CN110927286B - 一种枸杞多糖的掺杂鉴别及含量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及多糖检测技术领域，公开了一种枸杞多糖的掺杂鉴别及含量检测方法，步骤包括，对枸杞进行脱脂、热水浸提和醇沉；用超纯水溶解定容，并混匀过滤；加入复合糖化酶进行酶解，将霉解液中加入无水乙醇，离心，取沉淀加水溶解，过滤；进行水解及衍生反应，得到进样液；对进样液进行色谱分析，通过测量半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖和氨基葡萄糖的峰面积百分比，进行掺杂鉴别；通过测量半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖和氨基葡萄糖的峰面积百分比得到枸杞多糖总百分比，乘以M1和校正系数0.9后得到枸杞多糖的含量。本发明能够准确的鉴别出枸杞多糖提取物是否掺杂有糊精或者可溶性淀粉，并能够对准确测定掺杂枸杞多糖提取物样品中枸杞多糖的实际含量。

Description

一种枸杞多糖的掺杂鉴别及含量检测方法

技术领域

本发明涉及多糖检测技术领域，尤其涉及一种枸杞多糖的掺杂鉴别及含量检 测方法。

背景技术

枸杞多糖是我国传统中药枸杞子中的重要生物活性成分，具有调节机体免疫 力、抗氧化、保护神经、降血糖、抗肿瘤等多种生理功效。因此，近年来作为功 能性食品配料的枸杞多糖产品的开发和应用发展较快。

然而，由于目前对枸杞多糖的检测尚缺乏有效的质量检测方法和完善的质量 标准，同时因干燥等工艺的需要，或不排除人为故意掺杂以求较高的多糖含量和 价格，导致目前枸杞多糖产品中往往会掺入较多的麦芽糊精(或可溶性淀粉淀 粉)。现有相关文献的定性定量方法尚不适用于该类产品，即I-KI试剂难以准确 鉴别颜色较深的枸杞多糖产品中是否掺有糊精或淀粉，测定多糖含量的醇沉-苯 酚硫酸法不能完全排除糊精干扰，因而已有的相关标准难以客观鉴别和评价该类 产品质量，其掺杂产品有可能给企业用户和广大消费者带来不应有的利益损失。

近年来，随着人们对食品质量真实性检测技术的日益重视，有研究者根据多 糖水解物中葡萄糖的相对比例推测枸杞多糖样品可能掺有糊精，但目前的这个方 法尚不能确证是否掺杂，且不能准确测定掺杂枸杞样品中枸杞多糖的实际含量。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种枸杞多糖的掺杂鉴别及含量检测方法， 能够准确的鉴别出枸杞多糖提取物是否掺杂有糊精或者可溶性淀粉，并能够对准 确测定掺杂枸杞多糖提取物样品中枸杞多糖的实际含量。

本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

一种枸杞多糖的掺杂鉴别及含量检测方法，包括以下步骤，

A1、对枸杞进行多糖提取，包括脱脂、热水浸提、醇沉和干燥，得到枸杞多 糖粗品，称重得到M1；

A2、将枸杞多糖粗品用超纯水溶解，并混匀、过滤，得到预检液；

A3、在预检液中加入复合糖化酶进行酶解，霉解后杀酶得到霉解液，将霉解 液中加入无水乙醇，振摇后静置，离心，取沉淀加水溶解，过滤后得到多糖水溶 解液；

A4、将多糖水溶解液进行水解及衍生反应，得到进样液；

A5、对进样液进行色谱分析，通过测量半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖和氨基葡 萄糖的峰面积百分比，进行掺杂鉴别；

A6、通过测量半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖和氨基葡萄糖的峰面积百分比得到 枸杞多糖总百分比，乘以M1和校正系数0.9后得到枸杞多糖的含量。

半乳糖、阿拉伯糖、氨基葡萄糖和葡萄糖这4个单糖是枸杞多糖中功能活性 较强的多糖级分的主要单糖组分，因此，半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖及氨基葡萄 糖4个单糖可看作是枸杞多糖中较重要的标志性糖组分，它们的反相色谱指纹特 征即峰面积相对比例可以作为枸杞多糖的重要质量指标，也可以用于鉴别真伪和 掺杂。

