CN103353505B - 一种采用薄层色谱法鉴别铁皮石斛多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种采用薄层色谱法鉴别铁皮石斛多糖的方法，包括如下步骤：供试品溶液和对照品的制备、薄层色谱法鉴别；所述色谱法为：吸取对照品与供试品溶液各10μL，分别点于微晶纤维素薄层板上，以异戊醇、二氯甲烷、氨水、丁二酸、无水乙醇、水的混合溶液作为展开剂展开，取出，晾干，喷以显色剂，在105℃加热5min，置白光下检视，异戊醇：二氯甲烷：氨水：丁二酸：无水乙醇：水=11：25：18：15：15：10。铁皮石斛水解样品色谱中，在与对照品D-葡萄糖与D-甘露糖色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点。本方法操作简便，实验成本低、分离效果快速、准确，为铁皮石斛进一步质量控制提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种薄层色谱法（TLC法）鉴别铁皮石斛多糖的方法，属于药品鉴别技术领域。
背景技术
铁皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraetMigo）是我国传统名贵中药材，其味甘，性微寒。归胃、肾经。具有益胃生津，滋阴清热等功效。用于热病津伤，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热，目暗不明，筋骨痿软。被誉为“中华九大仙草”之首。现代研究表明，铁皮石斛主要具有如下功效：（1）调节机体免疫作用；（2）益胃生津作用；（3）抗白内障作用；（4）抗肿瘤作用；（5）降血糖作用；（6）抗菌、抗氧化和抗疲劳等作用。
2010年版《中国药典》一部中，铁皮石斛的检查项下规定，采用高效液相法测定，供试品溶液色谱图中，甘露糖峰面积与葡萄糖峰面积的比值应为2.4～8.0。在含量测定项下，既要采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，还规定本品按干燥品计算，含甘露糖（C6H12O6）应为13.0%～38.0%。可见，铁皮石斛中葡萄糖与甘露糖的含量为评价铁皮石斛质量的国家标准。
现有技术中，采用柱前衍生化HPLC法测定铁皮石斛茎和叶多糖中D-甘露糖含量。多糖水解产物加入1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）进行衍生化，采用RP-HPLC法测定多糖中D-甘露糖含量。结果表明，茎和叶中多糖主要是由D-甘露糖和D-葡萄糖组成，茎中D-甘露糖含量比叶中高。
现有技术中也有运用糖组成分析、甲基化分析及NMR等方法确定铁皮石斛多糖DT2和DT3的结构。结果表明，DT2，DT3的数均分子量分别为7.4×105，5.4×105，主要含有D-葡萄糖、D-甘露糖、半乳糖、D-木糖及少量D-阿拉伯糖，摩尔比分别为5.9：0.5：1.0：1.0：0.8：和7.9：0.7：1.3：1.0：0.5。华允芬研究了铁皮石斛单糖组分DOPP-1-A1，结果发现其主要含有的单糖是：D-甘露糖和D-葡萄糖，同时含有少量的D-阿拉伯糖。何铁光经IR、TCL、HPLC分析、比旋光度测定和凝胶过滤法检测表明DCPP1a-1为均一组分的多糖，其平均分子量为189kD，由D-甘露糖和D-葡萄糖按7.015：1的摩尔比组成。其中，D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、D-甘露糖的Rf值相近，难以完全分离。
随着科学仪器及技术手段的发展，目前已有多种方法用于多糖的单糖组分分析中，如HPLC，GC、TLC等。但由于多糖HPLC及GC分析前，必需对其进行衍生化处理，操作繁琐，而且粗糖样品中的非糖成分容易发生污染色谱柱或干扰单糖成分分离，加大实验的难度及成本。而虽然薄层色谱法具有样品制备简单，能够同时进行多个样品分析，所需的仪器设备简单易行，操作简便可行等优点，比较适合生产实际应用，但用TLC鉴别的效果并不好。
发明内容
为了克服上述技术缺陷，本发明提供了一种采用薄层色谱法鉴别铁皮石斛多糖的方法。该方法操作简便，实验成本低、分离效果快速、准确，检测样品无需衍生化，为铁皮石斛进一步质量控制提供依据。
本发明的一种采用薄层色谱法鉴别铁皮石斛多糖的方法，包括如下步骤：
（1）供试品溶液和对照品的制备；
（2）薄层色谱法鉴别；
