CN110824072A - 一种银杏叶提取物或其制剂中黄酮类指纹图谱的构建方法 - Google Patents

一种银杏叶提取物或其制剂中黄酮类指纹图谱的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药检测技术领域，具体公开一种银杏叶提取物或其制剂中黄酮类指纹图谱的构建方法。所述构建方法采用高效液相色谱法构建指纹图谱，其中高效液相色谱法的色谱条件为：固定相是以苯基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，流动相A为体积浓度为0.05‑0.2％的甲酸水溶液，流动相B为乙腈，检测器为紫外检测器，检测波长为265nm，柱温为25‑40℃；流速0.2‑0.45mL/min，梯度洗脱。本发明提供的指纹图谱为全面建立银杏叶提取物或其制剂的质量控制标准提供科学依据。

Description

一种银杏叶提取物或其制剂中黄酮类指纹图谱的构建方法
技术领域
本发明涉及医药检测技术领域，尤其涉及一种银杏叶提取物或其制剂中黄酮类指纹图谱的构建方法。
背景技术
银杏叶提取物具有扩张血管、改善微循环的功能，含有银杏叶提取物的制剂主要用于缺血性心脑血管疾病、冠心病、心绞痛、脑栓塞或脑血管痉挛等。
指纹图谱是指某些中药材或其制剂经适当的处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图，是一种综合的、可量化的鉴定手段。目前，以指纹图谱作为中药提取物及其制剂的质量控制方法，已成为国际共识。
高效液相色谱法是鉴别化合物和确定物质结构的常用手段之一。在药物分析中，以液相色谱具有的“指纹”特性作为药物鉴定的依据，是各国药典共同采用的方法。虽然银杏叶提取物及其制剂中主要有效成分均为黄酮苷类和萜类内酯活性物质，但是银杏叶提取物和制剂除有效成分外的其他成分，相差甚远，因此，一般采用不同的仪器、不同的液相测试条件分别进样进行测试，从而导致操作步骤繁杂，工艺简便性不足。
因此为了更好地控制银杏叶提取物及其制剂的质量，保证用药的安全性，更好的指导生产，使工艺控制更加严格合理，使消费者能全面认识产品质地，需要不断研究和摸索更有利于产品质量检测、明确具体有效成分种类和含量的方法，为全面建立银杏叶提取物及其制剂的质量控制标准提供科学依据。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种银杏叶提取物或其制剂中黄酮类指纹图谱的构建方法，为全面建立银杏叶提取物及其制剂的质量控制标准提供科学依据。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种银杏叶提取物或其制剂中黄酮类指纹图谱的构建方法，采用高效液相色谱法构建指纹图谱，其中高效液相色谱法的色谱条件为：固定相是以苯基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，流动相A为体积浓度为0.05-0.2％的甲酸水溶液，流动相B为乙腈，检测器为紫外检测器，检测波长为265nm，柱温为25- 40℃；流速0.2-0.45mL/min，梯度洗脱。
相对于现有技术，本发明提供的银杏叶提取物或其制剂中黄酮类指纹图谱的构建方法，具有以下优势：
本发明以苯基硅烷键合硅胶为填料，采用0.05-0.2％的甲酸水溶液-乙腈进行梯度洗脱，采用相同的色谱条件，能够将银杏叶提取物或其制剂中的化合物进行分离并检测，分析时间短、色谱峰分离效果优异，避免了在检测中频繁更换液相条件，提高了工作效率。
优选地，所述梯度洗脱的条件为：
0-20min，95％→75％流动相A；5％→25％，流动相B；
20-30min，75％→55％流动相A；25％→45％，流动相B；
30-35min，55％→90％流动相A；45％→10％，流动相B。
由于银杏叶提取物及其制剂舒血宁注射液中成分复杂，用单一流动相无法良好分离各组分，使用优选的洗脱时间及流动相比例，可以使待测溶液中性质差异较大的组分根据各自的性质、按各自适宜的容量因子k实现良好的分离。
优选地，所述高效液相色谱法的进样量为1-3μL。
优选地，所述银杏叶提取物或其制剂的指纹图谱有36个特征共有峰，以芦丁的色谱峰为参照峰，以其保留时间为1计，其他所述特征共有峰与所述参照峰的相对保留时间分别如下：峰1：0.404±0.002；峰2：0.515±0.003；峰 3：0.562±0.028；峰4：0.610±0.031；峰5：0.631±0.032；峰6：0.668± 0.018；峰7：0.710±0.021；峰8：0.766±0.022；峰9：0.805±0.024；峰 10：0.820±0.025；峰11：0.871±0.030；峰12：0.917±0.027；峰13：0.942 ±0.023；峰14：0.986±0.027；峰15：1.00；峰16：1.029±0.019；峰17： 1.048±0.028；峰18：1.070±0.018；峰19：1.093±0.018；峰20：1.211± 0.018；峰21：1.261±0.019，峰22：1.357±0.020；峰23：1.413±0.020；峰 24：1.452±0.021；峰25：1.513±0.022；峰26：1.540±0.023；峰27：1.590 ±0.024；峰28：1.663±0.017；峰29：1.960±0.022；峰30：2.094±0.013；峰31：2.124±0.013；峰32：2.138±0.014；峰33：2.148±0.014；峰34： 2.171±0.016；峰35：2.201±0.016；峰36：2.231±0.017。
