CN102590370A

CN102590370A - 一种同步测定木质纤维原料反应体系中单糖、糖醛酸和糖酸的方法

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Publication number: CN102590370A
Application number: CN2012100129634A
Authority: CN
Inventors: 徐勇; 余世袁; 勇强; 王荥; 朱均均; 李鑫; 周晓青; 连之娜
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2012-01-16
Filing date: 2012-01-16
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2032-01-16
Also published as: CN102590370B

Abstract

本发明公开了一种同步测定木质纤维原料反应体系中的单糖、糖醛酸和糖酸的方法，包括：对木质纤维原料反应体系进行预处理得待测液；利用高效液相离子交换色谱，采用积分脉冲安培检测法和色谱峰面积积分法测定单糖、糖醛酸和糖酸标样，得标准方程；利用高效液相离子交换色谱测定待测液，利用标准方程，计算出各组分含量；采用高效液相色谱法对待测液中木糖和甘露糖的进行分离和定量，并对高效液相离子交换色谱的结果进行修正。本发明首次建立了单糖、糖醛酸和糖酸的同步精确定量测定的方法，显著提高了8种物质的分离度及检测效率，结合普通高效液相色谱法可实现对木质纤维原料反应体系中9种物质的同步精确定量测定，对于木质纤维原料生物炼制过程中物质变化、产品和中间产物的成分分析和测定具有重要的意义。

Description

一种同步测定木质纤维原料反应体系中单糖、糖醛酸和糖酸的方法

技术领域

本发明涉及木质纤维原料生物炼制过程产生的多种产品及中间产物的同步分析检测方法，具体涉及一种利用高效液相离子交换色谱同步测定多种单糖、糖醛酸和糖酸的测定方法，特别涉及一种利用高效液相离子交换色谱同步测定木质纤维原料生物炼制过程产生的阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、木糖酸、葡萄糖酸、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等物质的组成和含量的方法。

背景技术

木质纤维原料的生物炼制是当前的热点，原料的基本组成及其在生物或化学加工过程中的物质变化是该领域的基本科学问题，其中多糖类的转化和利用是本领域的核心。在木质纤维原料中，纤维素仅由葡萄糖基聚合而成，采用普通的色谱方法容易分离和测定；相对于均一的纤维素，非纤维素类多糖如半纤维素和果胶等是由多种不同类型的糖基构成的异质多聚体，其组成复杂，主要包括木糖基、阿拉伯糖基、半乳糖基、甘露糖基、半乳糖醛酸基、葡萄糖醛酸基等多种复杂的成分，在加工的过程中它们又会进一步衍生成多种单糖、糖酸或糖醛酸的混合物。上述物质因原料的种类、来源及加工方式的不同也会存在着很大的差异。因此，快速、准确地测定这些中性单糖、糖醛酸和糖酸的组成和含量变化对于木质纤维原料生物炼制过程中物质变化、产品及中间产物的分析检测及其相关研究具有重要的意义。

目前，木质纤维原料的单糖、糖醛酸和糖酸组分分析和含量测定方法主要有：(1)单糖类组成的分析通常采用高效液相色谱法，所采用的色谱柱主要有Nova-Pak 250×3.9(4μm)(见CN100422736C)、Bio-Rad Aminex HPX-87H(见GB/T23747-2009)或HPX-87P等；(2)糖醛酸的测定有分光光度法、气相色谱法和液相色谱法；(3)糖酸多采用分光光度法和高效液相色谱法衍生测定。其中，高效液相色谱法是当前木质纤维原料预处理液分析和检测应用较为广泛的一种方法。在这几种方法中，方法(1)一般只能测定木质纤维原料生物炼制过程中的单糖；方法(2)和方法(3)难以分辨样品中的多种糖酸和糖醛酸的相互干扰，对痕量的糖酸和糖醛酸无法精确测定，而且通常需要对样品进行衍生化。上述各种木质纤维原料预处理液的测定方法均存在着操作步骤繁琐、糖组分的分离度不高、结果重现性差、灵敏度低或检测成本昂贵等不足，且不能同步完成。

