CN109358154B - 一种酸性多糖中单糖组成的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种测定酸性多糖中单糖组成的方法,检测方法步骤包括:(1)通过弱酸对多糖进行第一步水解,之后配合强酸进行第二步水解;(2)通过离子色谱结合电化学检测器测定水解样品中的单糖组成。所述第一步水解中的弱酸为摩尔浓度较低的三氟乙酸,第二步水解中的强酸为摩尔浓度较高的硫酸。根据所获得的离子色谱图谱,基于峰迁移时间和峰面积可得到单糖的种类和含量。与传统的一步水解法相比,本方法精确度高,选择性好,适用于酸性多糖的单糖组成分析。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物来源多糖种的单糖组成分析,具体涉及一种天然产物来源酸性多糖中单糖组成分析。
背景技术
多糖是指由超过10个的单糖以糖苷键连接而成的高分子聚合物,通常存在于动物细胞、高等植物细胞及部分微生物细胞壁中,是生命体的重要组成部分,也是维持机体生命活动必不可少的化合物。多糖生物活性与其结构关系密切,而其单糖组成是结构基础。
在多糖的单糖组成分析过程中,涉及水解单糖、分离及检测等过程,其中将多糖水解成游离的单糖是非常重要的一个步骤,目前常用的方法有酸水解、碱水解、酶催化降解及物理降解等。碱催化降解反应只能从多糖链的还原末端逐个脱落出单糖,反应速率较慢,并且在水解过程中时常伴随着产物结构的变化,因此目前碱水解技术尚无法满足将多糖水解为单糖的需要。酶催化降解可以选择性地水解不同的糖苷键,并且反应速率快,但是酶的高度专一性导致在实际应用中很难找到与底物相契合的酶,酶催化降解对温度、pH等环境有较多要求,因此酶催化降解在多糖水解为单糖的实际应用中有诸多限制。物理降解技术包括有微波、辐射、超声波等,但这些物理手段通常很难使多糖完全降解为单糖,通常作为一种辅助手段。
酸水解是指溶液中的氢离子使糖苷键上的氧原子质子化从而导致糖苷键断裂的过程,酸水解反应可以发生在多糖链的任一糖苷键中,具有反应速率快、水解产物结构变化小等优点,是多糖水解为单糖的主流技术。酸水解常用的酸有盐酸、硫酸、三氟乙酸等,在多糖被水解成为单糖过程中,往往会伴随部分单糖的损失,尤其是中性糖和氨基糖,导致无法准确测定多糖中的单糖组成,对于酸性多糖中,由于糖醛酸难以被水解,要在尽量减少中性糖的损失的情况下,水解出更多的糖醛酸,从而准确测定出酸性多糖中单糖组成。目前,针对酸性多糖的单糖组成测定,常用的方法有单种类酸水解,也有人采用综合的方法优化水解效果,如孙元琳等报道一种当归果胶多糖中的糖醛酸含量测定方法(中国食品学报,2008,8:128-132),认为多糖需经脱脂处理并结合弱酸水解和酶解才能得到准确、真实的结果,De Ruiter等(Analytical biochemistry,1992,207(1):176-185)发现甲醇解结合三氟乙酸对含糖醛酸类多糖的水解效果较好。但是,孙元琳等人报道的方法需要对多糖进行脱脂特殊处理,同时要选择特异性酶的方法处理,步骤较为繁琐且成本较高;而De Ruiter等所推荐的方法,需要将甲醇溶解在盐酸中,处理工艺特殊、复杂。因此,需要对富含糖醛酸多糖水解进行进一步优化。
发明内容
发明目的:为克服传统水解方法的不足,本发明提供了一种新的一种酸性多糖单糖中组成的测定方法,尤其是提高多糖中单糖水解效率。
本发明具体技术方案如下:
一种酸性多糖单糖中组成的测定方法,包括以下步骤:
