CN102645504B - 一种灵芝孢子粉多糖离子色谱指纹图谱的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种灵芝孢子粉多糖离子色谱指纹图谱的构建方法，包括灵芝孢子粉多糖的酸-酶部分水解及其水解产物单、寡糖组分的离子色谱指纹分析与标准指纹图谱的确定。通过对20个不同产地的灵芝孢子粉样品的多糖成分的HPAEC分析及其指纹图谱的比较，确定了其共有指纹特征，分别得到单、寡糖组分的标准指纹图谱，确定了单糖图谱中的11个单糖共有特征峰，以及寡糖图谱中的4个寡糖共有峰和1个多糖峰。本方法稳定、精密度高、重现性好、易于掌握，能从反映孢子粉多糖组成和结构特征的酸-酶部分水解产物的单糖组分与寡糖组分指纹图谱两个方面把握灵芝孢子粉多糖质量情况及产地来源，为灵芝孢子粉的质量控制和真伪鉴别提供了一种新的科学方法。

Description

一种灵芝孢子粉多糖离子色谱指纹图谱的构建方法

技术领域

本发明涉及一种灵芝孢子粉多糖的离子色谱指纹图谱的构建方法，属于中药及其制品和功能食品原料及其制品的指纹图谱技术领域。

背景技术

灵芝是属于真菌门，担子菌纲，多孔菌科，灵芝科，灵芝属的真菌。我国药典规定可入药的灵芝有赤芝[Ganoderma lucidum（Leyss.exFr）Karst.]和紫芝（Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang）；国家食品药品监督管理局公布的可用于保健食品的灵芝品种有赤芝、紫芝和松衫灵芝（Ganoderma tsugae Murr）。灵芝孢子（Ganoderma lucidum spore）是灵芝(一般为赤芝)成熟期从菌盖弹射出来的极其微小的卵形生殖细胞，生物学上称孢子，集中起来后呈粉末状，通称灵芝孢子粉。灵芝孢子具有免疫调节、抗肿瘤、调节血脂、降血糖等多种生理功效，故在近年来其市场甚为火热。但因缺乏科学全面的检测方法和质量标准，灵芝孢子粉及其加工产品的质量良莠不齐，难以有效控制和鉴别。目前已有灵芝孢子脂溶性成分指纹图谱分析方法的专利，也已有本专利申请人关于灵芝孢子粉水溶性成分即多糖的水解物的柱前PMP衍生-反相HPLC指纹图谱的专利及其分析方法的研究论文的报道。但柱前PMP衍生-反相HPLC指纹图谱的专利方法由于仅使用酸水解，水解选择性单一，加之PMP衍生-反相HPLC分析中寡糖组分的检测灵敏度不高，故该法指纹图谱中反映结构特性的寡糖组分信息不够丰富。因此，故本专利拟将酸水解和酶水解结合进行，再对得到的单糖组分和多糖组分分别分析，综合两个部分的分析结果以更灵敏、更全面地表征灵芝多糖及灵芝孢子粉产品的特征和差异，为我国灵芝孢子粉的质量检测方法和质量标准的提升及完善进一步提供科学依据与参考。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵芝孢子粉多糖离子色谱指纹图谱的构建方法，借此可将灵芝孢子粉多糖离子色谱指纹图谱作为灵芝孢子粉类产品的质量控制和真伪鉴别的主要指标之一。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：提取灵芝孢子粉多糖后，采用酸-酶部分水解灵芝孢子粉多糖，最后通过离子色谱分析构建水解产物中单、寡糖组分的标准指纹图谱。

本发明的技术方案具体包括下列步骤：

（1）灵芝孢子粉多糖的提取：

对于破壁孢子粉，准确称取样品0.5-1.0g于50mL离心管中，加入30mL超纯水，于水浴60-80℃功率300瓦超声30-60min，冷却后离心，残渣用少量超纯水洗涤并离心后，将两次上清液合并，合并后的上清液置于透析袋中用超纯水透析12小时，50-60℃真空浓缩近干，加超纯水溶解并定容至5mL作为粗多糖水溶液待测；