因此，研究和开发一种准确和快速的木质纤维原料反应体系中的定性分析和定量测定方法，对于该类产品的检验评价和推广应用具有重要的意义。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种同步测定多种单糖、糖醛酸和糖酸的方法，以实现对木质纤维原料反应体系中各组分的快速高效定性分析和精确定量检测。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种同步测定木质纤维原料反应体系中单糖、糖醛酸和糖酸的方法，包括以下步骤：

(1)对木质纤维原料反应体系进行预处理，使其各待测组分的浓度为0.1～10mg/L，得待测液；

(2)利用高效液相离子交换色谱，采用积分脉冲安培检测法和色谱峰面积积分法测定单糖、糖醛酸和糖酸标样，得标准方程；

(3)采用与步骤(2)相同的方法和设备，测定步骤(1)的待测液，利用步骤(2)的标准方程，计算出各组分含量；

(4)先采用高效液相色谱法进行待测液中的木糖和甘露糖进行分离和定量；再对甘露糖结果进行修正；

其中，单糖包括阿拉伯糖(Arabinose)、半乳糖(Galactose)、葡萄糖(Glucose)、木糖(Xylose)和甘露糖，糖酸包括木糖酸(Xylose acid)和葡萄糖酸(Gluconicacid)，糖醛酸包括半乳糖醛酸(Galacturonic acid)和葡萄糖醛酸(Glucuronicacid)。

步骤(1)中，将木质纤维原料预处理液样品充分溶解于25～30℃的蒸馏水中，定容并调节预处理液各待测组分的浓度于0.1～10mg/L之间，在10000rpm条件下离心5min后，以0.2μm微滤膜过滤得上清液，即为待测液。

步骤(2)中，高效液相离子交换色谱为美国Dionex ICS-3000离子色谱系统，采用CarboPacTM PA10色谱柱带保护柱，柱温30℃，自动上样，进样体积10.0μL；以18mmol/L、200mmol/L氢氧化钠和500mmol/L醋酸钠为淋洗液进行二元梯度淋洗，流速为0.3mL/min，在0～10min内以18mmol/L氢氧化钠溶液进行等度洗脱；10～20min内醋酸钠溶液淋洗的浓度梯度为50～200mmol/L，氢氧化钠溶液淋洗的浓度梯度为65.4～70.8mmol/L；采用20～40min内氢氧化钠溶液淋洗的浓度为200mmol/L对交换柱进行再生；采用40～50min内氢氧化钠溶液淋洗的浓度为18mmol/L对交换柱进行平衡；电化学检测器检测模式为金工作电极和pH-Ag/AgCl复合型参比电极。

步骤(2)中，先将阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、木糖酸、葡萄糖酸、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸标准品配制成0.1～10mg/L的标准溶液，然后测定这8种物质的标准工作方程和保留时间。

步骤(2)中，所述的标准方程为：

阿拉伯糖A＝1.9171c₁+0.2271；

半乳糖A＝2.6040c₂+0.2954；

葡萄糖A＝2.8275c₃+0.0096；

木糖A＝1.6377c₄-0.0061；

木糖酸A＝0.4007c₅-0.0249；

葡萄糖酸A＝0.5860c₆+0.1056；

半乳糖醛酸A＝0.4657c₇+0.1483；

葡萄糖醛酸A＝1.2103c₈+0.3684；

上述标准工作方程中，A为色谱峰面积nC·min，c表示糖组分的浓度mg/L。

步骤(4)中，修正方法为：从甘露糖中扣除阿拉伯糖部分，得甘露糖部分。

有益效果：与现有的木质纤维原料预处理液测定方法相比，本发明的同步测定木质纤维原料反应体系中多种单糖、糖醛酸和糖酸的方法主要优点包括：首次建立了高效液相离子交换色谱精确定量同步测定阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖酸、葡萄糖酸、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的方法，采用CarboPac^TM PA10(2×250mm)色谱柱，通过氢氧化钠溶液和醋酸钠溶液二元梯度洗脱显著提高了8种物质组分之间的分离度及检测效率，实现对木质纤维原料预处理液组分的定性分析和快速、精确定量检测，同时结合普通高效液相色谱对木糖、甘露糖进行准确定量，方法简单，快速，高效和实用，对于木质纤维原料预处理液的检测评价和推广应用具有重要的意义，具有很好的实用性，能够产生很好的经济效益和社会效应。

