CN115166127A - 一种由复杂二维至简单一维的薄层鉴别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种由复杂二维至简单一维的薄层鉴别方法，包括在薄层板表面对药物提取液进行点样，使用二维多次展开对样品进行展开，显色观察发现相似药物的提取液的差异部分；将提取液进行柱色谱，将差异部分与其他部分分离开来；在薄层板表面对差异部分样品使用一维一次展开技术展开，显色确认。本发明利用多种展开剂体系进行多次展开并沿不同的展开方向对药物的提取液进行二维薄层色谱分离，能够在两个维度对药物提取液中的有机成分进行分离，提高色谱斑点的分离度，发现相似药物提取液成分的差异之处，然后利用不同极性的试剂对提取液进行分段处理，对差异部位实现砍断，再进行一维一次展开，实现对药物的快速鉴别。

Description

一种由复杂二维至简单一维的薄层鉴别方法
技术领域
本发明属于分析测试技术领域，具体涉及一种由复杂二维至简单一维的薄层鉴别方法。
背景技术
薄层分析技术是色谱分析的常用手段，由于具有操作简便，设备简单，不需特殊设备，分离效果较好，时间较短，一块板上可同时分离许多样品。除低沸点物质外，各种无机和有机化合物都可进行分离等特点而在化工、食品、医药等领域广泛应用。薄层分析一般采用一维一次展开定性观察或定量测定一个成分（或一次展开可基线分离的几个成分）的方法。由于大部分的药物提取物成分复杂，在进行一维薄层一次展开，一维薄层多次展开或简单的二维展开分析时，存在一些化合物分离效果不佳，斑点不清晰，无法较全面展现提取物的化学成分的问题，不利于药物的快速鉴别和鉴定，而二维多次展开技术能获得较全面清晰的薄层色谱图，但是也存在耗时长，试剂耗用多等缺点。
目前解决药材薄层鉴别的技术是（1）供试品溶液制备：将待检测药材碎成粉末，加萃取剂进行萃取，萃取后过滤并蒸干所得滤液得残渣，用溶剂溶解该残渣，得供试品溶液。（2）对照溶液制备：将对照药材碎成粉末，加萃取剂进行萃取，萃取后过滤并蒸干所得滤液得残渣，用溶剂溶解该残渣，得对照溶液或用有机溶剂溶解对照品得到对照溶液。（3）薄层层析：分别吸取所述供试品溶液、对照溶液点样于同一硅胶G薄层板上，将所述点样后的硅胶G薄层板先置于展开剂的蒸汽中进行预饱和再置于展开剂中展开，展开后取出晾干，在254 nm、366 nm下观察或者采用显色剂显色在不低于100 ℃的温度对所述晾干的硅胶G薄层板加热后检视，即可。
不经过特殊处理的药物提取液成分复杂，在进行一维薄层一次展开，一维薄层多次展开或简单的二维展开分析时，存在一些化合物分离效果不佳，斑点不清晰，无法较全面展现提取液的化学成分的问题，不利于药物的快速鉴定。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明提出先以二维多次展开技术发现提取物化学成分的差异部位，然后利用不同极性试剂对提取物的差异部分进行分离，将有差异的部位再进行一维一次展开，便可方便快捷药物进行鉴定。
本发明的目的是提供一种薄层鉴别的方法，先由复杂二维薄层发现差异部分，再以硅胶柱层析将差异部分分离开来，之后进行简单一维薄层展开，进行快速、直观的定性鉴别，为实现本发明，采取以下步骤：
（1）提供药物的提取液；
（2）在薄层板表面对所述药物的提取液进行点样，使用二维多次展开对样品进行展开，在多种显视条件下对展开完成的样品进行观察，发现相似药物的提取液的差异部分。
（3）将提取液进行柱色谱，将差异部分与其他部分分离开来。以多种不同极性溶剂为洗脱剂，进行梯度洗脱，收集洗脱液；去除大部分溶剂得到差异部分样品。
（4）在薄层板表面对所述差异部分样品进行点样，使用一维一次展开技术对样品进行展开，在多种显视条件下对展开完成的样品进行观察。
其中二维多次展开的步骤为：使用第一展开剂对所得点样样品进行第一次展开，溶剂前沿位置为薄层最前沿，得到第一展开样品；