所述步骤（2）中的色谱法为：吸取步骤（1）中的对照品与供试品溶液各10μL，分别点于微晶纤维素薄层板上，以展开剂展开，取出，晾干，喷以显色剂，在105℃加热5min，置白光下检视。
优选的，所述展开剂为异戊醇、二氯甲烷、氨水、丁二酸、无水乙醇、水的混合溶液，其体积比为异戊醇：二氯甲烷：氨水：丁二酸：无水乙醇：水=11：25：18：15：15：10。
优选的，所述显色剂为苯胺-二苯胺磷酸显色剂，所述苯胺-二苯胺磷酸显色剂为4g二苯胺、4ml苯胺与20ml85％磷酸共溶于200ml丙酮中得到的混合溶液或者相同配比相同组分的混合溶液。
优选的，所述步骤均在10℃～20℃下进行。
优选的，所述步骤均在湿度为32％～72％下进行。
所述标准品为D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-木糖、D-阿拉伯糖和L-鼠李糖。
优选的，所述步骤（1）按如下操作进行：
取铁皮石斛粉末1g，加入100ml纯水，超声30min，离心，上清液减压浓缩至原体积的1/3，加入无水乙醇使其含醇量为80%，4℃静置过夜；离心收集沉淀物，用无水乙醇、丙酮洗涤2次，挥干溶媒，得粗多糖；将多糖溶于水后转入分液漏斗，加入氯仿、正丁醇混合溶液（sevage试剂），剧烈摇振15min，静置30min，弃去有机溶剂层和蛋白层，再加入sevage试剂，反复多次至无明显蛋白质出现为止；所述氯仿、正丁醇混合溶液（sevage试剂）为氯仿、正丁醇混合溶液，其中，氯仿：正丁醇的体积比=4：1；加无水乙醇至含醇量为80%，4℃静置过夜，离心，将沉淀打散，分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤3次，真空干燥至恒重得多糖；称取多糖15mg，加入2mol/L三氟乙酸5mL，100℃密闭水解5h，用NaCO3调节pH到中性，所得溶液可用于薄层分析。
按上述方法进行鉴别，按如下标准进行判断：铁皮石斛TLC图谱，标准单糖在薄层色谱展开图中各自显示如下颜色：D-葡萄糖显示墨绿色，D-甘露糖显示深蓝色，D-果糖显示浅红色，D-木糖显示棕黄色，D-阿拉伯糖显示深棕色，L-鼠李糖显示淡黄色；铁皮石斛水解样品色谱中，在与对照品D-葡萄糖与D-甘露糖色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点。
本方法薄层色谱中采用的是一次性薄层板，便于粗糖的分析；选用异戊醇、二氯甲烷、氨水、丁二酸、无水乙醇、水的混合溶液作为展开剂，使同分异构体D-葡萄糖及D-甘露糖得到分离；选用苯胺-二苯胺磷酸显色剂，使得各种单糖斑点在白光下显出不同的颜色，无需通过紫外光辨认。根据显色斑点的颜色、大小及Rf值，可鉴定出铁皮石斛多糖中所存在的糖的种类，并可初步估计其所占比例。
本发明提供的一种采用薄层色谱法鉴别铁皮石斛多糖的方法操作简便，实验成本低、分离效果快速、准确，检测样品也无需衍生化；同时，确定了最佳色谱展开条件，能够分开同分异构体D-葡萄糖及D-甘露糖，为铁皮石斛进一步质量控制提供依据。
附图说明
图1是不同展开剂的薄层色谱图；其中，图1A是展开剂A：乙酸乙酯：异丙醇：水=26：14：7（v/v）的色谱图；图1B是展开剂B：正丁醇：乙酸乙酯：吡啶：水=6：1：5：4（v/v）的色谱图；图1C是展开剂C：乙酸乙酯：正丁醇：异丙醇：嘧啶：醋酸：水=34：12：21：10：12：10（v/v）的色谱图；图1D是展开剂D：异戊醇：二氯甲烷：氨水：丁二酸：无水乙醇：水=11：25：18：15：15：10（v/v）的色谱图，色谱图中从左至右第1-9列依次为D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、L-鼠李糖、多糖水解液1、多糖水解液2、多糖水解液3；
图2是不同薄层板薄层色谱图，其中，图2A为硅胶G薄层板色谱图，图2B为硅胶GF254薄层板色谱图，图2C为微晶纤维素薄层板色谱图，从左至右第1-9列依次为D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、L-鼠李糖、多糖水解液1、多糖水解液2、多糖水解液3；
图3是不同温度条件薄层色谱图，其中，图3A为温度为10℃、15℃、20℃时的薄层板色谱图，图3B为温度为4℃、25℃时的薄层板色谱图，图3C为温度为30℃时的薄层板色谱图，从左至右第1-9列依次为D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、L-鼠李糖、多糖水解液1、多糖水解液2、多糖水解液3；
