CN108982733A - 一种分析多糖组成结构的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分析多糖组成结构的方法。对待测多糖样品进行n次梯度酸水解，首先，对待测多糖样品进行第一次酸水解，水解液进行离心过滤，得到滤出液和截留液，对第一次酸水解至第(n‑1)次酸水解得到的截留液均进行酸水解、以及对每次得到的水解液进行离心过滤，得到n种滤出液，并在第n次酸水解之后得到最终截留液；分别取n种滤出液，并分别加入等量的衍生化试剂，得到滤出液衍生物；取最终截留液进行部分酸水解，向水解产物中加入衍生化试剂，得到截留液衍生物，对二糖进行分析；分别取n种滤出液和最终截留液进行完全酸水解，取完全酸水解产物、n种滤出液、标准品进行气相色谱分析，鉴定单糖种类。本发明适用范围广、成本低、方便快捷。
Description
技术领域
本发明涉及多糖检测技术领域，具体涉及一种利用梯度酸水解分析多糖组成结构的方法。
背景技术
多糖是由十个以上的单糖脱水缩合而成的聚合物，其广泛存在于动植物和微生物中，是维持生命正常运转的基本物质之一。近年来，植物、菌类、海洋生物等来源的多糖已作为有生物活性的天然产物中的一个重要类型出现，其具有的抗肿瘤、免疫、抗凝血、降血糖和抗病毒活性的特性相继被发现。
多糖的活性和其结构是息息相关的。目前，通常采用酶解法、单糖组成分析法、甲基化分析法和核磁分析法等方法对多糖的结构进行解析。然而，上述分析方法具有如下缺陷：酶解法中的特异性酶只针对个别二糖，导致该方法价格昂贵，限制了多糖种类的发现；单糖组成分析法仅能够得到单糖的信息；甲基化分析法花费的时间较长；核磁分析法需要对待测样品进行反复纯化，过程过于复杂。因此，亟需一种快速、便捷且能够获得较全面信息的检测方法。
发明内容
鉴于上述多糖检测方法中存在的缺陷，本发明旨在提供一种新的利用梯度酸水解来分析多糖组成结构的方法。
本发明提供了一种分析多糖组成结构的方法，包括如下步骤：
梯度酸水解：对待测多糖样品进行n次梯度酸水解，所述n为大于等于1的整数，首先，对所述待测多糖样品进行第一次酸水解，将得到的水解液进行离心过滤，得到滤出液和截留液，并且，对所述第一次酸水解至第(n-1)次酸水解得到的所述截留液均进行酸水解处理、以及对每次所述酸水解处理得到的所述水解液进行离心过滤处理，得到n种滤出液，并在第n次酸水解之后得到最终截留液；
二糖的鉴定：分别取W1克所述n种滤出液，并分别向其中加入等量的衍生化试剂，使所述n种滤出液进行充分的衍生化反应，得到滤出液衍生物；取W2克所述最终截留液进行部分酸水解，得到水解产物，并向所述水解产物中加入所述衍生化试剂，使所述最终截留液进行充分的衍生化反应，得到截留液衍生物；利用高效液相色谱-线性离子阱质谱对所述滤出液衍生物和所述截留液衍生物中的二糖进行结构和组成的分析；
单糖的鉴定：分别取W3克所述n种滤出液和W4克所述最终截留液进行完全酸水解处理，得到完全酸水解产物；
取所述完全酸水解产物、分别取W3克所述n种滤出液、分别取W5克标准品进行气相色谱分析，鉴定所述待测多糖样品中的单糖种类。
作为本发明优选的实施方式，所述梯度酸水解的具体过程为：将所述待测多糖样品溶于浓度为M1的水解液中，在95～110℃水解0.5～1.5h，水解后的水解液进行浓缩处理除去溶剂，然后加水复溶，再进行所述离心过滤处理，得到第一滤出液和第一截留液，所述第一滤出液记为M1L；所述第一截留液浓缩至干，并溶于浓度为M2的所述水解液中，然后进行所述水解、浓缩、加水复溶、离心过滤处理后，得到第二滤出液和第二截留液，所述第二滤出液记为M2L；所述第二截留液浓缩至干，并溶于浓度为M3的所述水解液中，然后进行所述水解、浓缩、加水复溶、离心过滤处理后，得到第三滤出液和第三截留液，所述第三滤出液记为M3L；
同理，依次得到M1L、M2L、M3L........MnL；
其中，所述Mn＞……＞M3＞M2＞M1；