进一步，所述步骤A6中的校正系数为0.9。对于分子量不同的单糖聚合成 多糖的校正系数略有不同，但经比较发现，将所有单糖总含量乘以六碳糖的校正 系数0.9计算的结果与分别按枸杞中几种不同分子量单糖的校正系数计得的结 果非常相近，因此，对于单糖含量换算成枸杞多糖含量的校正系数按0.9计更准 确。

进一步，所述步骤A1中枸杞多糖的提取包括以下步骤：

所述步骤A1中枸杞多糖的提取包括以下步骤：

B1、脱脂：按质量份数，取100份枸杞粉碎，加入到300份的有机溶剂中脱 脂、过滤，将过滤后滤渣干燥，用质量浓度80％的乙醇300份回流得到残渣，将 残渣干燥；

B2、热水浸提：在步骤B1的残渣中加入90℃蒸馏水回流提取，收集得到 枸杞的多糖提取液，将多糖提取液进行抽滤，滤液进行减压浓缩，得到多糖水浓 提液；

B3、醇沉：将步骤B2中得到的多糖水浓提液置入无水乙醇中沉淀，抽滤后 得到滤饼，将滤饼分别以质量浓度95％的乙醇、无水乙醇和丙酮进行洗涤，再真 空干燥，得到枸杞多糖粗品。

进一步，所述步骤B1中有机溶剂为石油醚或者氯仿与石油醚混合溶剂。

进一步，所述步骤A4中的水解及衍生反应包括以下步骤：

C1、取100μL质量浓度为4-5g/L的多糖水溶解液于5mL的具塞刻度试管 中，加入100μL的4mol/L的TFA，充N₂封管，于110℃烘箱中水解2h；

C2、冷却后加200mL甲醇，再用N₂吹干，重复加200mL甲醇并用N₂吹3次， 去除TFA；

C3、加入50μL 0.3mol/L NaOH溶液充分溶解残渣，再加50μL、0.5mol/L 的PMP甲醇溶液，漩涡混匀，在70℃的烘箱中反应100min；

C4、冷却后中和、萃取，并用微孔膜过滤，其滤液用微孔过滤膜过滤后，得 到进样液。

进一步，所述步骤C4中，所述中和步骤为：加50μL0.3 mol/L的HCL中和， 所述萃取步骤为：加50μL0.3 mol/L的HCL中和，加水至1mL，再加等体积的 氯仿，振摇，静置，弃去氯仿相；所述萃取次数为3次。

进一步，所述步骤A5中，进行掺杂鉴别的方法为：半乳糖、阿拉伯糖和氨 基葡萄糖的峰面积相对百分比均分别小于7％、14％和0.60％，且葡萄糖相对百分 比大于63％，则判定掺杂有糊精或可溶性淀粉。经分析，半乳糖、阿拉伯糖、葡 萄糖和氨基葡萄糖4个标志性单糖组分的峰面积百分比测定的最大相对标准偏 差为1.80～5.13，由此可见，枸杞多糖和待测样品的单糖组分比例测定误差之 和至多为10％，因此，若样品中半乳糖、阿拉伯糖和氨基葡萄糖三者峰面积相对 百分比较上述正常值范围的下限值均低10％以上，即均分别小于7％、14％和 0.60％，且葡萄糖相对百分比比上述正常值范围的上限值高10％以上，即大于63％， 则该待检测的枸杞样品极有可能掺有糊精或可溶性淀粉。

进一步，将枸杞经步骤A1和A2处理后，直接将预检液利用步骤A4的色谱 分析，得到葡萄糖的峰面积百分比P2，若步骤A5中的葡萄糖百分比相较P2相 对比例降低比例大于等于10％，则判定掺杂有糊精或可溶性淀粉。