沿所述第一次展开的同方向，使用第二展开剂对所述第一展开样品进行第二次展开，溶剂前沿位置应低于第一次展开的位置，得到第二展开样品；同样操作可得第N展开样品。
沿所述第一次展开的垂直方向，使用第N+1展开剂对所述第N+1展开样品进行第N+1次展开，溶剂前沿位置为薄层最前沿，得到第N+1展开样品；
沿所述第N+1次展开的同方向，使用第N+2展开剂对所述第N+2展开样品进行第N+2次展开，溶剂前沿位置应低于第N+1次展开的位置，得到第N+2展开样品；同样操作可得第N+3展开样品。
N一般为小于20的正整数。
在本发明中，提供药物提取液的方法包括超声提取法、微波辅助提取，溶剂提取法、索式提取法等包括但不限于能够将化学成分从药物中提取出来的方法。
在本发明中，所述薄层板优选为硅胶板，进一步优选为GF254硅胶板。在本发明中，所述点样的体积优选为4～20μL，更优选为8～15μL，进一步优选为10～12μL。在本发明中，所述点样的方式优选为薄层自动点样设备点样或毛细管手动点样。
在本发明中，所述展开的方式优选为：将薄层板置于展开剂中，点样样品靠近展开剂但不与展开剂接触，点样样品与展开剂液面的距离优选为10 mm，点样样品与薄层板底部的距离优选为15 mm，点样样品与薄层板左侧边缘的距离优选为15 mm。
在本发明中，所述的展开剂为不同极性的展开剂。
在本发明中，所述显视方法为254、365 nm紫外灯观察或显色后肉眼观察。
在本发明中，所述显色剂包括但不限于硫酸乙醇溶液、磷钼酸乙醇溶液、香草醛乙醇溶液等能够将化合物显色的溶液。在本发明中，所述显色温度为100 ℃～110 ℃。
在本发明中，所述柱层析为硅胶柱层析、大孔树脂柱层析、凝胶柱层析或其他可用于分离的柱色谱法。
在本发明中，所述应用范围为同属近源种及品种鉴别，复杂中药提取物检测，微量成分极性、相近成分与其他不容易检测成分的检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
利用多种展开剂体系进行多次展开并沿不同的展开方向对药物的提取液进行二维薄层色谱分离，能够在两个维度对药物提取液中的有机成分进行分离，提高色谱斑点的分离度，从而获得特征斑点清晰、数量多的薄层色谱图，发现相似药物提取液成分的差异之处，然后利用不同极性的试剂对提取液进行分段处理，对差异部位实现砍断，再进行一维一次展开，可实现对药物的快速鉴别。
本发明提供一种薄层鉴别的方法，先由复杂二维薄层发现差异部分，再以硅胶柱层析将差异部分分离开来，之后进行简单一维薄层展开，进行快速、直观的定性鉴别。本发明采用从复杂到简单的薄层展开思路，先以二维多次展开技术对药物提取液进行展开使用多种展开剂体系、沿不同的展开方向对药物提取液进行多次分离，能够在两个维度对药物中的有机成分进行分离，从而获得清晰的薄层色谱图，观察发现药物薄层图谱的差异部分。之后以硅胶柱层析对提取液进行分离处理将差异部分分离开来，再以一维一次展开技术对其进行展开，可方便快捷的对其进行观察。
本发明通过使用一维和二维薄层技术对药物的提取液进行观察，能保留一维薄层操作简便，设备简单，不需特殊设备，分离效果较好，时间较短，一块板上可同时分离许多样品的特点，也能将一维薄层原有不清晰的部分进一步分离，使其显示更多的斑点，将差异部分更为明显的展现出。硅胶柱层析能直接上样，不需要对样品进行特殊处理，可方便快捷的对混合物进行快速的分离，使不同极性的物质快速的分离。本发明提供的方法可以对植物物种、药物的真伪鉴别进行方便快捷的分析鉴定，也可以为药物中的具体化合物成分分析提供更多有用信息。