并将所述第n次酸水解之后得到的所述最终截留液记为MnJ；
优选的，所述水解液选用三氟乙酸；优选的，所述n取1～4。
作为本发明优选的实施方式，制备所述滤出液衍生物的具体过程为：分别取W1克所述n种滤出液置于反应容器中，并充分溶于等量氨水中，然后分别加入与所述氨水等量的衍生化试剂，分别将所述反应容器密封后，在40～90℃水浴20～90min，然后向所述反应容器中加入甲醇，浓缩处理除去溶剂，并重复该所述浓缩处理过程至少两次，再分别加入氯仿和乙酸水溶液进行萃取，然后除去氯仿，并重复该所述萃取过程至少两次，在水层中得到所述滤出液衍生物。
作为本发明优选的实施方式，制备所述截留液衍生物的具体过程为：取W2克所述最终截留液在100～120℃水解1～4h，得到的水解液浓缩除去溶剂，再加入氨水和与所述氨水等量的所述衍生化试剂，密封后在40～90℃水浴20～90min，然后向所述反应容器中加入甲醇，并进行浓缩处理除去溶剂，重复该所述浓缩处理过程至少两次，再加入氯仿和乙酸水溶液进行萃取，重复该所述萃取过程至少两次，在水层中得到所述截留液衍生物。
进一步的，所述衍生化试剂选用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液。
作为本发明优选的实施方式，进行所述高效液相色谱-线性离子阱质谱操作时，高效液相色谱仪的操作条件为：
色谱柱：Silgreen ODS C18，色谱柱规格为：250×4.6mm，5μm；柱温：30℃；流动相：20mmol乙酸铵水溶液：乙腈＝83:17等度洗脱；流速：1mL/min。
作为本发明优选的实施方式，进行所述高效液相色谱-线性离子阱质谱操作时，线性离子阱质谱仪的操作条件为：
离子源：ESI源；喷雾电压：4.5kV；正离子模式；扫描方式：全扫描；扫描范围：100～2000m/z。
作为本发明优选的实施方式，所述完全酸水解处理的具体过程为：分别取W3克所述n种滤出液和W4克所述最终截留液，并分别溶于水解液中在115～120℃水解2～4h，使得所述n种滤出液和所述最终截留液分别完全水解为单糖；优选的，所述水解液选用三氟乙酸；更优选的，所述三氟乙酸的浓度为1～3mol/L。
进一步的，所述标准品选自鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸中的一种或多种。
作为本发明优选的实施方式，在进行所述气相色谱分析之前，还包括如下步骤：
向所述完全水解产物、所述n种滤出液、所述标准品中分别加入碳酸钠，然后加入硼氢化钠进行还原反应，滴定乙酸至无气泡产生结束所述还原反应，然后通过阳离子交换柱并用水进行洗脱，在80～95℃时真空加热2～5h，向得到的残渣中加入吡啶和正丙胺，在50～65℃反应20～40min后蒸干，再加入吡啶和乙酸酐，静置之后溶于氯仿中，用水萃取，得到的产物进行所述气相色谱分析。
本发明提供的方法能够快速的推测出混合多糖样品中的各种多糖的结构信息，不需要对多糖样品进行反复纯化，测定时间短，成本低，方便快捷。并且，本发明的方法适用于多种多糖的检测，不仅适用于酸性多糖，也适用于中性多糖；不仅适用于均多糖，也适用于杂多糖。相对于传统酶解法的局限性而言，本发明采用的酸水解法几乎对所有的多糖都有降解作用。因此，本发明方法的适用范围更广，成本更低。
附图说明
图1为实施例中0.05L样品的主要二糖PMP衍生物选择离子色谱图。
图2为实施例中0.2L样品的主要二糖PMP衍生物选择离子色谱图。
图3为实施例中0.5L样品的主要二糖PMP衍生物选择离子色谱图。
图4为实施例中截留液0.5J中的主要二糖峰面积图。
图5为实施例中0.05L、0.2L、0.5L、0.5J的质谱图。
图6为实施例中0.05L、0.2L、0.5L、0.5J的单糖组成气相色谱图。
其中，图6中的：
图6A为实施例中0.05L衍生化处理后得到的气相色谱图。
图6B为实施例中0.05L经完全酸水解、衍生化后得到的气相色谱图。
