CN113960225B - 一种基于化学成份鉴别不同类型多花黄精的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药分析技术领域,具体涉及一种基于化学成份鉴别不同类型多花黄精的方法。本发明利用多花黄精的指纹图谱检测方法发现杂交型与另外3种类型,即九华型、古田山型和早花型在物质的差异;利用紫外可见分光光度法对不同类型多花黄精的粗多糖、总皂苷和总黄酮成分含量进行检测,发现粗多糖和总皂苷含量最高的均为九华型,与古田山型无显著性差异,但显著高于早花型和杂交型;总黄酮含量古田山型显著高于另三者;因此根据本发明的方法可以从物质含量的差异上将九华型、古田山型、早花型和杂交型4种类型的多花黄精进行区分。
Description
技术领域
本发明涉及中药分析技术领域,具体涉及一种基于化学成份鉴别不同类型多花黄精的方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)隶属于天门冬科(Asparagaceae)黄精属(Polygonatum Mill.),是中药黄精的一种重要基原植物。《中国药典》(2020)对多花黄精的描述是针对其多糖成分,规定以无水葡萄糖计,多糖含量不得少于7.0%。多花黄精根状茎中除了含有多糖成分,还存在大量的甾体皂苷类、黄酮类和生物碱类等多种物质,药理研究表明这些物质具有抗衰老、降血糖、抗菌、抗炎和抗病毒等多种活性。同时研究表明不同产地的多花黄精中化学成分含量变化幅度较大,化学成分的含量对于中药黄精的药效会有影响。尽管前期的研究表明多花黄精可以明显分为了4个类型,即九华型、古田山型、早花型和杂交型,但是如何对这4种类型的多花黄精进行区分至今未做过比较研究。
发明内容
针对现有技术中存在的问题,本发明的目的是提供一种基于化学成份鉴别不同类型多花黄精的方法,本发明利用多花黄精的指纹图谱检测方法发现杂交型与另外3种类型(即九华型、古田山型和早花型)存在物质的差异;利用紫外可见分光光度法对不同类型多花黄精的粗多糖、总皂苷和总黄酮成分含量进行检测不同类型多花黄精中粗多糖、总皂苷和总黄酮成分含量的差异,从而从物质含量的差异上实现将九华型、古田山型、早花型和杂交型4种类型的多花黄精进行区分。
为了实现上述目的,本发明的技术方案如下所述:
在本发明的第一方面,提供一种多花黄精的指纹图谱检测方法,所述检测方法采用高效液相色谱进行检测,包括如下步骤:
(1)制备待测液:
将样品用甲醇溶液进行提取,将提取物使用甲醇复溶,过滤,得到待测液;
(2)高效液相色谱检测:
采用高效液相色谱对待测液进行测定,得到各个样品色谱图;
(3)数据处理和分析:
对多花黄精中化学成分含量的数据进行处理,并采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对HPLC色谱图进行处理比较。
在本发明的第二方面,提供一种鉴别不同类型多花黄精的分析方法,所述分析方法采用第一方面所述的多花黄精的指纹图谱检测方法,并利用紫外可见分光光度法对不同类型多花黄精的粗多糖、总皂苷和总黄酮成分含量进行检测。
本发明的具体实施方式具有以下有益效果:
本发明利用多花黄精的指纹图谱检测方法发现杂交型与另外3种类型即九华型、古田山型和早花型存在物质的差异;利用紫外可见分光光度法对不同类型多花黄精的粗多糖、总皂苷和总黄酮成分含量进行检测,发现粗多糖和总皂苷含量最高的均为九华型,与古田山型无显著性差异,但显著高于早花型和杂交型;总黄酮含量古田山型显著高于另三者。因此根据本发明的方法可以从物质含量的差异上将九华型、古田山型、早花型和杂交型4种类型的多花黄精进行区分。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1为优化后多花黄精的HPLC色谱图;
图2为4种类型多花黄精的HPLC色谱图对比;
图3为4种类型多花黄精HPLC色谱图总峰面积对比,图中不同小写字母表示具有差异显著(P<0.05);
图4为4种类型多花黄精中粗多糖、总皂苷和总黄酮含量的箱线图对比,图中不同小写字母表示具有差异显著(P<0.05)。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
在本发明的第一方面,提供一种多花黄精的指纹图谱检测方法,所述检测方法采用高效液相色谱进行检测,包括如下步骤:
(1)制备待测液:
将样品用甲醇溶液进行提取,将提取物使用甲醇复溶,过滤,得到待测液;
(2)高效液相色谱检测:
采用高效液相色谱对待测液进行测定,得到各个样品色谱图;
(3)数据处理和分析:
对多花黄精中化学成分含量的数据进行处理,并采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对HPLC色谱图进行处理比较。
在一种或多种实施方式中,所述甲醇溶液为体积分数80~90%的甲醇溶液;
在一种或多种实施方式中,所述提取为超声提取,时间为40~50min;
