CN102680607B - 一种基于指纹图谱的可可粉掺假检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于指纹图谱的可可粉掺假检测方法，为了建立可可粉掺假检测方法，采用超声辅助提取可可粉中多糖组分,利用硫酸水解及柱前PMP(1-苯基-3-甲基-吡唑啉酮)衍生化高效液相色谱法(HPLC)分析得到可可粉多糖组分的指纹图谱，根据共有特征峰的相对峰面积，应用系统聚类分析(HCA)法进行可可粉掺假鉴别试验。结果表明：掺入15%及以上可可壳的可可粉可以通过此方法予以鉴别。本方法稳定、精密度高、重现性好、易于掌握，能从色谱的整体特征面貌上把握可可粉多糖质量情况，为可可粉的质量控制和真伪鉴别提供了一种新的科学方法。

Description

一种基于指纹图谱的可可粉掺假检测方法

技术领域

本发明涉及一种基于指纹图谱的可可粉掺假检测方法，特别是一种通过构建多糖指纹图谱以判定可可粉是否掺假的方法。

背景技术

可可粉具有浓烈芬芳的独特香味,含有丰富的多酚、蛋白质、碳水化合物、可可脂等多种营养元素和活性成分，是制造巧克力的重要原料，也用于生产当今世界三大嗜好性饮料之一。上个世纪90年代中期以来，随着可可制品应用范围的日趋扩大，对外贸易的拓展,我国可可加工行业发展迅猛，与此同时，国内市场上大量劣质或假冒可可粉充斥市场，不仅严重危害了食品安全，也影响了我国的国际贸易信誉和正规可可加工厂家的利益。金永生等对可可粉中掺入大豆粕、芝麻粕、花生壳和板栗壳等几种外源植物源性成分的PCR检测方法进行了探索研究，建立的方法准确性易受杂质影响，不能鉴别可可壳粉这种主要的内源性掺假物；另外，可能添加的外源植物源性成分种类繁多，难以预料，实际操作中不可能对所有可能添加的外源植物源性成分逐个进行PCR检测，因此该方法有很大局限性，难以推广。为此，本发明首次针对目前常见的使用可可壳粉掺混可可粉的现象，尝试采用超声辅助提取可可粉中多糖组分,利用硫酸水解及柱前PMP(1-苯基-3-甲基-吡唑啉酮)衍生化高效液相色谱法(HPLC)分析得到可可粉多糖组分的指纹图谱，再根据共有特征峰的相对峰面积，应用系统聚类分析方法成功地对掺入可可壳的可可粉进行了分析鉴别。

本发明可为我国可可粉的质量检测方法和质量标准的提升及完善提供科学依据与参考，从而促进我国可可粉产品的质量提高和稳定，更好地规范可可粉市场，维护消费者权益。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种准确可靠且较简便，可推广应用于可可粉的掺假检测方法。本发明还同时提供了可可粉多糖的标准指纹图谱。

本发明的技术方案：

首先，构建可可粉多糖标准指纹图谱，包括可可粉多糖的提取、可可粉多糖的水解、可可粉多糖水解产物的PMP(1-苯基-3-甲基-吡唑啉酮)衍生化反应、高效液相色谱的指纹分析及其标准指纹图谱的确定；

然后，根据可可粉标准样品多糖单糖组成的测定方法，测定模拟掺假样品的多糖单糖组成；

最后，根据可可粉标准样品和模拟掺假样品多糖单糖组成的相对峰面积组成的矩阵，进行聚类分析。

本发明的具体步骤为：

1、可可粉多糖指纹图谱的建立方法包括下列步骤：

⑴可可粉多糖的提取：称取经过索氏提取去脂的残渣700mg，置于50ml离心管中，加入25ml 80%乙醇超声提取两次，每次15min。离心（5000rmp，5min）后沉淀用无水乙醇20ml洗涤，离心，去上清液，沉淀放入培养皿中于烘箱50℃条件下干燥。称取400mg的干燥粉末，加入pH 8.0的0.2mol/L磷酸盐缓冲液40ml，碱性蛋白酶Alcalase加酶量为5500（U/g），50℃酶解4h。100℃灭酶10min后加入3倍体积的无水乙醇，4℃过夜。离心（5000rpm，5min）弃上清，沉淀中再加80%乙醇，超声5min，用手振摇2min，静置，离心。沉淀用无水乙醇洗涤20ml，干燥，即得粗多糖。