(1)多糖水解:称取5mg多糖,加入3mL三氟乙酸溶液加热进行第一步水解,反应结束后再冷却,之后加入3mL摩尔体积浓度(mol/L)为2的硫酸进行第二步水解,于100℃水解时间2h,水解完成后将样品溶液转移至250mL容量瓶定容,取稀释后的水解样品溶液并用0.22μm水系微孔滤膜过滤,取滤液用离子色谱仪分析。
(2)检测条件:所述离子色谱仪为DIONEX ICS-5000,柱子采用DIONEX公司的CarboPacTM PA20分析柱(3mm×150mm),柱温箱温度为30.0℃;检测系统为电化学检测器(25.0℃),流动相由摩尔体积浓度(mol/L)为0.25的氢氧化钠溶液、摩尔体积浓度(mol/L)为1的醋酸钠溶液和超纯水组成,梯度洗脱。
所述酸性多糖包括糖醛酸含量较高的胡萝卜多糖、秋葵多糖和茶多糖等植物来源多糖。
所述三氟乙酸摩尔体积浓度(mol/L)为0.01-0.3,优选为0.03-0.06。
所述第一步水解中水解温度为40-120℃,优选为70-90℃。
所述第一步水解中水解时间为0.25-2.5h,优选为0.45-1.25h。
所述单糖检测方法如下:
1.仪器与试剂
1.1仪器
Dionex ICS 5000型离子色谱仪 美国Dionex公司;Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司;高速冷冻离心机 美国Thermo公司,等。
1.2试剂
单糖标准品(L-岩藻糖fuc、鼠李糖rha、D-阿拉伯糖ara、D-半乳糖gal、D-葡萄糖glu、D-木糖xyl、D-甘露糖man、D-果糖fru、半乳糖醛酸gala、葡萄糖醛酸glua)、醋酸钠美国Sigma公司;三氟乙酸上海阿拉丁生化试剂公司;无水乙醇、浓硫酸等均为国产分析纯。
2.色谱条件
色谱柱:CarboPacTM PA20分析柱(3mm×150mm);
柱温:30.0℃;
流速:0.5mL/min;
检测器:电化学检测器,温度为25.0℃;
流动相:A为摩尔体积浓度(mol/L)为0.25的氢氧化钠溶液,B为摩尔体积浓度(mol/L)为1醋酸钠溶液,C为超纯水,梯度洗脱。
3.标准溶液制备
准确称取十种单糖标准品各5mg于同一容量瓶中,定容,摇匀,配制成质量体积浓度(mg/mL)为0.1的混合标准品溶液,然后稀释成梯度浓度,过0.22μm水系滤膜后进离子色谱仪分析。
4.结果分析
将稀释成系列浓度的混合标准品溶液过膜后进离子色谱仪分析,以单糖标准品的浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,作线性标准曲线。得到如表1的线性回归方程。
表1单糖标准品回归方程表
由表1及图1可知,单糖标准品线性良好,单糖之间能有效分离,此检测方法可行,可对本实验的单糖含量进行检测。
与现有技术相比,本发明具有以下效果:
本发明方法可以让酸性多糖得到较完全的水解,能更准确的对酸性多糖中的单糖进行定性及定量分析,且操作简便快捷,灵敏度高。相比较于传统的硫酸水解法,新的两步水解法测出的总糖含量明显提高,取得了较好的效果。
附图说明
图1为单糖标准品与胡萝卜多糖水解样品色谱重叠图;
图2为单糖标准品与茶多糖水解样品色谱重叠图;
图3为单糖标准品与秋葵多糖水解样品色谱重叠图;
图4为TFA浓度对单糖总量的影响曲线;
图5为水解温度对单糖总量的影响曲线;
图6为水解时间对单糖总量的影响曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明。为能准确测定多糖中单糖组成,本发明采用两步水解法对多糖进行水解,并以胡萝卜多糖为模型,通过单因素试验对TFA水解条件进行进一步优化。
实施例1两步水解法分析酸性多糖中单糖组成方法优化
(1)胡萝卜多糖制备