对于未破壁孢子粉，称取5g左右的样品于研钵中，研磨10min后准确称取其样品0.5-1.0g于50mL离心管中，加入30mL超纯水，于水浴60-80℃功率300瓦超声30-60min，后续操作同上。

（2）灵芝孢子粉多糖的酸-酶部分水解：

吸取500μL步骤（1）所得的粗多糖水溶液，加入500μL 1-3mol/L的H₂SO₄溶液，漩涡混匀，于80-100℃酸水解1-3h，冷却至室温，用碳酸钡中和，12000r/min离心15min。取其上清液100μL，加入酵母裂解酶溶液（100u/mg）50μL，再用0.05mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 6.5）补加至反应体积为1mL。于45℃下反应12h。酶解液100℃加热5min，终止反应。12000r/min离心30min，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，其滤液用于下步离子色谱分析。

（3）灵芝孢子粉多糖部分水解产物的离子色谱指纹分析：

针对酸-酶水解物中的单糖组分，离子色谱分析条件为：色谱柱：CarboPac PA-20，包括分析柱（3×150mm）和保护柱（3×50mm）；脉冲安培电化学检测器ED40；金工作电极；Ag/AgCl参比电极；四电位波形；流速：0.5mL/min；进样体积：20μL；柱温：30℃；流动相：A(水)-B(0.25mol/L NaOH溶液)-C(1mol/LNaAc溶液)，三元梯度洗脱：0~21min,97.6%A,2.4%B,0%C;21.1min,92.6%A,2.4%B,5.0%C;30min,77.6%A,2.4%B,20%C;30.1~50min,20%A,80%B,0%C.

针对酸-酶水解物中的寡糖组分，离子色谱分析条件为：色谱柱：CarboPac PA-200，包括分析柱（3×150mm）和保护柱（3×50mm）；脉冲安培电化学检测器ED40；金工作电极；Ag/AgCl参比电极；四电位波形；流速：0.5mL/min；进样体积：20μL；柱温：30℃；流动相：A(水)-B(0.25mol/LNaOH溶液)-C(1mol/LNaAc溶液)，三元梯度洗脱：0min,57.6%A,38.4%B,4.0%C;40min,36%A,24%B,40%C;40.1~60min,57.6%A,38.4%B,4.0%C.

（4）标准指纹图谱的确定：

通过20个不同产地的灵芝孢子粉样品中的多糖酸-酶水解产物中单、寡糖组分的离子色谱测定，运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”，分别构建了灵芝孢子粉多糖水解物中单糖组分和寡糖组分的HPAEC标准指纹图谱，并确定了单糖图谱中的11个单糖共有特征峰，以及寡糖图谱中的4个寡糖共有峰和1个多糖峰。单糖峰的相对保留时间RT(以葡萄糖峰为参照)和寡糖的相对保留时间RT(以五糖峰为参照）的相对标准偏差RSD均小于2%，即：

单糖指纹图谱中：

1号峰平均RT为0.314，RSD为0.62%；

2号峰平均RT为0.611，RSD为0.92%；

3号峰平均RT为0.643，RSD为1.64%；

4号峰平均RT为0.689，RSD为0.19%；

5号峰平均RT为0.775，RSD为0.35%；

6号峰平均RT为0.880，RSD为0.20%；

7号峰平均RT为1.000，RSD为0%；

8号峰平均RT为1.180，RSD为0.32%；

9号峰平均RT为1.219，RSD为0.32%；

10号峰平均RT为2.603，RSD为1.24%；

11号峰平均RT为2.695，RSD为1.19%；

寡糖指纹图谱中：

1号峰平均RT为0.691，RSD为0.56%；

2号峰平均RT为1.000，RSD为0%；

3号峰平均RT为1.321，RSD为1.00%；

4号峰平均RT为1.342，RSD为1.04%；

5号峰平均RT为3.276，RSD为1.51%；

其中单糖峰中超过总峰面积5%的指纹峰有3个，分别为：6号峰半乳糖，相对峰面积12.29%-29.88%；7号峰葡萄糖，相对峰面积49.01%-73.63%；9号峰甘露糖，相对峰面积7.40%-15.42%。寡糖指纹图谱中5号峰占总峰面积5.79%-26.77%。