在待检测的枸杞中，若葡萄糖相对比例减少10％以上(通常糊精或可溶性淀 粉的掺杂比例一般至少10％以上)，或大幅度降低至正常值范围内，则可确证该 样品肯定是掺有糊精或可溶性淀粉。因为，未掺杂的枸杞多糖样品经酶解、醇沉 后再酸水解和PMP衍生化后的HPLC分析结果显示，其单糖组成基本没有显著变 化，只有葡萄糖的峰面积相对比例有时会有少量的降低(不超过5％)，这是因 为未掺杂的枸杞多糖提取物中可能会含有很少量的、来自于枸杞自身的可被酶解 的淀粉类碳水化合物，酶解醇沉后这部分物质被除去，因而葡萄糖比例会稍有降 低。只有掺入糊精或可溶性淀粉的样品，经酶解并醇沉后，其中的葡萄糖相对比 例及整个多糖含量均会大幅度降低。

进一步，所述步骤A5中色谱分析的色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18柱、 流动相为0.1mol/L磷酸盐缓冲液和乙腈的混合液、柱温为30℃、检测波长为 250nm、流速为1mL/min、进样体积为20μL。

进一步，所述磷酸盐缓冲液与乙腈混合液的体积比为磷酸盐缓冲液：乙腈 ＝83:17。

本发明的有益效果：

本发明应用酶解和醇沉的方法去除糊精或可溶性淀粉的干扰，再将枸杞多糖 完全水解，并进行柱前PMP衍生化反相色谱分析，即可实现掺杂枸杞多糖提取物 产品的确证检测及其枸杞多糖实际含量的准确测定，该测定方法比起现有的苯酚 硫酸法，不仅在样品前处理方法上可以完全排除糊精或可溶性淀粉的干扰，且消 除了用葡萄糖作标品测定杂多糖含量的苯酚硫酸法固有的较大误差，因此，本发 明不仅能够准确的鉴别出枸杞是否掺杂有糊精或者可溶性淀粉，还能够对准确测 定掺杂枸杞样品中枸杞多糖的实际含量，枸杞中多糖的掺杂鉴别及含量检测更为 科学合理、准确可信。

附图说明

图1A为单糖标准样品枸杞多糖样品水解产物PMP柱前衍生化反相色谱指 纹图谱；

图1B为市售LBP11#样品枸杞多糖样品水解产物PMP柱前衍生化反相色谱 指纹图谱；

图1C为商用LBP 19#样品枸杞多糖样品水解产物PMP柱前衍生化反相色 谱指纹图谱；

图1D为自制LBP 4#样品枸杞多糖样品水解产物PMP柱前衍生化反相色谱 指纹图谱；

图2为6号自制样品平行测定的反相色谱指纹图谱(n＝4)；

图3A为市售17号样品酶解醇沉处理前单糖组成色谱图；

图3B为市售17号样品酶解醇沉处理后单糖组成色谱图；

图4A为自制1号样品酶解醇沉处理前单糖组成色谱图；

图4B为自制1号样品酶解醇沉处理后单糖组成色谱图。

具体实施方式

现以产至中国的6个省份10个不同地区的枸杞原料，以及市售的10个枸杞 样品进行掺杂鉴别及含量检测，其中6个省份10个不同地区的枸杞原料分别标 号为实施例1-10，市售的10个枸杞样品分别标号为实施例11-实20。

具体的试验如下：

其中试验中各试剂、材料与样品为：

单糖标准品：葡萄糖(Glc，纯度99％)、甘露糖(Man，纯度99％)、半乳糖(Gal, 纯度≥99％)均购于上海化学试剂公司；鼠李糖(Rha，纯度≥99％)、岩藻糖(Fuc， 纯度≥99％)、葡萄糖醛酸(GlcUA，纯度≥99％)、半乳糖醛酸(GalUA，纯度≥97％) 均为美国Sigma-Aldrich公司产品；木糖(Xyl，纯度98％)、氨基葡萄糖(GlcN， 纯度98％)、氨基半乳糖(GalN，纯度99％)均为美国Acros Organics公司产品； 核糖(Rib，纯度＞99.0％)、阿拉伯糖(Ara，纯度99％)均购于厦门星隆达生化试 剂有限公司；麦芽糊精(DE值为4-7)购于Sigma-Aldrich公司；复合糖化酶(其 中糖化酶活性≥10万u/mL,普鲁兰酶活性>1000u/mL)由江南大学分析测试中 心液相色谱室配制。