取适量胡萝卜汁,按1:5质量体积比(g/mL)加入超纯水,于沸水浴中提取2.5h,过滤所得上清滤液,经浓缩后醇沉(最终乙醇质量体积浓度为80%),4℃静置过夜后,在4800r/min转速下离心10min,除去上清液得到沉淀,加入超纯水复溶,然后除去糖溶液中的乙醇,真空浓缩、冻干,得到胡萝卜粗多糖。采用Saveg法对胡萝卜粗多糖进行脱蛋白处理,除去多糖溶液中的有机试剂后用超纯水透析48h,然后用95%乙醇再次对多糖溶液进行醇沉处理(最终乙醇浓度为80%),4℃静置过夜,4800rpm转速下离心10min,得到的沉淀分别用乙醚、丙酮洗两次,然后除去多糖中残留的有机试剂,真空浓缩后冻干,得到胡萝卜多糖。
(2)单糖组成分析
准确称取胡萝卜多糖5mg于厚壁耐压管中,加入3mL一定浓度的TFA溶液后,进行第一步水解,反应结束后再冷却,旋转蒸发除去TFA,之后加入3mL摩尔体积浓度(mol/L)为2的硫酸进行第二步水解,于100℃水解时间2h,水解完成后将样品溶液转移至250mL容量瓶定容,取稀释后的水解样品溶液并用0.22μm水系微孔滤膜过滤,取滤液用离子色谱仪分析。
1.1第一步水解条件优化
选取第一步水解中TFA浓度、水解温度、水解时间等三个因素进行单因素实验,得到单因素与胡萝卜多糖水解后各单糖总量的关系。
1.1.1TFA浓度对胡萝卜多糖水解后单糖总量的影响
准确称取胡萝卜多糖5mg,分别加入3mL摩尔体积浓度(mol/L)为0.01,0.05,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30的三氟乙酸,100℃条件下水解1h,水解结束后通过旋转蒸发除去TFA,再经硫酸进行第二步水解后,进离子色谱仪分析。
结果如图2所示,TFA摩尔体积浓度(mol/L)为0.1时,胡萝卜多糖水解后能检测出的单糖总量最高,当TFA摩尔体积浓度(mol/L)高于0.1时,胡萝卜多糖中单糖总量也随之降低。
1.1.2水解温度对胡萝卜多糖水解后单糖总量的影响
准确称取胡萝卜多糖5mg,加入3mL摩尔体积浓度(mol/L)为0.1的三氟乙酸,分别在40℃,60℃,80℃,100℃,120℃条件下水解1h,水解结束后经旋转蒸发除去TFA,再经硫酸进行第二步水解后,进离子色谱仪分析。
结果如图3所示,水解温度在40-80℃时,胡萝卜多糖水解后单糖总量随温度增加而增加,在80℃时达到最大值,水解温度超过80℃时,单糖总量也随之降低。
1.1.3水解时间对胡萝卜多糖水解后单糖总量的影响
准确称取胡萝卜多糖5mg,加入3mL摩尔体积浓度(mol/L)为0.1的三氟乙酸,100℃条件下分别水解0.25h,0.5h,1.0h,1.5h,2.0h,2.5h,水解结束后旋转蒸发除去TFA,再经硫酸进行第二步水解后,进离子色谱仪分析。
结果如图4所示,当水解时间为1.5h时,胡萝卜多糖水解后单糖总量最高。
综上可知,两步水解法中第一步TFA水解的最优条件为:三氟乙酸摩尔体积浓度(mol/L)为0.1,水解温度80℃,水解时间1.5h。
1.2第二步水解条件优化
在第一步水解的最优条件下,对胡萝卜多糖两步水解中的硫酸水解进行条件优化。
准确称取胡萝卜多糖5mg,按照优化得到的最优条件进行第一步水解,反应结束后冷却,旋转蒸发除去TFA,加入摩尔体积浓度(mol/L)为2的硫酸,分别按照温度为100℃、120℃,时间为1h、2h、4h的水解条件进行油浴,水解完成后将样品溶液转移至250mL容量瓶定容,取稀释后的水解样品溶液并用0.22μm水系微孔滤膜过滤,取滤液用离子色谱仪分析。结果如表2所示。由表2可知,当硫酸水解温度为100℃、时间为2h时,胡萝卜多糖水解后单糖总量最高。