通过对对单糖组分进行离子色谱分析，得到的11个共有特征峰分别对应岩藻糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、氨基半乳糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸；这些糖均依据与灵芝孢子粉样品分析同样的色谱条件下测定的单糖混合标准溶液的保留时间对照定性。寡糖指纹图谱中的5个共有特征峰则依据与灵芝孢子粉样品的寡糖分析同样色谱条件下测定的菊粉对照品中不同聚合度糖组分色谱峰的保留时间对照定性，这5个共有特征峰分别确定为三糖、五糖、六糖、七糖和多糖。

本发明提供的灵芝孢子粉多糖离子色谱指纹图谱的构建方法，具有方法稳定、精密度高、重现性好，易于掌握的特点。作为一种生物大分子的分析方法，避免了传统方法因必须进行多步分离纯化和多种波谱手段分析而带来的耗时、费力、成本高、无法快速检测的缺陷。

附图说明

图112种单糖混合标样的HPAEC图谱

各个峰分别为：1-Fuc,2-GlcN,3-Rham,4-Ara,5-GalN,6-Gal,7-Glc,8-Xyl,9-Man,10-Rib,11-GalUA,12-GlcUA

图2菊粉的HPAEC图谱

峰1-二糖，2-三糖，3-四糖，4-五糖，5-六糖，6-七糖，7-八糖，8-九糖，9-十糖

图320个灵芝孢子粉多糖样品酸-酶水解物单糖组分的HPAEC指纹图谱

图4灵芝孢子粉多糖的酸-酶水解物单糖组分的HPAEC标准指纹图谱

共有特征峰分别为：1-Fuc,2-GlcN,3-Rham,4-Ara,5-GalN,6-Gal,7-Glc,8-Xyl,9-Man,10-GalUA,11-GlcUA

图520个灵芝孢子粉多糖样品酸-酶水解物寡糖组分的HPAEC指纹图谱

图6灵芝孢子粉多糖的酸-酶水解物寡糖组分的HPAEC标准指纹图谱

共有特征峰分别为：1-三糖，2-五糖，3-六糖，4-七糖，5-多糖

图7吉林某产地破壁灵芝孢子粉样品的多糖离子色谱指纹图谱

图7（1）为吉林某产地破壁灵芝孢子粉样品的多糖中单糖组分的离子色谱指纹图谱，其中1-Fuc,2-GlcN,3-Rham,4-Ara,5-GalN,6-Gal,7-Glc,8-Xyl,9-Man,10-GalUA,11-GlcUA

图7（2）为该样品的多糖中寡糖组分的离子色谱指纹图谱，其中2-三糖，5-五糖，9-六糖，10-七糖，14-多糖

图8安徽某产地破壁灵芝孢子粉样品的多糖离子色谱指纹图谱

图8（1）为安徽某产地破壁灵芝孢子粉样品的多糖中单糖组分的离子色谱指纹图谱，其中1-Fuc,2-GlcN,3-Rham,4-Ara,5-GalN,6-Gal,7-Glc,8-Xyl,9-Man,10-GalUA,11-GlcUA