衍生化试剂：1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP),纯度99％(美国Acros Organics公司)；乙腈，HPLC级(美国Tedia公司)；三氟乙酸,纯度不低于99％(国 药集团化学试剂有限公司)。

步骤1、枸杞多糖的提取：

脱脂：取100g枸杞果实在55℃下真空干燥24h取出后粉碎；用石油醚 或者氯仿与石油醚体积比1:2的混合溶剂300mL在普通水浴回流装置中于60℃ 回流脱脂4h，本实施例优选石油醚，过滤后滤渣放烧瓶中重复回流1次，滤渣 风干；再将滤渣用80％的乙醇300mL回流4h，滤渣重复回流1次；乙醇回收， 残渣风干。

热水浸提：在残渣中加入15倍的蒸馏水在90℃条件下回流提取1.5h，重复 提取1次，收集2次得到的枸杞多糖提取液进行抽滤，合并滤液并进行减压浓缩 至约300mL。

醇沉及干燥：多糖水提液用其4倍体积的无水乙醇沉淀，并再水溶和4倍体 积的无水乙醇重复沉淀1次，抽滤后滤饼分别以95％乙醇、无水乙醇和丙酮进行 洗涤，再真空干燥，即得到枸杞多糖粗品。

模拟掺杂样品的的制备：

分别准确称取上述自制枸杞多糖提取物1.0g和DE值为4-7的麦芽糊精1.0 g于50mL容量瓶中，用超纯水溶解、定容并混匀，过滤后备用。

步骤2、样品预处理：

准确吸取待鉴别检测的样品溶液(浓度为20mg/mL左右)或模拟掺入糊精的 样液10mL于25mL具塞刻度管中，加入3μL的复合糖化酶，酶解3h，95-100℃ 水浴15分钟杀酶并冷却后，取8ml酶解液加入4倍体积无水乙醇，振摇后于4℃ 冷藏条件下静置4小时或过夜后离心，取沉淀加水溶解并定容至10mL，过滤后 用于后续分析。

对于自制样品，准确配成20mg/mL左右的水溶液并过滤后即可按照步骤3和 步骤4进行单糖组成分析及其含量测定。至于市售样品的掺杂鉴别初筛检测，可 同样直接配制成20mg/mL的样液并过滤后进行单糖组成分析；若结果疑为掺杂， 需用1.4方法进行酶解和醇沉，再按照步骤3和步骤4条件进行确证检测和含量 测定。

步骤3、样品水解及PMP柱前衍生化：

混合单糖标样的衍生反应：分别取100μL的混合单糖标准液(各单糖质量 浓度均为0.36g/L左右)与100μL的0.6mol/L NaOH溶液，置于1mL的具塞 试管中混合均匀；再取50μL的混合液于5mL的具塞试管中，加入50μL 0.5mol/L 的PMP甲醇溶液，漩涡混匀；在70℃的烘箱中反应100min；取出放置10min 冷却至室温；加50μL0.3mol/L的HCL中和；加水至1mL，再加等体积的氯仿， 振摇，静置，弃去氯仿相，如此萃取3次。将水相用0.45μm微孔膜过滤后供 HPLC进样分析。

样品水解及衍生反应：吸取100μL质量浓度为4-5g/L的多糖样品水溶液 于5mL的具塞刻度试管中，加入100μL的4mol/LTFA，充N₂封管，于110℃烘 箱中水解2h；冷却后打开盖，加200mL甲醇后用N₂吹干，如此重复加甲醇并用 N₂吹3次，去除TFA；加入50μL 0.3mol/LNaOH溶液充分溶解残渣，再加50 μL 0.5mol/L的PMP甲醇溶液，漩涡混匀，同样在70℃的烘箱中反应100min， 冷却后按混和标准溶液衍生方法同样中和、萃取，并用微孔膜过滤，其滤液用微 孔过滤膜过滤后供进样。