图6C为实施例中0.2L衍生化处理后得到的气相色谱图。
图6D为实施例中0.2L经完全酸水解、衍生化后得到的气相色谱图。
图6E为实施例中0.5L衍生化处理后得到的气相色谱图。
图6F为实施例中0.5L经完全酸水解、衍生化后得到的气相色谱图。
图6G为实施例中0.5J经完全酸水解、衍生化后得到的气相色谱图。
图6H为实施例中11种标准品衍生化处理后得到的气相色谱图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。其中，实施例中未注明具体条件者，按照常规实验条件或制造商建议的条件进行。实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
本发明提出了一种实用性较为广泛的分析多糖组成结构的方法，包括如下步骤：
1、梯度酸水解
对待测多糖样品进行n次梯度酸水解，其中，n为大于等于1的整数。首先，对待测多糖样品进行第一次酸水解，将得到的水解液进行离心过滤，得到滤出液和截留液。并且，对第一次酸水解至第(n-1)次酸水解得到的截留液均进行酸水解处理、以及对每次酸水解处理得到的水解液进行离心过滤处理，得到n种滤出液，并在第n次酸水解之后得到最终截留液。
在本发明中，根据每一次酸水解后得到的样品量确定梯度酸水解的程度。具体的，每一次酸水解得到的水解液经离心过滤后得到的截留液的量控制为本次酸水解前样品量的1/10～2/3。
本发明中，实施梯度酸水解的具体过程为：将待测多糖样品溶于浓度为M1的水解液中，在95～110℃水解0.5～1.5h，水解后的水解液进行浓缩处理除去溶剂，然后加水复溶，再进行离心过滤处理，得到第一滤出液和第一截留液。其中，第一滤出液记为M1L。
上述第一截留液浓缩至干，并溶于浓度为M2的水解液中，在95～110℃水解0.5～1.5h，然后进行浓缩、加水复溶、离心过滤处理后，得到第二滤出液和第二截留液。其中，第二滤出液记为M2L。
上述第二截留液浓缩至干，并溶于浓度为M3的水解液中，在95～110℃水解0.5～1.5h，然后进行浓缩、加水复溶、离心过滤处理后，得到第三滤出液和第三截留液。其中，第三滤出液记为M3L。
同理，依次得到M1L、M2L、M3L........MnL。并且，第n次酸水解之后得到的最终截留液记为MnJ。
并且，进行梯度酸水解的条件是越来越剧烈的，即水解液的浓度Mn＞……＞M3＞M2＞M1。
本发明中，n的取值范围为1～4，即，最多对待测多糖样品进行4次酸水解。这是因为，当对待测多糖样品进行超过4次酸水解之后，并不能提供更多有效的信息，反而浪费时间和成本。
本发明中，水解液的种类没有特别限制。在本发明的实验环境中，水解液优选三氟乙酸。
2、二糖的鉴定
(1)分别取W1克n种滤出液，并分别向其中加入等量的衍生化试剂，使n种滤出液进行充分的衍生化反应，得到滤出液衍生物。
本发明中，制备滤出液衍生物的具体过程为：
分别取W1克n种滤出液置于反应容器中，并充分溶于等量氨水中，再分别加入与氨水等量的衍生化试剂。分别将反应容器密封后，在40～90℃水浴20～90min。然后，向水浴反应后的反应容器中加入0.5～2mL甲醇，再对其进行浓缩处理除去溶剂，并重复该浓缩处理过程至少两次。接着，向反应容器中分别加入0.5～2mL氯仿和含0.1wt％乙酸的水溶液并混合均匀，之后进行萃取，静置分层后除去氯仿，重复该萃取过程至少两次，在水层中得到滤出液衍生物。
作为本发明优选的实施方式，衍生化试剂选用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液。更优选的，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液的浓度为0.1mol/L。