图8（2）为该样品样品的多糖中寡糖组分的离子色谱指纹图谱，其中2-三糖，5-五糖，9-六糖，10-七糖，14-多糖

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。

实施例1、灵芝孢子粉多糖离子色谱标准指纹图谱的建立方法

1、仪器、试剂及样品

1.1仪器

ICS5000多功能离子色谱（美国Dionex公司），脉冲安培电化学检测器。

1.2试剂及样品

单糖标准品：葡萄糖（Glc，99%）、甘露糖（Man，99％）、半乳糖（Gal,≥99%）均购于上海化学试剂公司；鼠李糖（Rha，≥99%）、岩藻糖（Fuc，≥99%）、葡萄糖醛酸（GlcUA，≥99%）、半乳糖醛酸（GalUA，≥97%）均为美国Sigma-Aldrich公司产品；木糖（Xyl，98%）、氨基葡萄糖（GlcN，98%）、氨基半乳糖（GalN，99%）均为美国ACROS ORGANICS公司产品；核糖（Rib，＞99.0%）、阿拉伯糖（Ara，99%）均购于厦门星隆达生化试剂有限公司。菊糖（优级纯，比利时Orafti公司）。酵母裂解酶ZymolyaseTM-20T（20ku/mg，美国NorthstarBioProducts公司）；浓硫酸、醋酸、醋酸钠和碳酸钡均系国药集团化学试剂有限公司产品；超纯水；pH试纸（上海三爱思试剂有限公司）。

灵芝孢子粉样品：20个批号分别采自山东、安徽、福建、吉林、湖北、广东等不同产地。

2、破壁灵芝孢子粉多糖的提取：

准确称取破壁灵芝孢子粉样品1.0g于50mL离心管中，加入30mL超纯水，于水浴60℃功率300瓦超声60min，冷却后离心，残渣用少量超纯水洗涤并离心后，将两次上清液合并，合并后的上清液置于透析袋中用超纯水透析12小时，50-60℃真空浓缩近干，加超纯水溶解并定容至5mL作为粗多糖水溶液，待测；

3、灵芝孢子粉多糖的酸-酶部分水解：

吸取500μL以上提取得到的粗多糖水溶液，加入500μL3mol/L的H2SO4溶液，漩涡混匀，于80℃酸水解1h，冷却至室温，用碳酸钡中和，12000r/min离心15min。取其上清液100μL，加入酵母裂解酶溶液（100u/mg）50μL，再用0.05mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 6.5）补加至反应体积为1mL。于45℃下反应12h。酶解液100℃加热5min，终止反应。12000r/min离心30min，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，得到的水相用于下步离子色谱分析。

4、灵芝孢子粉多糖部分水解产物的离子色谱指纹分析：

色谱条件与上述发明内容中离子色谱指纹图谱建立方法的步骤(3)所述的离子色谱指纹分析条件相同。

5、标准指纹图谱的确定及共有指纹峰特征：

将20个灵芝孢子粉多糖样品酸-酶部分水解并经CarboPac PA-20色谱柱分析后的单糖组分色谱图谱数据导入指纹图谱专用软件“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”，得到它们的指纹图谱于图3；由此生成灵芝孢子粉多糖酸-酶水解后单糖组分的HPAEC标准指纹图谱，见图4。对得到的灵芝孢子粉多糖样品酸-酶水解物单糖组分的HPAEC标准指纹图谱进行分析，确定了11个共有特征峰，标定为1～11峰，这11个单糖峰分别代表岩藻糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、氨基半乳糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。以葡萄糖峰为参照，计算单糖混合标样图谱和样品的单糖色谱指纹图谱中各单糖峰的相对保留时间，根据标样和样品的相对保留时间对照定性灵芝孢子多糖样品的单糖色谱指纹图谱中相关色谱峰，并以峰面积归一化法计算样品图谱各峰的相对峰面积。

将20个灵芝孢子粉多糖样品酸-酶水解并经CarboPac PA-200柱分析后的寡糖组分的色谱图谱数据导入指纹图谱专用软件“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”，得到它们的指纹图谱于图5；由此生成灵芝孢子粉多糖酸-酶水解后寡糖组分的HPAEC标准指纹图谱，见图6。对得到的灵芝孢子粉多糖样品酸-酶水解物寡糖组分的HPAEC标准指纹图谱进行分析，确定了5个共有特征峰。由于寡糖组分较复杂，故我们仅选取具有代表性的共有特征峰进入标准指纹图谱。被选定的五个峰标定为1-5号峰，通过与菊粉标准品对照定性，确定它们分别为三糖、五糖、六糖、七糖和多糖。以五糖峰为参照，计算菊粉对照品图谱和灵芝孢子粉样品的寡糖色谱指纹图谱中各寡糖及多糖峰的相对保留时间，根据菊粉对照品和样品的相对保留时间对照定性灵芝孢子多糖样品的寡糖色谱指纹图谱中相关色谱峰，并以峰面积归一化法计算样品图谱各峰的相对峰面积。