表2胡萝卜多糖的硫酸水解条件优化
1.3不同方法水解效果对比
1.3.1一步水解法
取适量胡萝卜多糖,经摩尔体积浓度(mol/L)为2的硫酸在100℃下水解2h后,转移至250mL容量瓶定容,取稀释后的水解样品溶液并用0.22μm水系微孔滤膜过滤,滤液进离子色谱仪分析。
1.3.2醇沉分解法
取适量胡萝卜多糖,经摩尔体积浓度(mol/L)为0.1的三氟乙酸在80℃条件下水解1.5h后,使用无水乙醇将其醇沉至最终浓度为80%,4℃醇沉过夜后离心,分离出已被弱酸水解之后的低聚糖链及未被水解的高聚糖链,再分别用摩尔体积浓度(mol/L)为2的硫酸对这两部分多糖进行水解,条件与一步水解法保持一致,水解后进离子色谱仪分析。
1.3.3两步水解法
取部分胡萝卜多糖,使用本发明中经优化后的两步水解法,即经摩尔体积浓度(mol/L)为0.1的三氟乙酸在80℃条件下水解1.5h后,再经摩尔体积浓度(mol/L)为2的硫酸在100℃下水解2h,水解后进离子色谱仪分析。
分别使用三种方法对胡萝卜多糖进行水解,结果见表3。
表3胡萝卜多糖的一步水解法与两步水解法对比
n.d.,未检测到
采用苯酚-硫酸法测定多糖的中性糖含量,为76.52%;采用咔唑-硫酸法测定多糖中的糖醛酸含量,为47.24%。由表3分析,传统的一步水解法得到的单糖组成结果中,单糖总量远低于表3中显色反应的结果,这一方面是由于在中性糖含量测定中,糖醛酸同样会因苯酚硫酸的作用产生部分显色,导致显色反应的结果比实际结果偏大;另一方面是由于多糖在一步水解的条件下无法完全水解为单糖,导致检测到的单糖含量比实际结果偏小。
采用不同方法水解酸性多糖之后的检测结果中,胡萝卜多糖经一步水解法水解后未能检测出鼠李糖,但两步水解法能检测出一定含量的鼠李糖,除此之外,其他中性糖含量与一步水解法中得到的结果相差不大,但经过两步水解法水解之后的多糖中,检测到的糖醛酸含量相较一步水解法而言有明显的提高,但是,经过醇沉分离的方法得到的检测结果明显低于本发明中所使用的两步水解法,并且醇沉分离的操作较为繁琐,耗时更长,因此本发明提供的两步水解法针对富含糖醛酸的酸性多糖具有更好的水解效果。
实施例2两步水解法在茶多糖中单糖组成分析的应用
(1)茶多糖制备
取一定量的茶叶粉末,使用质量体积浓度为80%的乙醇浸泡过夜,过滤后将滤渣转移至通风橱挥干。取挥干乙醇后的茶叶粉末按照质量体积比(g/mL)1:10在95℃热水中浸提4h,过滤后滤渣按照原条件重复提取两次,合并三次滤液,真空浓缩后加入质量体积浓度为95%乙醇进行醇沉(终浓度达到80%),静置过夜,离心得沉淀,依次用丙酮和无水乙醚各洗涤两次,除去残余的有机试剂之后,冷冻干燥得到茶多糖。
(2)单糖组成分析
准确称取茶多糖5mg,按照实施例2中优化得到的TFA水解最优条件进行第一步水解,反应结束后冷却,旋转蒸发除去TFA,加入摩尔体积浓度(mol/L)为2的硫酸,分别按照温度为100℃、120℃,时间为1h、2h、4h的水解条件进行油浴,水解完成后将样品溶液转移至250mL容量瓶定容,取稀释后的水解样品溶液并用0.22μm水系微孔滤膜过滤,取滤液用离子色谱仪分析。结果如表4所示。由表4可知,当硫酸水解温度为100℃、时间为4h时,茶多糖经水解后单糖总量最高。
表4茶多糖的硫酸水解条件优化
取适量茶多糖,采用苯酚-硫酸法测定多糖的中性糖含量,为52.94%;采用咔唑-硫酸法测定多糖中的糖醛酸含量,为52.02%。同时取茶多糖,在硫酸水解温度和时间分别为100℃和2h的情况下,分别使用实施例1中的三种水解方法对其进行水解,再进离子色谱仪分析,比较三者的效果差异。得到结果如表5。