上述峰1为原儿茶酸；峰5为落叶松脂醇-4,4′-二葡萄糖苷；峰8为松脂醇二葡萄糖苷；峰9为槲皮素-3-O-(2″，6″-α-L-二鼠李糖)；峰10为杨梅酮3- O-芸香糖苷；峰11为槲皮素-3-O-[2′-O-(6″-O-对香豆酰基)-D-葡萄糖基]-α-L-二鼠李糖；峰12为山奈酚-3-O-(2″,6″-α-L-二鼠李糖)-β-D-葡萄糖基；峰13为异鼠李素-3-O-(2″,6″-α-L-二鼠李糖)-β-D-葡萄糖基；峰16为4′-甲基-杨梅素-3-O- 芸香糖苷；峰17为3′-甲基-杨梅素-3-O-芸香糖苷；峰18为Urolignoside；峰 19为异槲皮苷；峰20为槲皮素3-O-(2″-β-D-葡萄糖)-α-L-鼠李糖苷；峰21为山奈酚3-O-芸香糖苷；峰22为水仙苷；峰23为紫云英苷；峰24为槲皮苷；峰26为异鼠李素3-O-葡萄糖苷；峰28为山奈酚3-O-(2″-β-D-葡萄糖)-α-L-鼠李糖苷；峰29为槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖-2″-(6″-P-香豆酰基)-β-D-葡萄糖苷；峰30为山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖-2″-(6″-P-香豆酰基)-β-D-葡萄糖苷；峰36为 Biginkgoside A。
优选地，所述银杏叶提取物或其制剂的指纹图谱有36个特征共有峰，以芦丁的色谱峰为参照峰，其峰面积为1计，其他所述特征共有峰与所述参照峰的相对峰面积分别如下：峰9：0.455±0.134；峰12：0.629±0.189；峰20：0.503±0.151；峰21：1.093±0.273；峰22：0.940±0.282；峰28：0.659± 0.209；峰29：1.068±0.267；峰30：1.008±0.252。根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》的有关规定，单峰面积占总峰面积＜5％的共有峰，峰面积比不做要求。
优选地，以芦丁为对照品，采用甲醇溶解，得到浓度为0.08-0.12mg/mL 芦丁对照品溶液。
优选地，将银杏叶提取物采用甲醇溶解，配成浓度为3-4mg/mL的溶液，过滤即为所述银杏叶提取物的供试品溶液。
优选地，所述对照品溶液和供试品溶液采用的甲醇为体积浓度为85-100％的甲醇水溶液。
优选地，将含有银杏提取物的注射液依次采用0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤，得到的续滤液为所述银杏叶提取物的注射液的供试品溶液。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1提供的含有银杏叶提取物的制剂的高效液相色谱图；
图2是本发明实施例2提供的12批样品的高效液相色谱图；
图3是本发明实施例2提供的含有银杏叶提取物的制剂的指纹图谱；
图4是本发明实施例3提供的银杏叶提取物的高效液相色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本实施例提供一种含有银杏叶提取物的制剂舒血宁注射液中黄酮类指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
步骤a、以芦丁为对照品，采用体积浓度为95％的甲醇溶解，得到浓度为 0.1mg/mL芦丁对照品溶液。
步骤b、将含有银杏叶提取物的制剂舒血宁注射液1mL采用0.45μm的微孔滤膜过滤，得到的续滤液为所述银杏叶提取物的注射液的供试品溶液。
步骤c、采用高效液相色谱法分别对供试品溶液和对照品溶液进行高效液相色谱分析，其中高效液相色谱法的色谱条件为：固定相是以苯基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，流动相A为体积浓度为0.05％的甲酸水溶液，流动相B 为乙腈，检测器为紫外检测器，检测波长为265nm，柱温为30℃；流速 0.25mL/min，进样量为2μL，梯度洗脱，梯度洗脱条件为：
0-20min，95％→75％流动相A；5％→25％，流动相B；
20-30min，75％→55％流动相A；25％→45％，流动相B；
30-35min，55％→90％流动相A；45％→10％，流动相B。
舒血宁注射液的高效液相色谱图如图1所示，其中峰15为芦丁。
实施例2