步骤4、进行色谱分析，色谱分析条件：色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18 柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：0.1mol/L磷酸盐(pH 6.7)缓冲液-乙腈 (体积比为83:17)；柱温：30℃；检测波长：250nm；流速：1mL/min；进样体 积：20μL。

对实施例1-实施例10，按照上述步骤1中的方法脱脂、水提和醇沉得到 10个自制枸杞多糖产品，再按照步骤3的方法进行水解和柱前PMP衍生化，根 据实验中的色谱条件对这10个多糖样品分别进行单糖组成检测，结果见表1 (核糖、岩藻糖和氨基半乳糖的峰面积百分比均小于1％，故未列入表中)和图1A- 图1D。由表1可见，10个自制未掺杂多糖样品的单糖组分中，葡萄糖、半乳糖 和阿拉伯糖是枸杞多糖组成中含量较高的3个主要的共有单糖组分，三者的峰 面积百分比(即占所有单糖总的峰面积的百分比，近似等于占总多糖摩尔百分比) 分别为6.00-56.59％、8.49-23.98和16.10-37.99。氨基葡萄糖的峰面积百分比为0.60-1.55％，将半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖及氨基葡萄糖4个单糖可看作 是枸杞多糖中较重要的标志性糖组分，它们的反相色谱指纹特征即峰面积相对 比例作为枸杞多糖的重要质量指标，也可以用于鉴别真伪和掺杂。

表1 10个自制枸杞多糖样品的单糖组成

表2 10个市售枸杞多糖样品的单糖组成

枸杞多糖产品的掺杂鉴别：如表2所示的10个市售枸杞多糖样品中，1-5 号样品的葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖及氨基葡萄糖的相对百分比均在上述枸杞 多糖的标志性单糖组分的正常范围内，而6-10号样品均远超出其范围，因此， 6-10号样品可能是掺杂产品。

按照步骤1、2、3的方法和条件，对自制的枸杞多糖样品(表1中的6#) 的单糖组成平行测定4次，其中半乳糖、阿拉伯糖和氨基葡萄糖4个标志性单 糖组分的峰面积百分比测定的最大相对标准偏差为1.80～5.13(图2)。由此 可见，表1中枸杞多糖样品(作为对照)和待测样品的单糖组分比例测定误差 之和至多为10％。因此，若样品中半乳糖、阿拉伯糖和氨基葡萄糖三者峰面积 相对百分比较上述正常值范围的下限值均低10％以上，即均分别小于7％、14％和 0.60％，且葡萄糖相对百分比比上述正常值范围的上限值高10％以上，即大于 63％，则该样品极有可能掺有糊精或可溶性淀粉。

为进一步确证枸杞多糖样品是否掺杂，将样品按步骤2方法进行酶解，使有 可能存在的糊精或可溶性淀粉酶解为葡萄糖，并用4倍无水乙醇使多糖沉淀分离 出来，再进行酸水解和PMP衍生化并作HPLC分析，若样品中葡萄糖相对比例减 少10％以上(通常糊精或可溶性淀粉的掺杂比例一般至少10％以上)，或大幅度 降低至正常值范围内(如图3A、图3B、图4A、图4B所示)，则可确证该样品 肯定是掺有糊精或可溶性淀粉。因为，未掺杂的枸杞多糖样品经酶解、醇沉后再 酸水解和PMP衍生化后的HPLC分析结果显示，其单糖组成基本没有显著变化(图 4A和图4B)，只有葡萄糖的峰面积相对比例有时会有少量的降低(不超过5％)， 这是因为未掺杂的枸杞多糖提取物中可能会含有很少量的、来自于枸杞自身的可被酶解的淀粉类碳水化合物，酶解醇沉后这部分物质被除去，因而葡萄糖比例会 稍有降低。只有掺入糊精或可溶性淀粉的样品，经酶解并醇沉后，其中的葡萄糖 相对比例及整个多糖含量均会大幅度降低。