(2)取W2克最终截留液进行部分酸水解，得到水解产物。该部分酸水解过程，能够使水解产物中含有最大量的多糖。然后，向水解产物中加入衍生化试剂，使最终截留液进行充分的衍生化反应，得到截留液衍生物。
本发明中，制备截留液衍生物的具体过程为：
取W2克最终截留液溶于1～2mol/L的三氟乙酸水溶液中，在100～120℃水解1～4h。优选的，部分酸水解条件为：将最终截留液溶于1.3mol/L的三氟乙酸水溶液中，在105℃中水解3h。得到的水解液浓缩除去溶剂，重复该浓缩处理过程至少两次。然后，向反应容器中加入0.2～2mL氨水溶解其中的残渣，再加入与氨水等量的衍生化试剂。接着，将反应容器密封，并在40～90℃水浴20～90min，并进行浓缩处理除去溶剂。然后向水浴后的反应容器中加入0.5～2mL甲醇，进行浓缩处理除去溶剂，重复该浓缩处理过程至少两次，目的是除去残留的氨水。再向反应容器中加入0.5～2mL氯仿和含0.1wt％乙酸的水溶液，混合均匀后，进行萃取，静置分层后，除去氯仿，重复该萃取过程至少两次，在水层中得到截留液衍生物。
作为本发明优选的实施方式，衍生化试剂选用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液。更优选的，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液的浓度为0.1mol/L。
(3)上述步骤含有滤出液衍生物的水层和含有截留液衍生物的水层分别经微孔滤膜过滤后，利用高效液相色谱-线性离子阱质谱(HPLC-ESI-MSn)对其中的二糖进行结构和组成的分析。
其中，高效液相色谱仪的操作条件为：流动相选用20mmol的乙酸铵水溶液和乙腈，二者的质量配比为：20mmol的乙酸铵水溶液/乙腈＝83:17，进行等度洗脱。流动相的流速为1mL/min。色谱柱为Silgreen ODS C18；色谱柱规格为：250×4.6mm，5μm；柱温：30℃。
线性离子阱质谱仪的操作条件为：离子源选用ESI源；喷雾电压为4.5kV；正离子模式；全扫描的扫描方式；扫描范围为100～2000m/z。
3、单糖的鉴定
(1)分别取W3克n种滤出液和W4克最终截留液进行完全酸水解处理，得到完全酸水解产物。
完全酸水解处理的具体过程为：分别取W3克n种滤出液和W4克最终截留液，并分别溶于水解液中，在115～120℃水解2～4h，使得n种滤出液和最终截留液分别完全水解为单糖。对酸水解液进行浓缩处理除去溶剂，再加入0.5～2mL甲醇，并浓缩除去溶剂，重复该浓缩过程至少两次。
作为本发明优选的实施方式，水解液选用三氟乙酸。进一步的，三氟乙酸的浓度为1～3mol/L。
(2)取上述得到的完全酸水解产物、分别取W3克n种滤出液、分别取W5克标准品进行气相色谱分析，鉴定待测多糖样品中的单糖种类。
其中，标准品选自鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸中的一种或多种。
作为本发明优选的实施方式，W1～W5的取值范围均为0.0001～0.1。
本发明中，在进行气相色谱分析之前，还包括如下步骤：
向上述完全酸水解产物、n种滤出液和标准品中分别加入1～3mL浓度为0.5mol/L的碳酸钠溶液，混匀后在20～30℃静置40～50min。再分别向反应容器中加入10～60mg硼氢化钠进行还原反应，室温下静置1.5h后，滴定乙酸，直至无气泡产生后结束还原反应。
然后，将还原反应产物过阳离子交换柱，并用水进行洗脱，洗脱液在40～70℃减压蒸干。接着加入1～5mL 0.1％(v/v)的盐酸/甲醇溶液。其中，盐酸的质量浓度为36～38％，浓缩处理除去溶剂，并重复该浓缩处理过程至少两次，目的是除去过量的硼酸盐。
然后，在80～95℃的条件下真空加热2～5h，并向得到的残渣中分别加入等量的0.5～3mL吡啶和正丙胺，充分溶解后，在50～65℃反应20～40min后浓缩除去溶剂。
再向反应容器中加入等量的0.5～3mL吡啶和乙酸酐，摇匀，静置一夜后浓缩除去溶剂。