图4是不同湿度条件薄层色谱图，其中，图4A为湿度达32%、42%、47%、58%时的薄层板色谱图，图4B为湿度达65%、72%时的薄层板色谱图，图4C为湿度达88%时的薄层板色谱图，从左至右第1-9列依次为D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、L-鼠李糖、多糖水解液1、多糖水解液2、多糖水解液3；
图5是用本方法鉴别铁皮石斛得到的铁皮石斛多糖薄层色谱图的一个优选实施例的结果图。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例1展开剂选择实验
选择如下A-D的薄层色谱展开剂进行薄层色谱展开剂系统的选择实验：
展开剂A：乙酸乙酯：异丙醇：水=26：14：7（v/v）
展开剂B：正丁醇：乙酸乙酯：吡啶：水=6：1：5：4（v/v）
展开剂C：乙酸乙酯：正丁醇：异丙醇：嘧啶：醋酸：水=34：12：21：10：12：10（v/v）
展开剂D：异戊醇：二氯甲烷：氨水：丁二酸：无水乙醇：水=11：25：18：15：15：10（v/v）
显色剂：苯胺-二苯胺磷酸显色剂，所述苯胺-二苯胺磷酸显色剂为4g二苯胺、4ml苯胺与20ml体积比浓度为85％的磷酸共溶于200ml丙酮中得到的混合溶液或相同配比及相同组分的混合溶液。
吸取对照品与样品溶液各15μL，分别点于同一块微晶纤维素薄层板上，分别以展开剂A、展开剂B、展开剂C、展开剂D展开，取出，晾干，喷以苯胺-二苯胺磷酸显色剂，在105℃加热5min，置白光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点。
图1是不同展开剂的薄层色谱图；其中，图1A是展开剂A：乙酸乙酯：异丙醇：水=26：14：7（v/v）的色谱图；图1B是展开剂B：正丁醇：乙酸乙酯：吡啶：水=6：1：5：4（v/v）的色谱图；图1C是展开剂C：乙酸乙酯：正丁醇：异丙醇：嘧啶：醋酸：水=34：12：21：10：12：10（v/v）的色谱图；图1D是展开剂D：异戊醇：二氯甲烷：氨水：丁二酸：无水乙醇：水=11：25：18：15：15：10（v/v）的色谱图；色谱图中点样顺序从左至右第1-9列依次为D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、L-鼠李糖、多糖水解液1、多糖水解液2、多糖水解液3，其中，多糖水解液1、多糖水解液2、多糖水解液3是同一批次分别制备的多糖水解液。
比较不同展开剂的薄层色谱图，由图1显示可见，展开剂D中对照品D-葡萄糖与D-甘露糖斑点的Rf值差距较大，适于后续方法学考察工作。以苯胺-二苯胺磷酸作为多糖薄层显色剂，不需要在紫外灯下观察荧光，显色快速，直观，斑点清晰易辨。
实施例2薄层板的选择实验
选用不同薄层板进行薄层板选择实验。所选薄层板有硅胶G薄层板、硅胶GF254薄层板、微晶纤维素薄层板。
吸取对照品与样品溶液各15μL，分别点于不同的薄层板上，以异戊醇：二氯甲烷：氨水：丁二酸：无水乙醇：水（11：25：18：15：15：10）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以苯胺-二苯胺磷酸显色剂，在105℃加热5min，置白光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点。
图2为不同薄层板薄层色谱图，其中，图2A为硅胶G薄层板色谱图，图2B为硅胶GF254薄层板色谱图，图2C为微晶纤维素薄层板色谱图，点样顺序从左至右第1-9列依次为D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、L-鼠李糖、多糖水解液1、多糖水解液2、多糖水解液3，其中，多糖水解液1、多糖水解液2、多糖水解液3是同一批次分别制备的多糖水解液。
比较不同薄层板的薄层色谱图，由图2所示，硅胶G薄层板和硅胶GF254薄层板不能将D-葡萄糖与D-甘露糖斑点进行分离；微晶纤维素薄层板色谱图中，对照品D-葡萄糖与D-甘露糖斑点的Rf值差距较大，斑点清晰易辨，因此后续方法学选择微晶纤维素薄层板作为点样薄层板。
实施例3不同温度比较实验
吸取上述对照品与样品溶液各15μL，分别点于微晶纤维素薄层板上，以异戊醇：二氯甲烷：氨水：丁二酸：无水乙醇：水（11：25：18：15：15：10）为展开剂，分别在温度4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃的条件下展开，取出，晾干，喷以苯胺-二苯胺磷酸显色剂，在105℃加热5min，置白光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点。