本实施例提供了一种含有银杏叶提取物的制剂舒血宁注射液中黄酮类指纹图谱的构建方法，具体如下：
采用实施例1所述的舒血宁注射液指纹图谱的构建方法，建立13批次舒血宁注射液的高效液相谱，如图2所示，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”对13批样品的指纹图谱进行合成，如图3所示，生成有36个共有峰构成的舒血宁注射液HPLC指纹图谱，其中15号色谱峰为芦丁。以13批样品生成的对照图谱为参照，计算相似度，相似度均大于0.90。
试验例1制剂的重复性试验
取同一批样品，按照实施例1所述含有银杏叶提取物的注射液舒血宁注射液中黄酮类指纹图谱的构建方法中的步骤b制备6份供试品溶液，并采用与实施例1相同的色谱条件下进行重复性考察，结果如表1和表2所示，共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于2％，表明方法重复性良好。
表1特征共有峰相对保留时间
Figure BDA0002323026280000061
Figure BDA0002323026280000071
注：以芦丁(S峰，峰15)的保留时间为1计。
表2特征共有峰相对峰面积
峰号 1 2 3 4 5 6 均值 RSD％
9 0.428 0.424 0.422 0.428 0.424 0.419 0.424 0.832
12 0.428 0.424 0.422 0.428 0.424 0.419 0.424 0.832
15(S) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0
20 0.520 0.512 0.509 0.518 0.512 0.520 0.515 0.479
21 1.139 1.138 1.130 1.144 1.123 1.126 1.133 0.438
22 0.974 0.970 0.964 0.970 0.970 0.964 0.968 0.410
28 0.730 0.727 0.723 0.755 0.728 0.745 0.735 1.691
29 1.027 1.022 1.041 1.039 1.028 1.027 1.031 0.727
30 0.991 0.983 0.987 1.007 0.985 0.996 0.992 0.915
注：以芦丁(S峰，峰15)的峰面积为1计，且其他共有峰峰面积占总峰面积小于5％，所以不再计算。
试验例2制剂的稳定性试验
取实施例1所制备的供试品溶液，并采用与实施例1相同的色谱条件，分别在0、2、4、8、18、36h进行检测，考察共有峰的相对保留时间、相对峰面积。结果如表3和表4所示，共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于3％，表明供试品溶液36小时内稳定。
表3特征共有峰相对保留时间
Figure BDA0002323026280000081
Figure BDA0002323026280000091
注：以芦丁(S峰，峰15)的保留时间为1计。
表4特征共有峰相对峰面积
峰号 0h 2h 4h 8h 18h 36h 均值 RSD％
9 0.434 0.424 0.434 0.428 0.435 0.446 0.434 1.645
12 0.601 0.589 0.601 0.593 0.597 0.619 0.600 1.673
15 1.000 1.000 1.00 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000
20 0.520 0.508 0.521 0.520 0.525 0.542 0.523 2.033
21 1.148 1.131 1.147 1.139 1.149 1.195 1.151 1.876
22 0.990 0.967 0.989 0.974 0.982 1.025 0.988 1.987
28 0.741 0.725 0.739 0.730 0.757 0.776 0.745 2.421
29 1.042 1.020 1.045 1.027 1.039 1.107 1.047 2.805
30 1.031 0.976 1.011 0.991 1.015 1.050 1.012 2.545
注：以芦丁(S峰，峰15)的峰面积为1计，且其他共有峰峰面积占总峰面积小于5％，所以不再计算。
试验例3制剂的精密度试验
取实施例1所制备的供试品溶液，并采用与实施例1相同的色谱条件，重复进样6次，每次2uL，进行精密度考察，考察特征共有峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果分别如表5和表6所示，特征共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于2％，表明该方法精密度好。
表5特征共有峰相对保留时间
Figure BDA0002323026280000111
注：以芦丁(S峰，峰15)的保留时间为1计。