然后，向反应容器中加入等量的0.5～2mL水和氯仿进行萃取，静置分层后，弃水相，重复该萃取过程至少两次，取氯仿层为供试液。供试液经微孔滤膜过滤后，进行气相色谱分析。
需要说明的是，在本发明的方法中，在各溶解、水浴、萃取等过程所使用的无机试剂或有机试剂并不做限制，任何能实现相应目的的试剂均属于本发明的保护范围。
实施例
1、多糖样品的梯度酸水解
青蛤贝肉干粉脱脂、除蛋白、醇沉处理后得到青蛤多糖。
a、取300mg青蛤多糖溶于10mL浓度为0.05mol/L的三氟乙酸水解液中，并在100℃水解1h。水解得到的水解液经浓缩处理除去溶剂。向反应容器中加入1mL甲醇，浓缩处理除去溶剂，并重复该浓缩处理过程三次。再加水复溶，然后采用超滤离心管进行离心过滤，得到滤出液和截留液。其中，离心过程的截留量为3000Da。
将该步骤得到的滤出液收集，并冻干备用，记为0.05L。
b、将a步骤得到的截留液浓缩至干，然后加入5mL浓度为0.2mol/L的三氟乙酸水解液，在100℃水解1h。水解得到的水解液浓缩除去溶剂。向反应容器中加入1mL甲醇，浓缩处理除去溶剂，并重复该浓缩处理过程三次。加水复溶后，采用超滤离心管进行离心过滤，得到滤出液和截留液。其中，离心过程的截留量为3000Da。
将该步骤得到的滤出液收集，并冻干备用，记为0.2L。
c、将b步骤得到的截留液浓缩至干，然后加入5mL浓度为0.5mol/L的三氟乙酸水解液，在100℃水解1h。水解得到的水解液浓缩除去溶剂。向反应容器中加入1mL甲醇，浓缩处理除去溶剂，并重复该浓缩处理过程三次。加水复溶后，采用超滤离心管进行离心过滤，得到滤出液和截留液。其中，离心过程的截留量为3000Da。
将该步骤得到的滤出液收集，并冻干备用，记为0.5L。
d、将该步骤得到的截留液收集，并冻干备用，记为0.5J。
2、二糖的鉴定
(1)滤出液的衍生化反应
分别取0.05L、0.2L、0.5L各5mg置于适当的反应容器中，并分别加入400μL 25wt％的氨水使其溶解(wt％为质量浓度)，再分别加入400μL浓度为0.1mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液。然后将各反应容器密封，在70℃时水浴30min，并进行浓缩处理除去溶剂。然后向反应容器中分别加入1mL甲醇，并浓缩除去溶剂，重复该浓缩除去溶剂过程三次。接着，分别加入1mL氯仿和1mL含0.1wt％乙酸的水溶液进行萃取，静置分层后，除去氯仿，并重复该萃取过程三次，得到的滤出液衍生物存在于水层中，即水层为供试液。
(2)截留液的衍生化反应
取5mg截留液0.5J于适当的反应容器中，并用2mL浓度为1.3mol/L的三氟乙酸溶解后，在105℃水解3h。水解得到的酸水解液浓缩除去溶剂。然后，向反应容器中加入0.5mL甲醇，浓缩处理除去溶剂，并重复该浓缩处理过程三次。
向反应容器中加入400μL 25wt％的氨水使反应容器中的物料溶解，再加入400μL浓度为0.1mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液。然后将反应容器密封，于70℃水浴30min，并进行浓缩处理除去溶剂。然后向反应容器中加入1mL甲醇，并浓缩除去溶剂，重复该浓缩过程三次。接着，分别加入1mL氯仿和1mL含0.1wt％乙酸的水溶液并混合均匀，进行萃取，静置分层后，除去氯仿，并重复该萃取过程三次，水层为供试液。
(3)二糖的分析
步骤(1)和步骤(2)得到的水层供试液分别经微孔滤膜过滤后，利用高效液相色谱-线性离子阱质谱来检测滤出液衍生物和截留液衍生物中的二糖片段。
其中，进行高效液相色谱分析的具体过程为：
高效液相色谱仪由Thermo Scientific公司生产；色谱柱采用Silgreen ODS C18，规格为250×4.6mm，5μm；柱温为30℃；流动相为20mmol乙酸铵水溶液(A)：乙腈(B)＝83:17等度洗脱；流速为1mL/min。