附图说明

图1是阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、木糖酸、葡萄糖酸、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸标准样品的高效液相离子交换色谱测定的图谱；图中横坐标表示各种组分的保留时间RT(min)，纵坐标表示电化学检测器所检测得到脉冲安培信号(nC)；

图2是木质纤维原料预处理液实际样品的高效液相离子交换色谱测定的图谱；图中横坐标表示各种组分的保留时间RT(min)，纵坐标表示电化学检测器所检测得到脉冲安培信号(nC)；

图3是纤维二糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖标准样品的普通高效液相色谱测定的图谱；图中横坐标表示各种组分的保留时间RT(min)，纵坐标表示示差折光率检测器所检测得到信号(nRIU)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

高效液相离子交换色谱系统：美国Dionex ICS-3000离子色谱系统，配备双泵(DP)内置真空脱气模块、电化学检测器(ED)和自动进样器(AS40)，色谱系统的运行软件采用Chromeleon 6.70色谱工作站；色谱条件：色谱柱：CarboPacTM PA10(2×250mm)色谱柱带保护柱(2×50mm)，柱温：30℃；进样体积：10.0μL；

淋洗条件：以18mmol/L氢氧化钠、200mmol/L氢氧化钠和500mmol/L醋酸钠为淋洗液进行二元梯度淋洗，流速为0.3mL/min，在0～10min内以18mmol/L氢氧化钠溶液进行等度洗脱；10～20min内醋酸钠溶液淋洗的浓度梯度为50～200mmol/L，氢氧化钠溶液淋洗的浓度梯度为65.4～70.8mmol/L；20～40min内氢氧化钠溶液淋洗的浓度为200mmol/L(对交换柱进行再生)；40～50min内氢氧化钠溶液淋洗的浓度为18mmol/L(对交换柱进行平衡)。

信号检测：电化学检测器检测模式为金工作电极和pH-Ag/AgCl复合型参比电极，采用积分和脉冲安培检测法和色谱峰面积积分法测定阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、木糖酸、葡萄糖酸、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的含量，8种组分测定的标准四电位波形如表1所示。

表1木糖和低聚木糖组分测定的标准四电位波形

时间(min)

电位(V)

积分

0.00	0.10
			0.20	0.10	on
0.40	0.10	off
			0.41	-2.00
0.42	-2.00
			0.43	0.60
0.44	-0.10
			0.50	-0.10

测定8种物质的标准工作方程：阿拉伯糖、半乳糖、木糖、半乳糖醛酸购自美国Fluka公司；葡萄糖和葡萄糖酸钠购自美国Sigma公司；葡萄糖醛酸和甘露糖购自上海国药集团，木糖酸钙购自加拿大TRC公司(纯度＞97％)。配制成0.1～10mg/L的标准溶液，采用上述高效液相离子交换色谱系统和色谱条件测定8种物质的标准工作方程，测定结果如图1和表2所示。图中各色谱峰分别为：1.阿拉伯糖；2.半乳糖；3.葡萄糖；4.木糖；5.木糖酸；6.葡萄糖酸；7.半乳糖醛酸；8.葡萄糖醛酸。

色谱峰保留时间RT(min)：阿拉伯糖7.74，半乳糖9.68，葡萄糖10.52，木糖11.71，木糖酸16.57，葡萄糖酸17.26，半乳糖醛酸21.34，葡萄糖醛酸22.02。