20个不同产地的灵芝孢子粉样品的共有峰相对保留时间见表1。

表1灵芝孢子粉多糖酸-酶部分水解产物的离子色谱分析共有特征峰的相对保留时间

其中单糖峰中超过总峰面积5%的指纹峰有3个，分别为：6号峰半乳糖，相对峰面积12.29%-29.88%；7号峰葡萄糖，相对峰面积49.01%-73.63%；9号峰甘露糖，相对峰面积7.40%-15.42%。寡糖指纹图谱中5号峰占总峰面积5.79%-26.77%。

6、指纹图谱精密度试验

取经提取、酸-酶水解后的4号灵芝孢子粉多糖样品水解液，分别用CarboPac PA-20和CarboPac PA-200色谱柱测定其单糖组分和寡糖组分，且用两个分析柱测定时分别连续进样5次，对各共有特征峰的相对保留时间（单糖组分以葡萄糖的保留时间为参照，寡糖组分寡以五糖的保留时间为参照）和相对峰面积（占总峰面积百分比）进行统计。结果显示，各共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，RSD<3%，表明灵芝孢子粉多糖的单糖组分和寡糖组分的离子色谱指纹图谱精密度试验均符合要求。

7、指纹图谱重现性试验

分别准确称取4号灵芝孢子粉样品5份，按照上述多糖提取、酸-酶水解的方法平行处理各个样品，并在上述同样的色谱条件下对其水解物中的单糖组分和寡糖组分分别进行离子色谱分析，对各共有特征峰的相对保留时间（单糖组分以葡萄糖的保留时间为参照，寡糖组分以五糖的保留时间为参照）和相对峰面积（占总峰面积百分比）进行统计。结果显示，各共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，表明灵芝孢子粉多糖的单糖组分和寡糖组分的离子色谱指纹图谱重现性试验符合要求。

8、指纹图谱稳定性试验

取经提取、酸-酶水解后的4号灵芝孢子粉多糖样品水解液在室温下保存，分别用CarboPacPA-20和CarboPac PA-200色谱柱于0、5、10、15、20、25h测定其单糖组分和寡糖组分，对各共有特征峰的相对保留时间（单糖组分以葡萄糖的保留时间为参照，寡糖组分以五糖的保留时间为参照）和相对峰面积（占总峰面积百分比）进行统计。结果显示，各共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，RSD<5%,试样24小时稳定。

以上试验显示，上述指纹图谱测定方法精密、稳定、可靠。

实施例2、吉林某产地破壁灵芝孢子粉样品的多糖离子色谱指纹图谱分析

1、孢子粉多糖的提取

准确称取吉林某产地破壁灵芝孢子粉样品0.6g于50mL离心管中，加入30mL超纯水，于水浴70℃功率300瓦超声50min，冷却后离心，残渣用少量超纯水洗涤并离心后，将两次上清液合并，合并后的上清液置于透析袋中用超纯水透析12小时，55℃真空浓缩近干，加超纯水溶解并定容至5mL作为粗多糖水溶液，待测；

2、多糖的酸-酶部分水解

吸取500μL步骤（1）所得的粗多糖水溶液，加入500μL 1mol/L的H2SO4溶液，漩涡混匀，于100℃酸水解3h，冷却至室温，用碳酸钡中和，12000r/min离心15min。取其上清液100μL，加入酵母裂解酶溶液（100u/mg）50μL，再用0.05mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液（pH6.5）补加至反应体积为1mL。于45℃下反应12h。酶解液100℃加热5min，终止反应。12000r/min离心30min，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，其滤液用于下步离子色谱分析。