进行线性离子阱质谱分析的具体过程为：
线性离子阱质谱仪由Thermo Scientific公司生产；离子源为ESI源；喷雾电压为4.5kV；采用正离子模式；扫描方式为全扫描(Full Scan)；扫描范围为100～2000m/z。
由图1-图4所示，经筛查色谱峰的紫外光谱和质谱信号，发现0.05L、0.2L、0.5L、0.5J样品中，主要二糖的PMP衍生物准分子离子峰质荷比有686、673、671、685、657。
其中，图1是提取0.05L的二糖PMP衍生物准分子离子峰质荷比673得到的选择离子色谱图。分子离子m/z 673[M+H]+在二级质谱(MS2)产生碎片离子m/z 511[己糖+2PMP-H2O+H]+，并且碎片离子m/z 511在三级质谱(MS3)产生m/z 175[PMP+H]+，见图5，据此推断m/z673是己糖通过糖苷键连于己糖的二糖片段。
图2是提取0.2L的二糖PMP衍生物准分子离子峰质荷比671、673、685、657得到的选择离子色谱图。分子离子m/z 671[M+H]+在二级质谱产生碎片离子m/z 495[脱氧己糖+2PMP-H2O+H]+，并且碎片离子m/z 495在三级质谱(MS3)产生m/z 175[PMP+H]+，见图5，据此推断m/z 671是脱氧己糖通过糖苷键连于己糖醛酸的二糖片段。分子离子m/z 657[M+H]+在二级质谱产生碎片离子m/z 495[脱氧己糖+2PMP-H2O+H]+，并且碎片离子m/z 495在三级质谱(MS3)产生m/z 175[PMP+H]+，据此推断m/z 657是脱氧己糖通过糖苷键连于己糖的二糖片段。分子离子m/z 685[M+H]+在二级质谱(MS2)产生碎片离子m/z 495[脱氧己糖+2PMP-H2O+H]+，并且碎片离子m/z 495在三级质谱(MS3)产生m/z 175[PMP+H]+，据此推断m/z 685是脱氧己糖通过糖苷键连于带一个甲基的己糖醛酸二糖片段。
图3是提取0.5L的二糖PMP衍生物准分子离子峰质荷比671、673得到的选择离子色谱图，分析可知m/z 671是脱氧己糖通过糖苷键连于己糖醛酸的二糖片段，m/z 673是己糖通过糖苷键连于己糖的二糖片段。
图4是提取0.5J的二糖PMP衍生物准分子离子峰质荷比686、671得到的选择离子色谱图，分析可知m/z 686是氨基己糖通过糖苷键连于己糖醛酸的二糖片段，m/z 671是脱氧己糖通过糖苷键连于己糖醛酸的二糖片段。
3、单糖的鉴定
分别取0.05L、0.2L、0.5L、0.5J各5mg，分别向其中加入2mL浓度为2mol/L的三氟乙酸水解液溶解后，在120℃水解2h，能够将上述样品完全水解为单糖。水解得到的酸水解液浓缩除去溶剂，然后再加入0.5mL甲醇，浓缩除去溶剂，重复该浓缩过程三次，得到完全酸水解产物。
准备样品：分别取11种标准品(鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸)各5mg，0.05L、0.2L、0.5L各5mg，向这些样品以及上述过程得到的完全酸水解产物中分别加入2mL浓度为0.5mol/L的碳酸钠溶液，摇匀后，30℃时静置45min，再分别加入20mg硼氢化钠进行还原反应，摇匀后，室温静置1.5h，缓慢滴加冰乙酸直至无气泡产生结束反应。然后将得到的溶液通过阳离子交换柱，洗脱液于45℃减压蒸干。重复三次加入5mL0.1％(v/v)盐酸/甲醇溶液(盐酸的质量浓度为36％)，并减压蒸干，除去过量的硼酸盐。在85℃真空加热2h后，再加入2.0mL吡啶和2.0mL正丙胺，密封后，在55℃反应30min，减压蒸干后依次加入1.0mL吡啶和1.0mL乙酸酐，摇匀，静置一夜后浓缩处理除去溶剂。再加入1mL氯仿和1mL蒸馏水进行萃取，静置分层后，弃水相，氯仿层为供试液，并重复该萃取过程三次。