枸杞多糖产品的含量测定：

本发明在上述鉴别掺杂方法的思路基础上，通过酶解和醇沉方法将枸杞多 糖分离出来，然后经酸水解和衍生化反应，并利用反相色谱法测定样品中所有 单糖含量，这样不仅可以根据上述4个标志性单糖组分相对比例变化，尤其是 葡萄糖含量的大幅降低确认样品掺杂，而且可以将酶解和醇沉处理后测定的枸 杞多糖中的各个单糖总含量，乘以校正系数0.9后得到枸杞多糖的含量。对于 分子量不同的单糖聚合成多糖的校正系数略有不同，但经比较发现，将所有单 糖总含量乘以六碳糖的校正系数0.9计算的结果与分别按枸杞中几种不同分子 量单糖的校正系数计得的结果非常相近。因此，为便于数据处理，对于单糖含 量换算成枸杞多糖含量的校正系数可统一按0.9计。表3即是按此方法测定的 部分样品中枸杞多糖含量与没有经酶解和醇沉处理，而是直接水解并衍生化后 应用反相色谱测定的结果比较。该表显示，3个未掺杂的样品中多糖含量两个 结果很接近，而掺杂的5个样品的2个含量结果相差很大，它们的枸杞多糖实 际含量比直接检测的结果或标签上的含量低的多。

验证上述测定枸杞多糖含量方法的可行性，取市售11号枸杞多糖样品，按 低、中高三个量添加12种单糖混合标样，经水解和衍生化后测定其加标回收率 分别为90.1％、88.3％和91.0％，平均回收率为89.8％。此外，平行取5份1号 自制枸杞多糖样品，按步骤2方法模似掺入麦芽糊精，再分别酶解和醇沉并分 别水解和衍生化后测定其中各单糖含量，并乘校正因子换算成多糖含量，其结 果的相对标准偏差(RSD)为3.48％。因此，本方法完全符合定量测定的要求。

表3部分样品的枸杞多糖含量测定结果

本发明采用多糖完全水解结合柱前PMP衍生化反相色谱分析的方法，根据正 常枸杞多糖提取物与其掺杂样品中的4个标志性单糖组分的相对比例的显著性 差异特征，可进行枸杞多糖产品的掺杂鉴别；若样品中半乳糖、阿拉伯糖和氨基 葡萄糖三者相对百分比比上述正常值范围的下限值低10％以上，即分别小于7％、 14％和0.60％，且葡萄糖相对百分比比上述正常值范围的上限值高10％以上，即 大于63％，则该产品极有可能掺有糊精或可溶性淀粉；应用酶解和醇沉的方法去 除糊精或可溶性淀粉的干扰，再将多糖完全水解，并利用柱前PMP衍生化反相色 谱法，即可实现掺杂枸杞多糖提取物产品的确证检测及其枸杞多糖实际含量的准 确测定。其方法加标平均回收率和相对标准偏差均符合定量测定要求。该方法不 仅可以消除样品中掺入的糊精或可溶性淀粉的影响，而且是利用每个单糖标品通 过外标法测定多糖中各个单糖组分含量之和，并乘以校正因子换算成多糖含量， 比起现有的苯酚流酸法，不仅在样品前处理方法上可以完全排除糊精或可溶性淀 粉的干扰，且消除了用葡萄糖作标品测定杂多糖含量固有的较大误差，其方法更 为科学合理、准确可信，对于枸杞多糖及其他类似植物源杂多糖类食品配料的质 量标准的制定和完善具有重要的参考意义。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对 本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术 方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵 盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均 为公知技术。

Claims (6)