在一种或多种实施方式中,所述过滤为过0.22μm孔径有机滤膜;
在一种或多种实施方式中,高效液相色谱采用Symmetry C18反向色谱柱;
在一种或多种实施方式中,高效液相色谱的流动相为:A含0.2%甲酸的水溶液,B乙腈,优选地,流动相的流速为1mL·min-1;柱温为20℃;检测波长290nm;进样量10μL;
在一种或多种实施方式中,高效液相色谱的梯度洗脱程序为:T:0-10-20-25-40-50-60-80-81-90min,B%:5%-5%-6%-10%-13%-20%-40%-90%-95%-95%。
在本发明的第二方面,提供一种鉴别不同类型多花黄精的分析方法,所述分析方法采用第一方面所述的多花黄精的指纹图谱检测方法,并利用紫外可见分光光度法对不同类型多花黄精的粗多糖、总皂苷和总黄酮成分含量进行检测;
在一种或多种实施方式中,粗多糖的检测条件为:采用超声波辅助提取法提取多花黄精多糖,获得母液后将母液分别用石油醚和正丁醇萃取;在冰水浴条件下添加蒽酮硫酸溶液,放冷后在沸水浴保温后立即在冰水浴中冷却,在582nm波长处测定吸光度;
在一种或多种实施方式中,总皂苷的检测条件为:黄精粉末用甲醇溶液超声提取得到母液;母液中加入香草醛乙醇溶液,冰水浴下加硫酸溶液,恒温水浴加热保温然后立刻在冰水浴冷却,570nm波长处测定吸光度;
在一种或多种实施方式中,总黄酮的检测条件为:称取多花黄精干燥样品加入甲醇溶液提取得到母液,母液加甲醇、NaNO2溶液摇匀放置,再加AlCl3溶液摇匀放置,加NaOH溶液,摇匀放置,在500nm波长处检测吸光度。
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的解释和说明。
实施例1
多花黄精样品由实验室2017-2020年在安徽省及其周边地区进行野外采集和收购,本实验选用多花黄精材料为4个类型,分别为九华型、古田山型、早花型、杂交型,共14个居群,包括从省外购买2个居群(表1)。每个居群选择3-5个个体的根状茎,洗净切片,在60℃下烘干至恒重,粉碎混匀,干燥条件下保存,备用。
表1供试多花黄精样品的种源地信息
精密称量1g样品,置于50mL具塞离心管中,加入20mL 90%甲醇,超声提取40min,过滤获得滤液,蒸干溶剂,加入甲醇复溶,过0.22μm孔径有机滤膜,得到待测液。色谱条件:Symmetry C18反向色谱柱(4.6mm×250mm,5μm,美国Waters公司),流动相:A水(含0.2%甲酸),B乙腈,流速1mL·min-1;柱温为20℃;检测波长290nm;进样量10μL,梯度洗脱程序为:T:0-10-20-25-40-50-60-80-81-90min,B%:5%-5%-6%-10%-13%-20%-40%-90%-95%-95%。按照上述条件进行测定,得到各个样品色谱图,分析四种类型的色谱结果。
在HPLC谱图中选择3个特征峰,对它们峰面积的精密度、重复性和稳定性进行考察,结果重复性考察中3个峰的相对标准偏差RSD分别为0.35%、1.04%、0.26%;精密度考察中3个峰的RSD分别为1.33%、1.32%、0.18%;稳定性考察中3个峰的RSD分别为1.92%、1.85%、1.34%,表明试验反复的重复性、仪器的精密度和供试品溶液的稳定性均良好。
数据处理和分析:
利用SPSS 26.0软件对多花黄精中化学成分含量的数据进行处理,采用Origin2019b软件和中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A软件对HPLC色谱图进行处理比较。
确定液相条件之后,选择确定19个分离度较好的特征峰(图1),对4种类型的多花黄精共14个居群样品进样检测,结果显示九华型、古田山型和早花型都具有19个相同的峰,杂交型具有18个相同的峰(图2),比其它三者在18min处缺少1个物质峰。在这19个峰中,1号峰和5号峰的峰面积在不同类型间存在显著差异(P<0.05),杂交型中峰1的面积均较大,与另外3种类型中峰1的面积存在显著性差异(P<0.05),九华型中峰1面积最小,与杂交型相差接近10倍。九华型中峰5面积均较高,与早花型和杂交型峰5面积存在显著性差异,杂交型中峰面积最小,与九华型相差接近6倍。峰总面积分析显示古田山型(3695.98)根状茎甲醇提取物含量最高(图3),显著高于九华型(1586.98)和早花型(1737.22)。
粗多糖的测定:
采用超声波辅助提取法提取多花黄精多糖,料液比1:30(g·mL-1),50℃超声提取30min,获得母液,将母液分别用石油醚和正丁醇萃取3次,稀释100倍,取1mL提取液,加入2mL水,在冰水浴条件下添加0.2%蒽酮硫酸溶液至10mL,放冷后在沸水浴保温10min,取出,立即在冰水浴中冷却10min,以相应试剂为空白对照。按照紫外-可见分光光度法,在582nm波长测定吸光度。以葡萄糖作为标准品,吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线,得到线性回归方程为y=52.407x+0.1026(R2=0.998),线性范围3.3~19.8μg·mL-1。