供试液经微孔滤膜过滤后，进行气相色谱分析。气相色谱分析过程中选择的色谱柱是Rtx-5，规格为30.0m×0.25mm×0.25μm；进样口温度为270℃；检测器温度为270℃。分析过程选用氮气作为载气，流速为3.0mL/min，分流比为50：1，进样1.0μL。色谱柱升温条件控制为：160℃维持1min然后以0.4℃/min的速率升温到215℃，再以6℃/min升温至270℃。
图6为各滤出液和截留液的单糖组成气相色谱图。其中，图6A、6C、6E分别是0.05L、0.2L和0.5L未经完全酸水解而直接进行衍生化处理得到的气相色谱图。图6B、6D、6F、6G分别是0.05L、0.2L、0.5L、0.5J经过完全酸水解之后再进行衍生化得到的气相色谱图。图6H是11种标准品进行衍生化得到的色谱图。
通过对比图6A和图6B，发现Glc明显增加，结合HPLC-ESI-MSn的分析结果，故推断m/z 673在27.5min的结构为Glc-Glc。
通过对比图6C和图6D，发现Fuc增加，Glc和Gal两种己糖都有增加，故推断m/z 657的结构为Fuc-Glc或Fuc-Gal。并且由于GlcA明显增加，推断m/z 671的结构为Fuc-GlcA，m/z685的结构为MeGlcA-Fuc。
通过对比图6E和图6F，发现Gal和Glc增多，故推断在21.7min m/z 673的结构为Gal-Glc/Gal。
通过图6G和图6H，与二糖标准品PMP衍生物的保留时间和质谱数据的比对，可知m/z 686的结构为GlcN-IdoA。
其中，Glc代表葡萄糖，Fuc代表岩藻糖，Gal代表半乳糖，GlcA代表葡萄糖醛酸，GlcN代表氨基葡萄糖，Rha代表鼠李糖，GalN代表氨基半乳糖，Xyl代表木糖，GalA代表半乳糖醛酸。
本步骤的目的是为了对比各滤出液经完全酸水解后以及未进行完全酸水解时，其中单糖的变化，并且，能够检测截留液中的单糖组成。
通过步骤2的过程得到的二糖鉴定的信息，能够分析出青蛤多糖中的二糖片段结构组成，并且，通过步骤3的过程能够得到由二糖水解得到的单糖种类。
综合以上分析结果就能够得出青蛤多糖水解得到的二糖片段结构组成，从而推测出青蛤多糖中主要多糖的结构。
通过对图1-图6的谱图信息进行分析汇总，能够得到青蛤多糖中主要多糖的结构信息，如表1所示。
表1青蛤中主要的多糖组成
最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种分析多糖组成结构的方法，其特征在于，包括如下步骤：
梯度酸水解：对待测多糖样品进行n次梯度酸水解，所述n为大于等于1的整数，首先，对所述待测多糖样品进行第一次酸水解，将得到的水解液进行离心过滤，得到滤出液和截留液，并且，对所述第一次酸水解至第(n-1)次酸水解得到的所述截留液均进行酸水解处理、以及对每次所述酸水解处理得到的所述水解液进行离心过滤处理，得到n种滤出液，并在第n次酸水解之后得到最终截留液；
二糖的鉴定：分别取W1克所述n种滤出液，并分别向其中加入等量的衍生化试剂，使所述n种滤出液进行充分的衍生化反应，得到滤出液衍生物；取W2克所述最终截留液进行部分酸水解，得到水解产物，并向所述水解产物中加入所述衍生化试剂，使所述最终截留液进行充分的衍生化反应，得到截留液衍生物；利用高效液相色谱-线性离子阱质谱对所述滤出液衍生物和所述截留液衍生物中的二糖进行结构和组成的分析；
单糖的鉴定：分别取W3克所述n种滤出液和W4克所述最终截留液进行完全酸水解处理，得到完全酸水解产物；
取所述完全酸水解产物、分别取W3克所述n种滤出液、分别取W5克标准品进行气相色谱分析，鉴定所述待测多糖样品中的单糖种类。