表2木糖至木六糖高效液相离子交换色谱标准工作方程测定

标准工作方程分别为：

阿拉伯糖A＝1.9171c₁+0.2271，相关系数R²＝0.9994；

半乳糖A＝2.6040c₂+0.2954，相关系数R²＝0.9995；

葡萄糖A＝2.8275c₃+0.0096，相关系数R²＝1；

木糖A＝1.6377c₄-0.0061，相关系数R²＝1；

木糖酸A＝0.4007c₅-0.0249，相关系数R²＝0.9997；

葡萄糖酸A＝0.5860c₆+0.1056，相关系数R²＝0.9994；

半乳糖醛酸A＝0.4657c₇+0.1483，相关系数R²＝0.9971

葡萄糖醛酸A＝1.2103c₈+0.3684，相关系数R²＝0.9969

标准工作方程中，A表示色谱峰面积(nC·min)，c表示糖组分的浓度(mg/L)。

检出限(mg/L)：阿拉伯糖0.013，半乳糖0.012，葡萄糖0.011，木糖0.020，木糖酸0.016，葡萄糖酸0.014，半乳糖醛酸0.027，葡萄糖醛酸0.004。

定量限(mg/L)：阿拉伯糖0.043，半乳糖0.039，葡萄糖0.038，木糖0.067，木糖酸0.054，葡萄糖酸0.045，半乳糖醛酸0.090，葡萄糖醛酸0.013

精密度(％)：保留时间相对偏差≤0.20％，峰面积相对偏差≤4.99％。

加标回收率：71.20％～116.41％。

实施例2

木质纤维原料经蒸汽爆破(200℃，5.0min)和酶水解(底物质量浓度10％，纤维素酶用量3.0FPIU/g纤维素，木聚糖酶用量100IU/g木聚糖，50℃搅拌反应24h)等生物炼制过程后得反应体系的样品液，将待测的样品液充分溶解于25～30℃蒸馏水中，定容并调节待测低聚木糖组分的浓度为0.1～10.0mg/L，在10000rpm条件下离心5min，以0.2μm微滤膜过滤上清液得样品液，再转入实施例1的高效液相离子交换色谱系统，采用CarboPacTM PA10(2×250mm)色谱柱，柱温30℃、进样体积10.0μL，以18mmol/L氢氧化钠、200mmol/L氢氧化钠和500mmol/L醋酸钠为淋洗液进行二元梯度淋洗，流速为0.3mL/min，在0～10min内以18mmol/L氢氧化钠溶液进行等度洗脱；10～20min内醋酸钠溶液淋洗的浓度梯度为50～200mmol/L，氢氧化钠溶液淋洗的浓度梯度为65.4～70.8mmol/L；20～40min内氢氧化钠溶液淋洗的浓度为200mmol/L(此步骤是对交换柱进行再生)；40～50min内氢氧化钠溶液淋洗的浓度为18mmol/L(此步骤是对交换柱进行平衡)。自动上样瓶进行色谱测定。

采用外标法以实施例1的8种物质的标准方程定性分析和定量测定木质纤维原料预处理液样品中的单糖、糖醛酸和糖酸的含量，结果如图2所示，图中各色谱峰所表征的物质分别是：1.阿拉伯糖；2.半乳糖；3.葡萄糖；4.木糖(与甘露糖的色谱峰完全重叠，但二者的脉冲安培检测响应值不同)；5.木糖酸；6.葡萄糖酸；7.半乳糖醛酸；8.葡萄糖醛酸。样品实际测定的结果分别为(样品稀释1000倍，mg/L)：阿拉伯糖2.06，半乳糖1.72，葡萄糖14.50，木糖(包括甘露糖)14.26，木糖酸5.50，葡萄糖酸2.08，半乳糖醛酸0.20；8.葡萄糖醛酸0.10。

采用普通高效液相色谱Bio-Rad Aminex HPX-87P柱对样品液中的甘露糖(与阿拉伯糖色谱峰完全重叠，但是二者的折光示差响应值相同)和木糖进行分离与测定，以折光示差法测定各物质的响应值，标准图谱如图3所示。测定的结果分别为(样品稀释10倍，g/L)：木糖1.310，甘露糖(含阿拉伯糖)0.362。