总皂苷的测定:
称取干燥至恒重的黄精粉末1g,加入25mL 70%甲醇,50℃超声提取30min,过滤定容得到母液。吸取母液1mL,在70℃水浴挥干溶剂,加入新配制的10%香草醛乙醇溶液0.5mL,摇匀,冰水浴下加60%硫酸5mL,在80℃恒温水浴加热保温20min,然后立刻在冰水浴冷却10min,570nm下检测紫外吸收。以薯蓣皂苷元为标准品,绘制标准曲线,线性回归方程为y=14.914x-0.0335(R2=0.9979),线性范围为8~48μg·mL-1。
总黄酮的检测:
黄酮类分子中的酚羟基可以Al3+在碱性溶液中会发生显色反应,利用这个原理检测多花黄精中总黄酮含量。准确称取多花黄精干燥样品1g,加入40mL 80%甲醇,50℃下提取40min,过滤定容得到母液。精确吸取母液1mL,加甲醇5mL,加5%NaNO2溶液0.5mL,摇匀放置6min,再加10%AlCl3溶液0.5mL,摇匀,再放置6min,加4%NaOH溶液4mL,摇匀放置15min,在500nm波长处,检测吸光度。以芦丁作为标准品,绘制标准曲线,线性回归方程为y=10.921x-0.0241(R2=0.9985),线性范围为4~24μg·mL-1。
方差分析结果(图4)表明:九华型粗多糖含量最高(平均含量14.37%),古田山型次之(13.59%),两者差异不显著(P>0.05),但显著高于早花型(9.25%)和杂交型(P<0.05)。从单个居群来看,九华型和古田山型粗多糖含量均较高,其最低含量低的居群也均高于另外两个类型最高的居群(图4),其中九华型中JHHS居群(17.99%)粗多糖含量最高,是杂交型和早花型的近两倍。在总皂苷含量上也表现出类似的结果,即九华型(3.94%)和古田山型(3.74%)含量最高,而早花型(2.71%)和杂交型的含量最低。在总黄酮含量上古田山型(0.32%)最高,显著高于另三种类型(0.29%)。
综上,本发明通过HPLC方法对安徽省不同类型的多花黄精进行研究,发现杂交型多花黄精与另外3种类型之间存在一种物质的差异。同时对多花黄精的粗多糖、总皂苷和总黄酮成分的含量进行了测定,发现不同类型多花黄精的这些化学成分含量差异较大,其中九华型和古田山型多糖含量明显高于早花型和杂交型。本研究中安徽省多花黄精的粗多糖含量范围为8.8%~17.9%,总皂苷含量范围为2.2%~4.2%,总黄酮的含量范围为0.24%~0.35%,这些成分含量均处于较高水平。结合粗多糖、总皂苷和总黄酮的含量评价,九华型和古田山型多花黄精在品质上更好。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种鉴别不同类型多花黄精的分析方法,其特征在于,所述分析方法采用多花黄精的指纹图谱检测方法,并利用紫外可见分光光度法对不同类型多花黄精的粗多糖、总皂苷和总黄酮成分含量进行检测;
所述不同类型多花黄精为九华型、古田山型、早花型和杂交型;
所述多花黄精的指纹图谱检测方法采用高效液相色谱进行检测,包括如下步骤:
(1)制备待测液:
将样品用甲醇溶液进行提取,将提取物使用甲醇复溶,过滤,得到待测液;
(2)高效液相色谱检测:
采用高效液相色谱对待测液进行测定,得到各个样品色谱图;
(3)数据处理和分析:
对多花黄精中化学成分含量的数据进行处理,并采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对HPLC色谱图进行处理比较;
所述甲醇溶液为体积分数80~90%的甲醇溶液;
提取为超声提取,时间为40~50 min;
所述过滤为过0.22 μm孔径有机滤膜;
高效液相色谱采用Symmetry C18 反向色谱柱;
高效液相色谱的流动相为:A含0.2%甲酸的水溶液,B乙腈,流动相的流速为1 mL·min-1;柱温为20℃;检测波长290 nm;进样量10 μL;
高效液相色谱的梯度洗脱程序为:T: 0-10-20-25-40-50-60-80-81-90 min,B%: 5%-5%-6%-10%-13%-20%-40%-90%-95%-95%;
粗多糖的检测条件为:采用超声波辅助提取法提取多花黄精多糖,获得母液后将母液分别用石油醚和正丁醇萃取;在冰水浴条件下添加蒽酮硫酸溶液,放冷后在沸水浴保温后立即在冰水浴中冷却,在582 nm波长处测定吸光度;
总皂苷的检测条件为:黄精粉末用甲醇溶液超声提取得到母液;母液中加入香草醛乙醇溶液,冰水浴下加硫酸溶液,恒温水浴加热保温然后立刻在冰水浴冷却,570 nm波长处测定吸光度;
总黄酮的检测条件为:称取多花黄精干燥样品加入甲醇溶液提取得到母液,母液加甲醇、NaNO2溶液摇匀放置,再加AlCl3溶液摇匀放置,加NaOH溶液,摇匀放置,在500 nm波长处检测吸光度。
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