2.根据权利要求1所述的分析多糖组成结构的方法，其特征在于，所述梯度酸水解的具体过程为：将所述待测多糖样品溶于浓度为M1的水解液中，在95～110℃水解0.5～1.5h，水解后的水解液进行浓缩处理除去溶剂，然后加水复溶，再进行所述离心过滤处理，得到第一滤出液和第一截留液，所述第一滤出液记为M1L；所述第一截留液浓缩至干，并溶于浓度为M2的所述水解液中，然后进行所述水解、浓缩、加水复溶、离心过滤处理后，得到第二滤出液和第二截留液，所述第二滤出液记为M2L；所述第二截留液浓缩至干，并溶于浓度为M3的所述水解液中，然后进行所述水解、浓缩、加水复溶、离心过滤处理后，得到第三滤出液和第三截留液，所述第三滤出液记为M3L；
同理，依次得到M1L、M2L、M3L……..MnL；
其中，所述Mn＞……＞M3＞M2＞M1；
并将所述第n次酸水解之后得到的所述最终截留液记为MnJ；
优选的，所述水解液选用三氟乙酸；优选的，所述n取1～4。
3.根据权利要求1所述的分析多糖组成结构的方法，其特征在于，制备所述滤出液衍生物的具体过程为：分别取W1克所述n种滤出液置于反应容器中，并充分溶于等量氨水中，然后分别加入与所述氨水等量的衍生化试剂，分别将所述反应容器密封后，在40～90℃水浴20～90min，然后向所述反应容器中加入甲醇，浓缩处理除去溶剂，并重复该所述浓缩处理过程至少两次，再分别加入氯仿和乙酸水溶液进行萃取，然后除去氯仿，并重复该所述萃取过程至少两次，在水层中得到所述滤出液衍生物。
4.根据权利要求1所述的分析多糖组成结构的方法，其特征在于，制备所述截留液衍生物的具体过程为：取W2克所述最终截留液在100～120℃水解1～4h，得到的水解液浓缩除去溶剂，再加入氨水和与所述氨水等量的所述衍生化试剂，密封后在40～90℃水浴20～90min，然后向所述反应容器中加入甲醇，并进行浓缩处理除去溶剂，重复该所述浓缩处理过程至少两次，再加入氯仿和乙酸水溶液进行萃取，重复该所述萃取过程至少两次，在水层中得到所述截留液衍生物。
5.根据权利要求3或4所述的分析多糖组成结构的方法，其特征在于，所述衍生化试剂选用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液。
6.根据权利要求1所述的分析多糖组成结构的方法，其特征在于，进行所述高效液相色谱-线性离子阱质谱操作时，高效液相色谱仪的操作条件为：
色谱柱：Silgreen ODS C18，色谱柱规格为：250×4.6mm，5μm；柱温：30℃；流动相：20mmol乙酸铵水溶液：乙腈＝83:17等度洗脱；流速：1mL/min。
7.根据权利要求1所述的分析多糖组成结构的方法，其特征在于，进行所述高效液相色谱-线性离子阱质谱操作时，线性离子阱质谱仪的操作条件为：
离子源：ESI源；喷雾电压：4.5kV；正离子模式；扫描方式：全扫描；扫描范围：100～2000m/z。
8.根据权利要求1所述的分析多糖组成结构的方法，其特征在于，所述完全酸水解处理的具体过程为：分别取W3克所述n种滤出液和W4克所述最终截留液，并分别溶于水解液中在115～120℃水解2～4h，使得所述n种滤出液和所述最终截留液分别完全水解为单糖；优选的，所述水解液选用三氟乙酸；更优选的，所述三氟乙酸的浓度为1～3mol/L。
9.根据权利要求1所述的分析多糖组成结构的方法，其特征在于，所述标准品选自鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸中的一种或多种。
10.根据权利要求1所述的分析多糖组成结构的方法，其特征在于，在进行所述气相色谱分析之前，还包括如下步骤：
向所述完全水解产物、所述n种滤出液、所述标准品中分别加入碳酸钠，然后加入硼氢化钠进行还原反应，滴定乙酸至无气泡产生，结束所述还原反应，然后通过阳离子交换柱并用水进行洗脱，在80～95℃时真空加热2～5h，向得到的残渣中加入吡啶和正丙胺，在50～65℃反应20～40min后蒸干，再加入吡啶和乙酸酐，静置之后溶于氯仿中，用水萃取，得到的产物进行所述气相色谱分析。
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