3、离子色谱指纹分析：

色谱条件与上述发明内容中离子色谱指纹图谱建立方法的步骤(3)所述的离子色谱指纹分析条件相同。在此条件下分别进样分析单糖混合标样、菊粉对照品和灵芝孢子粉样品，得到该样品部分水解产物的单糖和寡糖的离子色谱指纹图谱,见附图7。以葡萄糖峰为参照，计算单糖混合标样图谱和样品的单糖色谱指纹图谱中各单糖峰的相对保留时间，根据标样和样品的相对保留时间对照定性灵芝孢子多糖样品的单糖色谱指纹图谱中相关色谱峰，并以峰面积归一化法计算样品图谱各峰的相对峰面积。以五糖峰为参照，计算菊粉对照品图谱和灵芝孢子粉样品的寡糖色谱指纹图谱中各寡糖及多糖峰的相对保留时间，根据菊粉对照品和样品的相对保留时间对照定性灵芝孢子多糖样品的寡糖色谱指纹图谱中相关色谱峰，并以峰面积归一化法计算样品图谱各峰的相对峰面积。

4、与标准指纹图谱比较

对照标准指纹图谱，该样品的单糖和寡糖离子色谱指纹图谱中分别含有11个和5个共有特征峰，其中单糖离子色谱指纹图谱中3个主要色谱峰的相对保留时间(以葡萄糖峰为参照)和相对峰面积分别为：6号峰相对保留时间为9.684，相对峰面积12.29%；7号峰相对保留时间为11.017，相对峰面积73.04%；9号峰相对保留时间为13.484，相对峰面积9.23%。寡糖离子色谱指纹图谱中5号峰相对保留时间(以三糖峰为参照)为7.5，相对峰面积20.59%。该样品的指纹图谱与标准指纹图谱相似，具有标准指纹图谱特征。

实施例3、安徽某产地未破壁灵芝孢子粉样品的指纹图谱分析

1、破壁灵芝孢子粉多糖的提取

准确称取安徽某产地破壁灵芝孢子粉样品o.8g于50mL离心管中，加入30mL超纯水，于水浴80℃功率300瓦超声30min，冷却后离心，残渣用少量超纯水洗涤并离心后，将两次上清液合并，合并后的上清液置于透析袋中用超纯水透析12小时，55℃真空浓缩近干，加超纯水溶解并定容至5mL作为粗多糖水溶液，待测；

2、灵芝孢子粉多糖的酸-酶部分水解

吸取500μL步骤（1）所得的粗多糖水溶液，加入500μL 2mol/L的H2SO4溶液，漩涡混匀，于90℃酸水解2h，冷却至室温，用碳酸钡中和，12000r/min离心15min。取其上清液100μL，加入酵母裂解酶溶液（100u/mg）50μL，再用0.05mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液（pH6.5）补加至反应体积为1mL。于45℃下反应12h。酶解液100℃加热5min，终止反应。12000r/min离心30min，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，其滤液用于下步离子色谱分析。

3、离子色谱指纹分析：

色谱条件及峰定性和峰的相对保留值、相对峰面积计算均与实施例2的步骤3相同。

4、与标准指纹图谱比较

对照标准指纹图谱，该样品的单糖和寡糖离子色谱指纹图谱中分别含有11个和5个共有特征峰，其中单糖离子色谱指纹图谱中3个主要色谱峰的相对保留时间(以葡萄糖峰为参照)和相对峰面积分别为：6号峰相对保留时间为9.750，相对峰面积26.43%；7号峰相对保留时间为11.117，相对峰面积49.01%；9号峰相对保留时间为13.550，相对峰面积15.42%。寡糖离子色谱指纹图谱中5号峰相对保留时间(以三糖峰为参照)为7.52，相对峰面积7.57%。该样品的指纹图谱与标准指纹图谱相似，具有标准指纹图谱特征。同时Gal、Glc、Man、多糖四个峰的相对比例与吉林样品（实施例2）有明显差异，具有本地区特征。