⑵可可粉多糖的水解：称取粗多糖100mg，加入72%H₂SO41ml,30℃水解1h，然后稀释至2M，100℃，水解2h，水解液中加一定体积的水，用BaCO₃中和（中和至加入BaCO3后不再产生气泡，且pH为7.0），离心，上清液过滤并用水定容至5ml，备用于下述PMP衍生化。

⑶可可粉多糖水解产物的衍生化：取100μL的可可粉多糖水解产物与100μL的0.6mol/LNaOH溶液，置于1mL的离心管中混合均匀；再取50μL的混合液于5mL的具塞试管中，加50μL0.5mol/L的PMP(0.4355g/5mL)甲醇溶液，漩涡混匀；在70℃水浴锅中反应40min，取出放置10min冷却至室温，加60μL 0.3mol/L的HCl中和，加水至1mL，再加等体积的氯仿，振摇，静置，弃去氯仿相，如此萃取3次。将水相用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析。

⑷PMP衍生化产物的高效液相色谱分析:色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18(250mm×4.6mmi.d.，5μm)；流动相：0.1mol/L磷酸盐（PH 6.7）缓冲液/乙腈，体积比为83:17；柱温：30℃；检测波长：250nm；流速：1.0ml/min；进样体积:20μL。在此条件下分别进样分析单糖混合标样及样品的PMP衍生化产物，得到混合标样的色谱图和可可粉多糖的色谱指纹图谱。以葡萄糖峰为参照，计算标样和样品中各峰的相对保留时间；根据标样和样品的相对保留时间对照定性可可粉多糖样品的相关色谱峰；并以峰面积归一化法计算样品图谱各峰的相对峰面积。

⑸标准指纹图谱的建立：通过对11个不同产地的可可粉样品中多糖成分水解产物的PMP衍生物的高效液相色谱图进行比较，确定共有特征峰，并将色谱数据导入指纹图谱专用软件得到由其共有特征峰构成的可可粉多糖的标准色谱指纹图谱。待测样品可与标准指纹图谱对比，区别其异同。

共有特征峰有12个，它们的相对保留时间RT(以葡萄糖峰为参照)的相对标准偏差RSD均小于1%;即:

1号峰平均RT为0.476，RSD为0.33%;

2号峰平均RT为0.602，RSD为0.16%;

3号峰平均RT为0.625，RSD为0.27%;

4号峰平均RT为0.669，RSD为0.31%;

5号峰平均RT为0.722，RSD为0.08%;

6号峰平均RT为0.793，RSD为0.06%;

7号峰平均RT为0.817，RSD为0.09%;

8号峰平均RT为1.000，RSD为0.08%;

9号峰平均RT为1.141，RSD为0.02%;

10号峰平均RT为1.223，RSD为0.05%;

11号峰平均RT为1.265，RSD为0.00%;

12号峰平均RT为1.490，RSD为0.36%;

其中超过总峰面积3%的指纹峰有4个，分别为:8号峰，相对峰面积63.2717%~71.9423%;9号峰，相对峰面积8.7631%~11.5081%;10号峰，相对峰面积3.0136%~4.3225%;11号峰，相对峰面积8.5537%~11.2242%。

1号峰，甘露糖（Man）；2号峰，氨基葡萄糖（GlcN）；3号峰，核糖（Rib）；4号峰，鼠李糖（Rham）；5号峰，葡萄糖醛酸（GlcUA），8号峰，葡萄糖（Glc）；9号峰，半乳糖（Gal）；10号峰，木糖（Xyl）；11号峰，阿拉伯糖糖（Ara）；12号峰，岩藻糖（Fuc）。这些单糖均依据权利要求2步骤A4所述与可可粉样品分析同样的色谱条件测定的单糖混合标准溶液的PMP衍生物的保留时间对照定性；单糖混合标准溶液的PMP衍生化反应操作同权利要求2步骤A3所述，将“取步骤A2水解后的水解产物”改为“取单糖混合标准溶液”，该单糖混合标准溶液中各种单糖浓度均配制为4mg/mL。