本发明首次提供一种薄层鉴别的方法，先由复杂二维薄层发现差异部分，再以硅胶柱层析将差异部分分离开来，之后进行简单一维薄层展开，进行快速、直观的定性鉴别。通过使用一维和二维薄层技术对药物的提取液进行观察，能保留一维薄层操作简便，设备简单，分离效果较好，时间较短，一块板上可同时分离许多样品的特点，也能将一维薄层原有不清晰的部分进一步分离，使其显示更多的斑点，将差异部分更为明显的展现出。硅胶柱层析能直接上样，不需要对样品进行特殊处理，可方便快捷的对混合物进行快速的分离，使不同极性的物质快速的分离。本发明提供的方法可以对植物品种、药物的真伪鉴别及质量控制提供方法上的参考，也可以为药物的具体化合物成分分析提供更多有用信息。
具体实施方式
下面以白花泡桐、兰考泡桐、毛泡桐、台湾泡桐的叶片为实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
取白花泡桐、兰考泡桐、毛泡桐、台湾泡桐叶片粉末样品，记为A组、B组、C组、D组，每组0.2克。每组分别与5 mL石油醚混合，在40 kHz下浸泡超声0.4小时，提取液过滤后40℃ 减压挥干部分溶剂，所得溶液用0.45μm微孔滤膜过滤获得白花泡桐、毛泡桐、台湾泡桐、兰考泡桐叶片提取液。
在GF254硅胶板对所述泡桐叶提取液进行手动点样，点样位置与薄层板底部的距离为15 mm，与薄层板左侧边缘的距离为15 mm，点样量为10 μL，采用石油醚：三氯甲烷＝2:1溶剂进行第一次展开，溶剂前沿距离的顶端0 cm；晾干后沿第一展开的同一方向使用石油醚：三氯甲烷＝1:7的溶剂进行第二次展开，溶剂前沿到达的位置为第一次展开Rf值为0.72的位置；晾干后沿第一展开的同一方向使用石油醚：乙酸乙酯＝1:3的溶剂进行第三次展开，溶剂前沿到达的位置为第一次展开Rf值为0.37的位置；晾干后沿第一展开的垂直方向使用石油醚：乙醚＝25:1的溶剂进行第四次展开，溶剂前沿距离的顶端0 cm；晾干后沿第四展开的同一方向使用石油醚：三氯甲烷＝1:6的溶剂进行第五次展开，溶剂前沿到达的位置为第四次展开Rf值为0.50的位置；晾干后沿第四展开的同一方向使用石油醚：乙酸乙酯＝1:1的溶剂进行第六次展开，溶剂前沿到达的位置为第四次展开Rf值为0.20的位置。
分别于254nm和365nm的紫外灯下观察，硫酸乙醇溶液显色后的观察A组、B组、C组、D组第六展开后的样品，所得结果如下：
白花泡桐、兰考泡桐、毛泡桐、台湾泡桐二维薄层色谱共同点为：在254 nm下观察，Rf值为0.85、0.3的位置有一黑色斑点；在366 nm下观察，Rf值为0.85左右有一褐色斑点，Rf值为0.3左右有一亮红色斑点，在Rf值0.2以下有两串垂直方向的连续红色斑点。在显色下观察，Rf值为0.85左右有一褐色斑点；Rf值0.5-0.8之间有一连续粉红色斑点；Rf值0.4-0.5之间有两个深红色斑点，Rf值0.2-0.4之间有两个粉色斑点，一个绿色斑点；Rf值0.2以下有一个粉色斑点。
白花泡桐与兰考泡桐、毛泡桐、台湾泡桐二维薄层色谱差异点为：在显色的薄层板上，在Rf值为0.5的位置上有一个微微黄色斑点，Rf值0~0.2左右有一个淡粉色斑点，实现对白花泡桐的鉴别。
实施例2
取白花泡桐四份，兰考泡桐、毛泡桐、台湾泡桐叶片分别两份，每份0.2克，加入10ml石油醚，在40 kHz下浸泡超声提取30 min，过滤后滤渣重复提取1次，合并提取液；将提取液在40 ℃下经旋转蒸发仪蒸发除去溶剂得棕色油状物。对所得棕色油状物进行硅胶柱层析，硅胶用量与棕色油状物的质量比为2：1，使用石油醚：二氯甲烷（2:1）、石油醚：乙酸乙酯（4:1）、乙酸乙酯进行梯度洗脱，分别收集洗脱液。之后去除溶剂，待所述洗脱液的体积为所述溶剂的70％～80％时停止减压蒸馏，得到第一段浓缩液、第二段浓缩液、第三段浓缩液。在与薄层板底部距离为10 mm，与薄层板左侧边缘距离为10 mm的位置对所述浓缩液进行点样，使用第一展开剂石油醚：二氯甲烷（1:1）对第一段浓缩液样品进行展开；使用第二展开剂石油醚：三氯甲烷（1:4）对第二段浓缩液样品进行展开；使用第三展开剂石油醚：乙酸乙酯（1:1）对第三段浓缩液样品进行展开。
分别于254nm和365nm的紫外灯下观察，硫酸乙醇溶液显色后的观察，所得结果如下：
