ 2 | 0.999 6 | 0.89 |
| 甘露醇 | A=19554C-1099400 | 0.002 ~ 2 | 0.998 4 | 1.00 |
8）通过该实施例证明了，本发明方法强化了样品的预处理过程，去除检测过程中会产生干扰的杂质，减少了基线漂移、杂质峰等不良检测结果的出现，准确地检测出了海带、江蓠等海藻水解液中多种还原性糖的种类与含量。
Claims (10)
1.一种检测海藻生物质中还原性糖类物质的方法，其特征在于，包括：
（1）将所述海藻生物质粉碎，以便获得样品粉末；
（2）利用酸对所述样品粉末进行水解处理，以便得到含有所述还原性糖类物质的水解液；
（3）从所述水解液中纯化所述还原性糖类物质，以便得到待检测样品；以及
（4）采用高效液相色谱法，通过蒸发光散射检测器检测所述待测样品中的所述还原性糖类物质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述海藻生物质为选自海带、马尾藻、江蓠以及石花菜中的至少一种，
所述还原性糖类物质为选自海藻糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和甘露醇的至少一种。
3.根据权利2所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述样品粉末的粒度为177~840微米范围内，
其中，当所述海藻生物质为海带时，在进行粉碎之前，预先对其依次进行洗净、去盐和风干处理，
当所述海藻生物质为江蓠时，将其干燥后直接进行粉碎。
4.根据权利1所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述酸为浓度为1~3重量%的稀硫酸，所述水解处理是在110~130摄氏度下进行30~60分钟，并且所述稀硫酸与所述样品粉末的液固比为100：1~5。
5.根据权利1所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述水解处理是在110摄氏度下进行60分钟，并且在所述水解处理过程中施加微波进行辅助水解。
6.根据权利1所述的方法，其特征在于，在步骤（3）中，从所述水解液中纯化所述还原性糖类物质进一步包括：
对所述含有还原性糖类物质的水解液依次进行中和、离心去除沉淀、旋转蒸发、水提醇沉、离心去除沉淀和蒸发乙醇预处理，以便得到所述待检测样品。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述中和包括使用碳酸钙将所述水解液的pH值调节至7。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述旋转蒸发包括：
在55~65摄氏度的温度下，在100~200 mbar的真空度下，将所述水解液旋转蒸发至液态体积小于1 mL，以便得到浓缩液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于， 所述水提醇沉包括：
向经过所述旋转蒸发后得到的浓缩液中，加入95(v/v)%的乙醇，其中，所述浓缩液与所述乙醇的体积比为1：4~6。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蒸发光散射检测器的载气为氮气，漂移管温度为105℃，载气流速2.5 L/min，色谱柱为Benson BP-100Pb++碳水化合物分析柱，流动相为纯水，流速0.4 mL/min，以及进样量10 μL，柱温90℃。
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