2、聚类分析

本发明选择组间距离（Between-groups linkage）作为聚类方法、欧氏距离平方法(SquaredEuclidean Distance)作为测量距离方法进行聚类分析。8号共有指纹峰较稳定，峰面积百分比约70%，且与邻近峰分离较好，保留时间较居中，因此设定8号峰为参照峰。然后，应用12个共有特征峰的相对峰面积（以8号峰作为参照峰）组成的矩阵进行聚类分析。

本发明建立了可可粉的多糖水解物的HPLC指纹图谱，其相似度均在0.995以上。应用可可粉多糖水解物的HPLC指纹图谱的12个共有特征峰的相对峰面积组成的矩阵，以系统类聚法对掺入可可壳的可可粉进行分析，可以鉴别出掺入可可壳达到15%及15%以上的掺假可可粉。本方法稳定可靠，重复性好，可应用于可可粉的掺假检测。

附图说明

图1：12种单糖-PMP衍生物的HPLC图谱；

图2：11个产地可可粉多糖的HPLC指纹图谱；

各峰保留时间(min)分别为：1号峰-17.399；2号峰-21.991；3号峰-22.833；4号峰-24.425；5号峰-26.386；6号峰-28.981；7号峰-29.862；8号峰-36.535；9号峰-41.69；10号峰-44.674；11号峰-46.223；12号峰-54.438。

图3：11个产地可可粉标准样品和模拟掺假可可粉样品的聚类分析树状图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。

实施例1：基于多糖组分色谱指纹图谱聚类分析的可可粉掺假鉴别

1、仪器、样品及试剂

1.1仪器

Agilent1100高效液相色谱仪，包括G1311A四元泵，G1315B DAD检测器，G1313A自动进样器，G1379A在线脱气机，G1316A柱温箱，Agilent1100化学工作站(美国Agilent公司)；Beckman J-26xp高速冷冻离心机。

1.2样品及试剂

11批不同来源的可可粉样品和7批不同来源的可可壳样品均由无锡质量监督检验所局采集。

单糖对照品：鼠李糖(Rham，≥99%)、岩藻糖(Fuc，≥99%)、葡萄糖醛酸(GlcUA，≥99%)、半乳糖醛酸(GalUA，≥97%)均为美国Sigma-Aldrich公司产品；葡萄糖(Glc，99%)、甘露糖(Man，99%)、半乳糖(Gal，≥99%)均购于上海化学试剂公司;核糖(Rib，>99.0%)、阿拉伯糖(Ara，99%)均购于厦门星隆达生化试剂有限公司；木糖(Xyl，98%)、氨基半乳糖(GalN，99%)均为美国AcrosOrganics公司产品；盐酸氨基葡萄糖(GlcN，100%)为上海佳格食品有限公司。

衍生化试剂:1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP),纯度99%(美国Acros Organics公司);乙醇、三氯甲烷、硫酸、盐酸、氢氧化钠均为分析纯；乙腈、甲醇均为色谱纯。

2、可可粉多糖的提取

称取经过索氏提取去脂的残渣700mg，置于50ml离心管中，加入25ml 80%乙醇超声提取两次，每次15min。离心（5000rmp，5min）后沉淀用无水乙醇20ml洗涤，离心，去上清液，沉淀放入培养皿中于烘箱50℃条件下干燥。称取400mg的干燥粉末，加入pH 8.0的0.2mol/L磷酸盐缓冲液40ml，碱性蛋白酶Alcalase加酶量为5500（U/g），50℃酶解4h。100℃灭酶10min后加入3倍体积的无水乙醇，4℃过夜。离心（5000rpm，5min）弃上清，沉淀中再加80%乙醇，超声5min，用手振摇2min，静置，离心。沉淀用无水乙醇洗涤20ml，干燥，即得粗多糖。