由表5分析,在一步水解的条件下,未能检测出鼠李糖,仅能检测到2.22%的糖醛酸,但两步水解法明显能检测出一定含量的鼠李糖,以及远高于一步水解法的糖醛酸。同样地,本发明所使用的两步水解法在茶多糖的应用上,效果仍然优于醇沉分解的方法。
表5茶多糖的一步水解法与两步水解法对比
n.d.,未检测到
实施例3两步水解法在秋葵多糖中单糖组成分析的应用
(1)秋葵多糖制备
取一定质量的秋葵果皮,用质量体积浓度为95%乙醇浸泡24h,过滤收集样品,挥干乙醇。称取一定量经挥干乙醇后的干燥秋葵样品,按1:20质量体积比(g/mL)加入蒸馏水,在60℃水浴中加热搅拌4h后,离心收集上清液,真空浓缩后加入质量体积浓度为95%乙醇进行醇沉(终浓度达到80%),静置过夜。离心去上清,收集沉淀,加入蒸馏水复溶,除去残余乙醇后,Saveg法脱蛋白,除去有机试剂,透析,浓缩,冻干得秋葵多糖。
(2)单糖组成分析
准确称取秋葵多糖5mg,按照实施例2中优化得到的TFA水解最优条件进行第一步水解,反应结束后冷却,旋转蒸发除去TFA,加入摩尔体积浓度(mol/L)为2的硫酸,分别按照温度为100℃、120℃,时间为1h、2h、4h的水解条件进行油浴,水解完成后将样品溶液转移至250mL容量瓶定容,取稀释后的水解样品溶液并用0.22μm水系微孔滤膜过滤,取滤液用离子色谱仪分析。结果如表6所示。由表6可知,当硫酸水解温度为100℃、时间为4h时,秋葵多糖经水解后单糖总量最高。
表6秋葵多糖的硫酸水解条件优化
取适量秋葵多糖,采用苯酚-硫酸法测定多糖的中性糖含量,为73.25%;采用咔唑-硫酸法测定多糖中的糖醛酸含量,为44.93%。同时取秋葵多糖,在硫酸水解温度和时间分别为100℃和2h的情况下,分别使用实施例1中的三种水解方法对其进行水解,再进离子色谱仪分析,比较三者的效果差异。得到结果如表7。
由表7分析,单糖总量低于中性糖含量和糖醛酸含量之和,但相较于一步水解法,醇沉分离及两步水解法均明显提高了秋葵多糖经水解后的单糖总量,尤其是较大程度的提高了糖醛酸的含量,而本发明提供的两步水解法,不仅较于经醇沉分离的方法而言水解效果更好、操作更为简便快捷,还能检测出一步水解和醇沉分解未检测到的一定含量的葡萄糖醛酸。
表7秋葵多糖的一步水解法与两步水解法对比
n.d.,未检测到
以上所述仅是本发明的实施方式,应当指出:对于本技术领域的技术人员而言,在不脱离发明原理的情况下,可以对本发明作出适当改进,这些改进也应列入本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种酸性多糖中单糖组成的测定方法,其特征在于,由以下步骤组成:
(1)多糖水解:称取5mg多糖,加入3mL三氟乙酸溶液加热进行第一步水解,反应结束后再冷却,之后加入3mL浓度为2mol/L的硫酸进行第二步水解,于100℃水解2h,水解完成后将样品溶液转移至250mL容量瓶定容,然后取稀释后的水解样品溶液并用0.22μm水系微孔滤膜过滤,取滤液用离子色谱仪分析;
(2)检测条件:所述离子色谱仪为DIONEX ICS-5000,柱子采用CarboPac TMPA20分析柱3mm×150mm,柱温箱温度为30.0℃;检测系统为电化学检测器,检测温度为25.0℃;流动相由浓度为0.25mol/L的氢氧化钠溶液、浓度为1mol/L的醋酸钠溶液和超纯水组成,梯度洗脱;
其中,所述第一步水解中三氟乙酸的浓度为0.03-0.06mol/L,水解温度70-90℃,水解时间0.45-1.25h。
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