图3为不同温度条件薄层色谱图，其中，图3A为温度为10℃、15℃、20℃时的薄层板色谱图，图3B为温度为4℃、25℃时的薄层板色谱图，图3C为温度为30℃时的薄层板色谱图，点样顺序从左至右第1-9列依次为D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、L-鼠李糖、多糖水解液1、多糖水解液2、多糖水解液3，其中，多糖水解液1、多糖水解液2、多糖水解液3是同一批次分别制备的多糖水解液。
比较不同温度条件下的薄层色谱图，由图3可见，环境温度对铁皮石斛多糖薄层色谱有一定的影响。当环境温度为10℃、15℃、20℃时，样品斑点颜色清晰，分离度好，当环境温度为4℃、25℃时，D-葡萄糖和D-甘露糖斑点Rf值很接近，无法实现很好的分离，当温度为30℃时，D-葡萄糖和D-甘露糖样品斑点无法分开。结果表明在10℃～20℃范围内试验，对鉴别无明显的影响。
实施例4不同湿度比较实验
吸取上述对照品与样品溶液各15μL，分别点于微晶纤维素薄层板上，以异戊醇：二氯甲烷：氨水：丁二酸：无水乙醇：水（11：25：18：15：15：10）为展开剂，分别在湿度32%、42%、47%、58%、65%、72%、88%的条件下展开，取出，晾干，喷以苯胺-二苯胺磷酸显色剂，在105℃加热5min，置白光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点。
图4为不同湿度条件薄层色谱图，其中，图4A为湿度达32%、42%、47%、58%时的薄层板色谱图，图4B为湿度达65%、72%时的薄层板色谱图，图4C为湿度达88%时的薄层板色谱图，点样顺序从左至右第1-9列依次为D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、L-鼠李糖、多糖水解液1、多糖水解液2、多糖水解液3。
比较不同湿度条件下的薄层色谱图，由图4所示，空气湿度对铁皮石斛多糖薄层色谱有一定的影响。当空气湿度达32%、42%、47%、58%时，对照品Rf值差距较大，样品斑点明显分开，当空气湿度达65%、72%时，对照品Rf值差距较小，样品斑点仍可以分开，当空气湿度达88%时，对照品Rf值几乎一致，样品斑点也无法分开。结果表明在湿度为32％～72％范围内试验，对鉴别无明显的影响。
实施例5本发明薄层色谱法鉴别铁皮石斛多糖的方法的一个优选实施例
本发明的一种采用薄层色谱法鉴别铁皮石斛多糖的方法，按如下步骤进行：
（1）供试品溶液和对照品的制备：取铁皮石斛粉末1g，加入100ml纯水，超声30min，离心，上清液减压浓缩至原体积的1/3，加入无水乙醇使其含醇量为80%，4℃静置过夜；离心收集沉淀物，用无水乙醇、丙酮洗涤2次，挥干溶媒，得粗多糖；将多糖溶于水后转入分液漏斗，加入氯仿、正丁醇混合溶液(sevage试剂)，剧烈摇振15min，静置30min，弃去有机溶剂层和蛋白层，再加入sevage试剂，反复多次至无明显蛋白质出现为止；所述氯仿、正丁醇混合溶液(sevage试剂)为氯仿、正丁醇混合溶液，其中，氯仿：正丁醇=4：1；加无水乙醇至含醇量为80%，4℃静置过夜，离心，将沉淀打散，分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤3次，真空干燥至恒重得多糖；称取多糖15mg，加入2mol/L三氟乙酸5mL，100℃密闭水解5h，用NaCO3调节pH到中性，所的溶液可用于薄层分析。
（2）薄层色谱法鉴别：吸取步骤（1）中的对照品与供试品溶液各10μL，分别点于微晶纤维素薄层板上，以展开剂展开，取出，晾干，喷以显色剂，在105℃加热5min，置白光下检视。所述展开剂为异戊醇、二氯甲烷、氨水、丁二酸、无水乙醇、水的混合溶液，其体积比为异戊醇：二氯甲烷：氨水：丁二酸：无水乙醇：水=11：25：18：15：15：10。所述显色剂为苯胺-二苯胺磷酸显色剂，所述苯胺-二苯胺磷酸显色剂为4g二苯胺、4ml苯胺与20ml85％磷酸共溶于200ml丙酮中得到的混合溶液。
按上述方法进行鉴别，按如下标准进行判断：铁皮石斛TLC图谱如图1，标准单糖在薄层色谱展开，各自显示如下颜色：第一列至第六列为对照品，第一列为D-葡萄糖，显示墨绿色；第二列为D-甘露糖，显示深蓝色；第三列为D-果糖，显示浅红色；第四列为D-木糖，显示棕黄色；第五列为D-阿拉伯糖，显示深棕色，第六列为L-鼠李糖，显示淡黄色；铁皮石斛水解样品色谱应在与对照品D-葡萄糖与D-甘露糖色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