3、可可粉多糖的酸水解

称取粗多糖100mg，加入72%H₂SO41ml,30℃水解1h，然后稀释至2M，100℃，水解2h，水解液中加一定体积的水，用BaCO₃中和（中和至加入BaCO3后不再产生气泡，且pH为7.0），离心，上清液过滤并用水定容至5ml，备用于下述PMP衍生化。

4、可可粉多糖酸水解产物的PMP衍生化反应操作

取100μL的可可粉多糖水解产物（或混合单糖标样）与100μL的0.6mol/LNaOH溶液，置于1mL的离心管中混合均匀；再取50μL的混合液于5mL的具塞试管中，加50μL0.5mol/L的PMP(0.4355g/5mL)甲醇溶液，漩涡混匀；在70℃水浴锅中反应40min，取出放置10min冷却至室温，加60μL 0.3mol/L的HCl中和，加水至1mL，再加等体积的氯仿，振摇，静置，弃去氯仿相，如此萃取3次。将水相用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析。

5、PMP衍生化产物的高效液相色谱分析

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18(250mm×4.6mmi.d.，5μm)；流动相：0.1mol/L磷酸盐（PH 6.7）缓冲液/乙腈，体积比为83:17；柱温：30℃；检测波长：250nm；流速：1.0ml/min；进样体积:20μL。

在此条件下分别进样分析单糖混合标样及样品的PMP衍生化产物，得到混合标样色谱图和可可粉多糖样品的指纹谱图，见附图2。以葡萄糖峰为参照，计算标样和样品中各峰的相对保留时间；根据标样和样品的相对保留时间对照定性可可粉多糖样品的相关色谱峰；并以峰面积归一化法计算样品图谱各峰的相对峰面积。

6、标准指纹图谱的建立及共有指纹峰特征

通过11个不同产地的可可粉样品中的多糖成分水解产物的PMP衍生物的高效液相色谱测定，比较其色谱图，确定共有特征峰12个，共有峰的相对保留时间RT(以葡萄糖峰为参照)的相对标准偏差RSD均小于1%；其中超过总峰面积3%的指纹峰有4个，分别为：8号峰，相对峰面积63.2717%~71.9423%；9号峰，相对峰面积8.7631%~11.5081%；10号峰，相对峰面积3.0136%~4.3225%；11号峰，相对峰面积8.5537%~11.2242%。

可可粉多糖的标准指纹图谱如图2所示。

7、聚类分析

聚类分析是将分类对象置于一个多维空间中直接比较各事物之间的性质，将性质相近的归为一类，使同一类的事物具有高度的相似性。本文选择组间距离（Between-groups linkage）作为聚类方法、欧氏距离平方法(Squared Euclidean Distance)作为测量距离方法进行聚类分析。8号共有指纹峰较稳定，峰面积百分比约70%，且与邻近峰分离较好，保留时间较居中，因此设定8号峰为参照峰。然后，应用以8号峰作为参照峰的12个共有特征峰的相对峰面积组成的矩阵进行聚类分析（如附图3所示）。其中，S1—S11表示11批可可粉，K1-K7表示7批可可壳，H1—H8表示分别掺入10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、80%可可壳的可可粉。由聚类分析树状图可见，分3类时，S1-S11和H1为一类，H2-H8为另一类。因此，当可可粉中掺入10%或10%以下的可可壳时不能鉴别，但当掺入15%及15%以上可可壳时，应用本方法可以检出。

8、色谱分析精密度

取经提取、水解和衍生化处理后的11号可可粉多糖样品溶液，连续进样5次，对各共有峰的相对保留时间（以葡萄糖的保留时间为参照）和相对峰面积进行统计。结果表明，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，相对标准偏差（RSD）<2.60%，表明可可粉多糖的色谱指纹分析精密度试验符合要求。