表5特征共有峰相对峰面积
峰号 1 2 3 4 5 6 均值 RSD％
9 0.422 0.425 0.439 0.428 0.423 0424 0.427 1.459
12 0.587 0.595 0.611 0.589 0.585 0.591 0.593 1.610
15 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
20 0.509 0.519 0.531 0.517 0.513 0.512 0.517 1.506
21 1.130 1.142 1.179 1.136 1.126 1.123 1.139 1.848
22 0.964 0.975 1.002 0.973 0.949 0.970 0.972 1.777
28 0.723 0.749 0.751 0.731 0.722 0.728 0.734 1.719
29 1.041 1.039 1.063 1.035 1.021 1.028 1.038 1.377
30 0.987 1.001 1.012 0.999 0.980 0.985 0.994 1.225
注：以芦丁(S峰，峰15)的峰面积为1计，且其他共有峰峰面积占总峰面积小于5％，所以不再计算。
实施例3
本实施例提供一种银杏叶提取物中黄酮类指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
步骤a、以芦丁为对照品，采用体积浓度为100％的甲醇溶解，得到浓度为0.08mg/mL芦丁对照品溶液。
步骤b、将银杏叶提取物采用体积浓度为100％的甲醇溶解，配成浓度为 3mg/mL的溶液，过滤即为所述银杏叶提取物的供试品溶液。
步骤c、采用高效液相色谱法分别对供试品溶液和对照品溶液进行高效液相色谱分析，其中高效液相色谱法的色谱条件为：固定相是以苯基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，流动相A为体积浓度为0.1％的甲酸水溶液，流动相B为乙腈，检测器为紫外检测器，检测波长为265nm，柱温为40℃；流速 0.2mL/min，进样量为2μL，梯度洗脱，梯度洗脱条件为：
0-20min，95％→75％流动相A；5％→25％，流动相B；
20-30min，75％→55％流动相A；25％→45％，流动相B；
30-35min，55％→90％流动相A；45％→10％，流动相B。
银杏叶提取物的高效液相色谱图如图4所示，其中峰15为芦丁。
银杏叶提取物的高效液相色谱图与舒血宁注射液的色谱图基本一致，其建立的指纹图谱与舒血宁注射液的图谱基本一致。
银杏叶提取物的高效液相的检测方法的重复性试验的各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2％，重复性良好；稳定性试验的各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％，样品在36h内稳定；精密度试验的各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2％，该方法精密度好。
实施例4
本实施例提供一种银杏叶提取物或其制剂中黄酮类指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
步骤a、以芦丁为对照品，采用体积浓度为85％的甲醇水溶液溶解，得到浓度为0.12mg/mL芦丁对照品溶液。
步骤b、将银杏叶提取物采用体积浓度为85％的甲醇水溶液溶解，配成浓度为3.5mg/mL的溶液，过滤即为所述银杏叶提取物的供试品溶液；
将含有银杏叶提取物的制剂舒血宁注射液1mL采用0.22μm的微孔滤膜过滤，得到的续滤液为所述银杏叶提取物的注射液的供试品溶液；
步骤c、采用高效液相色谱法分别对供试品溶液和对照品溶液进行高效液相色谱分析，其中高效液相色谱法的色谱条件为：固定相是以苯基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，流动相A为体积浓度为0.1％的甲酸水溶液，流动相B为乙腈，检测器为紫外检测器，检测波长为265nm，柱温为40℃；流速 0.2mL/min，进样量为2μL，梯度洗脱，梯度洗脱条件为：
0-20min，95％→75％流动相A；5％→25％，流动相B；
20-30min，75％→55％流动相A；25％→45％，流动相B；
30-35min，55％→90％流动相A；45％→10％，流动相B。
银杏叶提取物和舒血宁注射液得到的高效液相色谱图与其对照指纹图谱的相似度分别为0.93和0.95。
实施例5
本实施例提供一种银杏叶提取物或其制剂中黄酮类指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
步骤a、以芦丁为对照品，采用体积浓度为100％的甲醇水溶液溶解，得到浓度为0.1mg/mL芦丁对照品溶液。
步骤b、将银杏叶提取物采用体积浓度为100％的甲醇水溶液溶解，配成浓度为4mg/mL的溶液，过滤即为所述银杏叶提取物的供试品溶液；