白花泡桐、兰考泡桐、毛泡桐、台湾泡桐薄层色谱共同点为：在254 nm下观察，第一段样品在Rf值0.75和0.9左右各有一个斑点；第二段样品在Rf值0.2-0.3之间有两个斑点。在366 nm紫外光下观察，第一段样品在Rf值0.75-1左右有三个斑点；第二段样品在Rf值0.2-0.4左右有三个红色斑点；第三段样品在Rf值0.95左右有一个斑点。显色后日光下观察，第一段样品在Rf值0.7-0.1左右有八个红色斑点；第二段样品在Rf值0.4、0.8左右有各有一个红色斑点，在Rf值0.35左右有两个绿色斑点。
白花泡桐鉴别方法：在366 nm紫外光下观察，第二段Rf值0.6左右有一橘黄色条带；在显色的薄层板上，在第一段Rf值0.5的位置有一黄色斑点，在Rf值0.17的位置有一个小绿色斑点；在第三段Rf值0.7左右没有斑点，在Rf值0.1-0.25之间有明显的两个红色斑点，实现对白花泡桐的鉴别。
以上具体实施方式不以任何形式限制本发明，凡是以等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种由复杂二维至简单一维的薄层鉴别方法，其特征在于包括以下几个步骤：
（1）提供药物的提取液；
（2）在薄层板表面对所述药物的提取液进行点样，使用二维多次展开对样品进行展开，在多种显视条件下对展开完成的样品进行观察，发现相似药物的提取液的差异部分；
（3）将提取液进行柱层析，将差异部分与其他部分分离开来；以多种不同极性溶剂为洗脱剂，进行梯度洗脱，收集洗脱液；去除大部分溶剂得到差异部分样品；
（4）在薄层板表面对所述差异部分样品进行点样，使用一维一次展开技术对样品进行展开，在多种显视条件下对展开完成的样品进行观察。
2.根据权利要求1所述的薄层鉴别方法，其特征在于：所述二维多次展开的步骤为：使用第一展开剂对所得点样样品进行第一次展开，溶剂前沿位置为薄层最前沿，得到第一展开样品；沿所述第一次展开的同方向，使用第二展开剂对所述第一展开样品进行第二次展开，溶剂前沿位置应低于第一次展开的位置，得到第二展开样品；同样操作可得第N展开样品；沿所述第一次展开的垂直方向，使用第N+1展开剂对所述第N+1展开样品进行第N+1次展开，溶剂前沿位置为薄层最前沿，得到第N+1展开样品；沿所述第N+1次展开的同方向，使用第N+2展开剂对所述第N+2展开样品进行第N+2次展开，溶剂前沿位置应低于第N+1次展开的位置，得到第N+2展开样品；同样操作可得第N+3展开样品；N一般为小于20的正整数。
3.根据权利要求2所述的薄层鉴别方法，其特征在于：所述薄层板为硅胶板或GF254硅胶板；所述点样的体积为4～20μL或8～15μL或10～12μL；所述点样的方式为薄层自动点样设备点样或毛细管手动点样。
4.根据权利要求3所述的薄层鉴别方法，其特征在于：所述展开的方式为：将薄层板置于展开剂中，点样样品靠近展开剂但不与展开剂接触，点样样品与展开剂液面的距离为10mm，点样样品与薄层板底部的距离为15 mm，点样样品与薄层板左侧边缘的距离为15 mm。
5.根据权利要求4所述的薄层鉴别方法，其特征在于：所述提供药物提取液的方法为超声提取法、微波辅助提取法，溶剂提取法或索式提取法。
6.根据权利要求5所述的薄层鉴别方法，其特征在于：所述展开过程中使用不同极性的展开剂。
7.根据权利要求6所述的薄层鉴别方法，其特征在于：所述显视条件为254nm、365nm紫外灯观察或显色剂显色后肉眼观察。
8.根据权利要求7所述的薄层鉴别方法，其特征在于：所述显色剂为硫酸乙醇溶液、磷钼酸乙醇溶液、香草醛乙醇溶液中的一种或几种，显色温度为100℃～110℃ 。
9.根据权利要求8所述的薄层鉴别方法，其特征在于：所述柱层析为硅胶柱层析，、大孔树脂柱层析、凝胶柱层析或其他可用于分离的柱色谱法。
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