9、方法重复性

分别准确称取11号可可粉样品5份，按照上述提取、水解和衍生化方法平行处理样品，并在同样的上述色谱条件下进行HPLC分析，分别对共有峰的相对保留时间及相对峰面积进行统计，它们的平均值及相对标准偏差（RSD）见表1。相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%。

表1:重复性实验结果（n=5）

10、方法稳定性试验

取经提取、水解和衍生化处理后的11号可可粉多糖样品溶液在室温下(18℃左右)保存，分别于0，5，10，15，20，25h进样分析，对各共有峰的相对保留时间（以葡萄糖的保留时间为参照）和相对峰面积进行统计。结果显示，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，RSD均小于4%。

以上试验显示，上述指纹图谱测定方法精密、稳定、可靠。

Claims (3)

1.一种基于指纹图谱的可可粉掺假检测方法，其特征在于，包括步骤：

1）构建可可粉标准品多糖标准指纹图谱，首先提取可可粉标准品多糖、对可可粉标准品多糖进行水解，随后进行可可粉标准品多糖水解产物的PMP衍生化反应、高效液相色谱的指纹分析，最终按照获得的结果绘制可可粉标准品多糖标准指纹图谱；

2）采用步骤1）中可可粉标准样品多糖组成的测定方法，测定实际送样可可粉的多糖组成；

3）将步骤2）获得的结果与步骤1）中的标准指纹图谱进行相对峰面积组成的矩阵，进行聚类分析；

可可粉多糖的提取方法为:

称取经过索氏提取去脂的残渣700mg，置于50ml离心管中，加入25ml80%乙醇超声提取两次，每次15min；5000rmp，离心5min后沉淀用无水乙醇20ml洗涤，离心，去上清液，沉淀放入培养皿中于烘箱50℃条件下干燥；称取400mg的干燥粉末，加入pH8.0的0.2mol/L磷酸盐缓冲液40ml，碱性蛋白酶Alcalase加酶量为5500U/g，50℃酶解4h；100℃灭酶10min后加入3倍体积的无水乙醇，4℃过夜；5000rmp，离心5min后弃上清，沉淀中再加80%乙醇，超声5min，用手振摇2min，静置，离心；沉淀用无水乙醇洗涤20ml，干燥，即得粗多糖；

可可粉多糖的水解方法为:

称取粗多糖100mg，加入72%H₂SO₄1ml,30℃水解1h，然后稀释至2M，100℃，水解2h，水解液中加一定体积的水，用BaCO₃中和至不再产生气泡、pH为7.0为止，离心，上清液过滤并用水定容至5ml，备用于下述PMP衍生化；

可可粉多糖水解产物的PMP衍生化反应:

取100μL的可可粉多糖水解液与100μL的0.6mol/LNaOH溶液，置于1mL的离心管中混合均匀；再取50μL的混合液于5mL的具塞试管中，加50μL0.5mol/L的PMP甲醇溶液，漩涡混匀；在70℃水浴锅中反应40min，取出放置10min冷却至室温，加60μL0.3mol/L的HCl中和，加水至1mL，再加等体积的氯仿，振摇，静置，弃去氯仿相，如此萃取3次；将水相用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析；

高效液相色谱的指纹分析参数为:

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，250mm×4.6mmi.d.，5μm；流动相：PH6.7的0.1mol/L磷酸盐缓冲液/乙腈，体积比为83:17；柱温：30℃；检测波长：250nm；流速：1.0ml/min；进样体积:20μL；在此条件下进样分析步骤(3)过滤后的PMP衍生化产物，得到可可粉多糖的高效液相色谱指纹图谱；

标准指纹图谱的确定:

通过11个不同产地的可可粉样品中的多糖水解产物的PMP衍生物的高效液相色谱测定，比较其色谱图，确定共有12个特征峰；所述共有特征峰以葡萄糖峰为参照的相对保留时间RT的相对标准偏差RSD均小于1%。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述特征峰分别为甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖糖、岩藻糖。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中聚类分析选择组间距离作为聚类方法、欧氏距离平方法作为测量距离，以12个共有特征峰的相对峰面积组成的矩阵进行聚类分析，其中8号峰作为参照峰。

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