将含有银杏叶提取物的制剂舒血宁注射液1mL采用0.45μm微孔滤膜过滤，得到的续滤液为所述银杏叶提取物的注射液的供试品溶液；
步骤c、采用高效液相色谱法分别对供试品溶液和对照品溶液进行高效液相色谱分析，其中高效液相色谱法的色谱条件为：固定相是以苯基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，流动相A为体积浓度为0.2％的甲酸水溶液，流动相B为乙腈，检测器为紫外检测器，检测波长为265nm，柱温为25℃；流速 0.45mL/min，进样量为2μL，梯度洗脱，梯度洗脱条件为：
0-20min，95％→75％流动相A；5％→25％，流动相B；
20-30min，75％→55％流动相A；25％→45％，流动相B；
30-35min，55％→90％流动相A；45％→10％，流动相B。
银杏叶提取物和舒血宁注射液得到的高效液相色谱图与其对照指纹图谱的相似度分别为0.92和0.97。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种银杏叶提取物或其制剂中黄酮类指纹图谱的构建方法，其特征在于：采用高效液相色谱法构建指纹图谱，其中高效液相色谱法的色谱条件为：固定相是以苯基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，流动相A为体积浓度为0.05-0.2％的甲酸水溶液，流动相B为乙腈，检测器为紫外检测器，检测波长为265nm，柱温为25-40℃；流速0.2-0.45mL/min，梯度洗脱。
2.如权利要求1所述的银杏叶提取物或其制剂中黄酮类指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述梯度洗脱的条件为：
0-20min，95％→75％流动相A；5％→25％，流动相B；
20-30min，75％→55％流动相A；25％→45％，流动相B；
30-35min，55％→90％流动相A；45％→10％，流动相B。
3.如权利要求1所述的银杏叶提取物或其制剂中黄酮类指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述高效液相色谱法的进样量为1-3μL。
4.如权利要求1所述的银杏叶提取物或其制剂中黄酮类指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述银杏叶提取物或其制剂的指纹图谱有36个特征共有峰，以芦丁的色谱峰为参照峰，以其保留时间为1计，其他所述特征共有峰与所述参照峰的相对保留时间分别如下：峰1：0.404±0.002；峰2：0.515±0.003；峰3：0.562±0.028；峰4：0.610±0.031；峰5：0.631±0.032；峰6：0.668±0.018；峰7：0.710±0.021；峰8：0.766±0.022；峰9：0.805±0.024；峰10：0.820±0.025；峰11：0.871±0.030；峰12：0.917±0.027；峰13：0.942±0.023；峰14：0.986±0.027；峰15：1.00；峰16：1.029±0.019；峰17：1.048±0.028；峰18：1.070±0.018；峰19：1.093±0.018；峰20：1.211±0.018；峰21：1.261±0.019，峰22：1.357±0.020；峰23：1.413±0.020；峰24：1.452±0.021；峰25：1.513±0.022；峰26：1.540±0.023；峰27：1.590±0.024；峰28：1.663±0.017；峰29：1.960±0.022；峰30：2.094±0.013；峰31：2.124±0.013；峰32：2.138±0.014；峰33：2.148±0.014；峰34：2.171±0.016；峰35：2.201±0.016；峰36：2.231±0.017。
5.如权利要求1所述的银杏叶提取物或其制剂中黄酮类指纹图谱的构建方法，其特征在于：以芦丁为对照品，采用甲醇溶解，得到浓度为0.08-0.12mg/mL芦丁对照品溶液。
6.如权利要求1所述的银杏叶提取物或其制剂中黄酮类指纹图谱的构建方法，其特征在于：将银杏叶提取物采用甲醇溶解，配成浓度为3-4mg/mL的溶液，过滤即为所述银杏叶提取物的供试品溶液。
7.如权利要求5-6任一项所述的银杏叶提取物或其制剂中黄酮类指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述对照品溶液和供试品溶液采用的甲醇为体积浓度为85-100％的甲醇水溶液。
8.如权利要求1所述的银杏叶提取物或其制剂中黄酮类指纹图谱的构建方法，其特征在于：将含有银杏提取物的注射液采用0.45μm或0.22μm的微孔滤膜过滤，得到的续滤液为所述银杏叶提取物的注射液的供试品溶液。
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