对高效液相离子交换色谱系统测定结果进行修正。以普通高效液相色谱直接测得木糖含量；由高效液相色谱所测得的甘露糖含量扣除高效液相离子交换色谱所测得的阿拉伯糖含量，则分别得样品中的木糖、甘露糖和阿拉伯糖的9种成分的实际含量分别为(g/L)：阿拉伯糖2.06，半乳糖1.72，葡萄糖14.50，木糖13.10，甘露糖1.56，木糖酸5.50，葡萄糖酸2.08，半乳糖醛酸0.20；8.葡萄糖醛酸0.10。

可见，采用本发明的方法，对真实木质纤维原料生物炼制产品中的9种组分都能够实现高效，快速地分离和检测。

Claims

1.一种同步测定木质纤维原料反应体系中单糖、糖醛酸和糖酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）对木质纤维原料反应体系进行预处理，使其各待测组分的浓度为0.1～10 mg/L，得待测液；

（2）利用高效液相离子交换色谱，采用积分脉冲安培检测法和色谱峰面积积分法测定单糖、糖醛酸和糖酸标样，得标准方程；

（3）采用与步骤（2）相同的方法和设备，测定步骤（1）的待测液，利用标准方程，计算出各组分含量；

（4）先采用高效液相色谱法进行待测液中的木糖和甘露糖进行分离和定量；再对甘露糖结果进行修正；

其中，单糖包括阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖，糖酸包括木糖酸和葡萄糖酸，糖醛酸包括半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。

2.根据权利要求1所述的同步测定木质纤维原料反应体系中单糖、糖醛酸和糖酸的方法，其特征在于：步骤（1）中，将木质纤维原料反应的样品充分溶解于25～30℃的蒸馏水中，定容并调节预处理液各待测组分的浓度于0.1～10 mg/L之间，在10000 rpm条件下离心5 min后，以0.2μm微滤膜过滤得上清液，即为待测液。

3.根据权利要求1所述的同步测定木质纤维原料反应体系中单糖、糖醛酸和糖酸的方法，其特征在于：步骤（2）中，高效液相离子交换色谱为美国Dionex ICS-3000 离子色谱系统，采用CarboPacTM PA10色谱柱带保护柱，柱温30℃，自动上样，进样体积10.0μL；以18 mmol/L、200 mmol/L氢氧化钠和500 mmol/L醋酸钠为淋洗液进行二元梯度淋洗，流速为0.3 mL/min，在0～10 min内以18 mmol/L氢氧化钠溶液进行等度洗脱；10～20 min内醋酸钠溶液淋洗的浓度梯度为50～200 mmol/L，氢氧化钠溶液淋洗的浓度梯度为65.4～70.8 mmol/L；采用20～40 min内氢氧化钠溶液淋洗的浓度为200 mmol/L对交换柱进行再生；采用40～50 min内氢氧化钠溶液淋洗的浓度为18 mmol/L对交换柱进行平衡；电化学检测器检测模式为金工作电极和pH-Ag/AgCl复合型参比电极。

4.根据权利要求1所述的同步测定木质纤维原料反应体系中单糖、糖醛酸和糖酸的方法，其特征在于：步骤（2）中，先将阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、木糖酸、葡萄糖酸、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸标准品配制成0.1～10 mg/L的标准溶液，然后测定这8种物质的标准工作方程和保留时间。

5.根据权利要求1或4所述的同步测定木质纤维原料反应体系中单糖、糖醛酸和糖酸的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述的标准方程为：

阿拉伯糖A=1.9171c₁ + 0.2271；

半乳糖A=2.6040c₂+0.2954；

葡萄糖A =2.8275c₃+0.0096；

木糖A =1.6377c₄－0.0061；

木糖酸A =0.4007c₅－0.0249；

葡萄糖酸A =0.5860c₆+0.1056；

半乳糖醛酸A=0.4657c₇+0.1483；

葡萄糖醛酸A=1.2103c₈+0.3684；

上述标准工作方程中，A为色谱峰面积，c表示糖组分的浓度mg/L。

6.根据权利要求1所述的同步测定木质纤维原料反应体系中单糖、糖醛酸和糖酸的方法，其特征在于：步骤（4）中，修正方法为：从甘露糖中扣除阿拉伯糖部分，得甘露糖部分。