Claims (1)

1.一种灵芝孢子粉多糖离子色谱指纹图谱的构建方法，其特征在于包括灵芝孢子粉多糖的提取、灵芝孢子粉多糖的酸-酶部分水解、水解产物中单、寡糖组分的离子色谱的指纹分析及其标准指纹图谱的确定，具体步骤为：

（1）灵芝孢子粉多糖的提取：

对于破壁孢子粉，准确称取样品0.5-1.0g于50mL离心管中，加入30mL超纯水，于水浴60-80℃功率300瓦超声30-60min，冷却后离心，残渣用少量超纯水洗涤并离心后，将两次上清液合并，合并后的上清液置于透析袋中用超纯水透析12小时，50-60℃真空浓缩近干，加超纯水溶解并定容至5mL作为粗多糖水溶液待测；

对于未破壁孢子粉，称取5g左右的样品于研钵中，研磨10min后准确称取其样品0.5-1.0g于50mL离心管中，加入30mL超纯水，于水浴60-80℃功率300瓦超声30-60min，后续操作同上；

（2）灵芝孢子粉多糖的酸-酶部分水解：

吸取500μL步骤（1）所得的粗多糖水溶液，加入500μL1-3mol/L的H2SO4溶液，漩涡混匀，于80-100℃酸水解1-3h，冷却至室温，用碳酸钡中和，12000r/min离心15min；取其上清液100μL，加入浓度为100u/mg酵母裂解酶溶液50ul，再用0.05mol/L，pH为6.5的醋酸-醋酸钠缓冲液补加至反应体积为1mL；于45℃下反应12h；酶解液100℃加热5min终止反应；12000r/min离心30min，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，其滤液用于下步离子色谱分析；

（3）灵芝孢子粉多糖部分水解产物的离子色谱指纹分析：

针对酸-酶水解物中的单糖组分，离子色谱分析条件为：色谱柱：CarboPacPA-20，包括3×150mm分析柱和3×50mm保护柱；脉冲安培电化学检测器ED40；金工作电极；Ag/AgCl参比电极；四电位波形；流速：0.5mL/min；进样体积：20μL；柱温：30℃；流动相：水-0.25mol/LNaOH溶液-1mol/LNaAc溶液，三元梯度洗脱：0～21min,97.6%A,2.4%B,0%C;21.1min,92.6%A,2.4%B,5.0%C;30min,77.6%A,2.4%B,20%C;30.1～50min,20%A,80%B,0%C；所述A是水，B是0.25mol/LNaOH溶液，C是1mol/LNaAc溶液；

针对酸-酶水解物中的寡糖组分，离子色谱分析条件为：色谱柱：CarboPacPA-200，包括3×150mm分析柱和（3×50mm）保护柱；脉冲安培电化学检测器ED40；金工作电极；Ag/AgCl参比电极；四电位波形；流速：0.5mL/min；进样体积：20μL；柱温：30℃；流动相：水-0.25mol/LNaOH溶液-1mol/LNaAc溶液，三元梯度洗脱：0min,57.6%A,38.4%B,4.0%C;40min,36%A,24%B,40%C;40.1～60min,57.6%A,38.4%B,4.0%C；所述A是水，B是0.25mol/LNaOH溶液，C是1mol/LNaAc溶液；

（4）标准指纹图谱的确定：

通过20个不同产地的灵芝孢子粉样品的多糖酸-酶水解产物中单、寡糖组分的离子色谱测定，分别构建灵芝孢子粉多糖水解物中单糖组分和寡糖组分的HPAEC标准指纹图谱，确定单糖图谱中的11个单糖共有特征峰，以及寡糖图谱中的4个寡糖共有峰和1个多糖峰；

所述11个单糖共有特征峰分别对应岩藻糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、氨基半乳糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸；所述寡糖指纹图谱中的5个共有特征峰分别对应三糖、五糖、六糖、七糖和多糖。

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