图5是本发明薄层色谱法鉴别铁皮石斛多糖的方法的一个优选实施例的结果图，由图5可见，第七、八、九列的铁皮石斛水解样品色谱在与对照品D-葡萄糖与D-甘露糖色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。本方法薄层色谱中采用的是一次性薄层板，有利于粗糖的分析；选用异戊醇、二氯甲烷、氨水、丁二酸、无水乙醇、水的混合溶液作为展开剂，使同分异构体D-葡萄糖及D-甘露糖得到分离；选用苯胺-二苯胺磷酸显色剂，使得各种单糖斑点在白光下显出不同的颜色，无需通过紫外光辨认。根据显色斑点的颜色、大小及Rf值，可鉴定出铁皮石斛多糖中所存在的糖的种类，并可初步估计其所占比例。该方法操作简便，实验成本低、分离效果快速、准确，检测样品也无需衍生化；同时，该方法也确定了最佳色谱展开条件，能够分开同分异构体D-葡萄糖及D-甘露糖，为铁皮石斛进一步质量控制提供依据。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (7)
1.一种采用薄层色谱法鉴别铁皮石斛多糖的方法，包括如下步骤：
(1)供试品溶液和对照品的制备；
(2)薄层色谱法鉴别；
所述步骤(2)中的色谱法为：吸取步骤(1)中的对照品与供试品溶液各10μL，分别点于微晶纤维素薄层板上，以展开剂展开，取出，晾干，喷以显色剂，在105℃加热5min，置白光下检视；
其特征在于，
所述展开剂为异戊醇、二氯甲烷、氨水、丁二酸、无水乙醇、水的混合溶液，其体积比为异戊醇：二氯甲烷：氨水：丁二酸：无水乙醇：水＝11：25：18：15：15：10。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述显色剂为苯胺-二苯胺磷酸显色剂，所述苯胺-二苯胺磷酸显色剂为4g二苯胺、4ml苯胺与20ml体积比浓度为85％的磷酸共溶于200ml丙酮中得到的混合溶液或者相同配比相同组分的混合溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤均在10℃～20℃下进行。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤均在湿度为32％～72％下进行。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的供试品溶液的制备按如下操作进行：
取铁皮石斛粉末1g，加入100ml纯水，超声30min，离心，上清液减压浓缩至原体积的1/3，加入无水乙醇使其含醇量为80％，4℃静置过夜；
离心收集沉淀物，用无水乙醇、丙酮洗涤2次，挥干溶媒，得粗多糖；
将粗多糖溶于水后转入分液漏斗，加入氯仿、正丁醇混合溶液，剧烈摇振15min，静置30min，弃去有机溶剂层和蛋白层，再加入氯仿、正丁醇混合溶液，反复多次至无明显蛋白质出现为止；所述氯仿、正丁醇混合溶液中，氯仿：正丁醇＝4：1；
加无水乙醇至含醇量为80％，4℃静置过夜，离心，将沉淀打散，分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤3次，真空干燥至恒重得多糖；
称取多糖15mg，加入2mol/L三氟乙酸5mL，100℃密闭水解5h，用NaCO3调节pH到中性，所得溶液可用于薄层分析。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对照品为D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-木糖、D-阿拉伯糖和L-鼠李糖。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中鉴别的标准如下：铁皮石斛TLC图谱中对照品在薄层色谱展开图中各自显示如下颜色：D-葡萄糖显示墨绿色，D-甘露糖显示深蓝色，D-果糖显示浅红色，D-木糖显示棕黄色，D-阿拉伯糖显示深棕色，L-鼠李糖显示淡黄色；铁皮石斛多糖水解样品色谱中，在与对照品D-葡萄糖与D-甘露糖色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点。
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