1.一种枸杞多糖的掺杂鉴别方法，其特征在于：包括以下步骤，

A1、对枸杞进行多糖提取，包括脱脂、热水浸提、醇沉和干燥，得到枸杞多糖粗品，称重得到M1；

A2、将枸杞多糖粗品用超纯水溶解，并混匀、过滤，得到预检液；

A3、在预检液中加入复合糖化酶进行酶解，酶解后杀酶得到酶解液，将酶解液中加入无水乙醇，振摇后静置，离心，取沉淀加水溶解，过滤后得到多糖水溶解液；

A4、将多糖水溶解液进行水解及衍生反应，得到进样液；

A5、对进样液进行色谱分析，通过测量半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖和氨基葡萄糖的峰面积百分比，进行掺杂鉴别；

A6、通过测量半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖和氨基葡萄糖的峰面积百分比得到枸杞多糖总百分比，乘以M1和校正系数0.9后得到枸杞多糖的含量；

所述步骤A5中，进行掺杂鉴别的方法为：半乳糖、阿拉伯糖和氨基葡萄糖的峰面积相对百分比分别小于7％、14％和0.60％，且葡萄糖相对百分比大于63％，则初步判定掺杂有糊精或可溶性淀粉；

将枸杞经步骤A1和A2处理后，直接将预检液利用步骤A4的水解及衍生反应，再色谱分析，得到葡萄糖的峰面积百分比P2，若步骤A5中的葡萄糖百分比相较P2相对比例降低大于等于10％，则判定掺杂有糊精或可溶性淀粉；

所述步骤A1中枸杞多糖的提取包括以下步骤：

B1、脱脂：按质量份数，取100份枸杞粉碎，加入到300份的有机溶剂中脱脂、过滤，将过滤后滤渣干燥，用质量浓度80％的乙醇300份回流得到残渣，将残渣干燥；

B2、热水浸提：在步骤B1的残渣中加入90℃蒸馏水回流提取，收集得到枸杞的多糖提取液，将多糖提取液进行抽滤，滤液进行减压浓缩，得到多糖水浓提液；

B3、醇沉：将步骤B2中得到的多糖水浓提液置入无水乙醇中沉淀，抽滤后得到滤饼，将滤饼分别以质量浓度95％的乙醇、无水乙醇和丙酮进行洗涤，再真空干燥，得到枸杞多糖粗品。

2.根据权利要求1所述的一种枸杞多糖的掺杂鉴别方法，其特征在于：所述步骤B1中有机溶剂为石油醚或者氯仿与石油醚混合溶剂。

3.根据权利要求2所述的一种枸杞多糖的掺杂鉴别方法，其特征在于：所述步骤A4中的水解及衍生反应包括以下步骤，

C1、取100μL质量浓度为4-5g/L的多糖水溶解液于5mL的具塞刻度试管中，加入100μL的4mol/L的TFA，充N₂封管，于110℃烘箱中水解2h；

C2、冷却后加200mL甲醇，再用N₂吹干，重复加200mL甲醇并用N₂吹3次，去除TFA；

C3、加入50μL 0.3mol/L NaOH溶液充分溶解残渣，再加50μL、0.5mol/L的PMP甲醇溶液，漩涡混匀，在70℃的烘箱中反应100min；

C4、冷却后中和、萃取，并用微孔膜过滤，其滤液用微孔过滤膜过滤后，得到进样液。

4.根据权利要求3所述的一种枸杞多糖的掺杂鉴别方法，其特征在于：所述步骤C4中，所述中和步骤为：加50μL0.3 mol/L的HCL中和，所述萃取步骤为：加50μL0.3 mol/L的HCL中和，加水至1mL，再加等体积的氯仿，振摇，静置，弃去氯仿相；所述萃取次数为3次。

5.根据权利要求4所述的一种枸杞多糖的掺杂鉴别方法，其特征在于：所述步骤A5中色谱分析的色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18柱、流动相为0.1mol/L磷酸盐缓冲液和乙腈的混合液、柱温为30℃、检测波长为250nm、流速为1mL/min、进样体积为20μL。

6.根据权利要求5所述的一种枸杞多糖的掺杂鉴别方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液与乙腈混合液的体积比为磷酸盐缓冲液：乙腈＝83:17。

Images