CN104359968A - 基于uplc-q-tof-ms技术实现对苦碟子注射液中化学成分的快速分类及鉴定 - Google Patents
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Abstract
基于UPLC-Q-TOF-MS技术实现对苦碟子注射液中化学成分的快速分类及鉴定，旨在以苦碟子注射液中黄酮类、有机酸类、氨基酸类及核苷类为研究对象，基于UPLC-Q-TOF-MS技术平台，实现苦碟子注射中化学成分的快速分类及鉴定。本研究首先对苦碟子注射液中黄酮类、有机酸类、氨基酸类及核苷类成分进行信息整合，发现并总结这四大类物质的诊断碎片及中性丢失的规律；同时采用UPLC-Q-TOF-MS技术对不同类别化合物的对照品进行质谱分析，加以验证。然后，利用诊断碎片及中性丢失的方法作为筛选鉴定工具，构建苦碟子注射液中化学成分快速分类及鉴定的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药注射液中化学成分的鉴别，即基于UPLC-Q-TOF-MS技术实现对苦碟子注射液中化学成分的快速分类及鉴定。
背景技术
在现有技术中，苦碟子注射液为菊科苦荬菜属植物抱茎苦荬菜［Ixeris sonchifolia Hance］全草经提取加工制成。苦碟子的化学成分比较复杂，据文献报道其成分主要有萜类、黄酮类和香豆素类、甾醇等。其中主要活性成分，由于受产地、气候和生态环境等因素的影响，不同产地苦碟子所制成的注射液所含成分诧异很大。研究报道，从各种动植物中提取的多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗病毒、抗辐射、降血脂、降血糖、美容等广泛的作用。
苦碟子注射液（曾用名：碟脉灵注射液）列入国家药品标准产品（国药准字Z20025450），由通化华夏药业有限责任公司生产。
处方：抱茎苦荬菜1000g，制成1000ml。
制法：取抱茎苦荬菜，加水煎煮二次，第一次1小时，第二次0.5小时，合并煎液，浓缩至每1ml相当于原生药0.5g，放冷至40℃以下，在搅拌下加10%氧化钙乳调节pH值至10，放置12小时，离心，离心沉淀物称重，悬浮于5.3倍量95%乙醇中（使含醇量达80%），加50%硫酸溶液调节pH值至3－4，充分搅拌使反应完全，离心，离心液加40%氢氧化钠溶液中和pH值至7.0，滤过，滤液回收乙醇，并挥尽乙醇，用注射用水稀释至每1ml相当于原生药4g，置-5℃以下放置12小时以上，滤过，滤液加0.1－0.2%药用活性炭粉末，煮沸15分钟，置-5℃以下放置24小时以上，滤过，滤液加注射用水稀释至规定量，调节pH值至7.0－7.5，滤过，灌封，灭菌即得。性状：本品为浅黄棕色至黄棕色的澄明液体。
含量测定：本品每10ml含总黄酮以无水芦丁（C27H30O16）计，不得少于4.0mg。含抱茎苦荬菜以腺苷（C10H12N5O4）计，不得少于0.025mg。
功能主治：活血止痛，清热祛瘀。用于瘀血闭阻的胸痹，证见：胸闷、心痛，口苦，舌暗红或存瘀斑等。适用于冠心病、心绞痛见上述病状者。亦可用于脑梗塞者。
用法用量：静脉滴注，一次10－40ml，一日1次；用5%葡萄糖或0.9%氯化钠注射液稀释至250－500ml后应用；14天为一疗程；或遵医嘱。
规格：每支装（1）10ml，（2）20ml，（3）40ml。
目前许多分辨率高、灵敏度好的分析仪器如：GC-MS和LC-MS被用来对中药单味药或复方成分进行全谱表征。在药物分析过程中，我们通常采用UPLC-Q-TOF-MS技术对药物进行全谱扫描，然而基于UPLC-Q-TOF/MS的分析方法拥有谱图复杂，信息量大等问题，因此需要借助化学计量学对原始数据进行信息的挖掘与整合。如今，随着数据后处理技术的不断发展，诊断碎片过滤（Diagnostic fragments filter, PIF）与中性丢失过滤（Neutral loss, NIF）在化合物的筛选与鉴别方面显示出独特的优势（见：齐连文等，基于快速液相-飞行时间-质谱对人身皂苷进行表征，[J].色谱A.2012. 1230 : 93–99）。由于同一类别的化合物一般具有相同或者相似的公共骨架，分子可在质谱中裂解成碎片，可根据其中一些碎片推断出裂解的类型，进而判断分析进入质谱仪的分子，这些碎片被称为特征碎片；中性丢失指的是分子离子峰与高质荷比区域的一些碎片峰的质荷比的差值，这些中性碎片的丢失在高质荷比区域有很重要的鉴定价值（见：谢彤等, 基于麦冬的体内中药药动-药效物质基础发现与分类的理论方法. [J] 色谱A, 2012. 131(2) : 1747- 1824）。由此可见，将诊断碎片与中性丢失相结合的方法，将有助于实现对苦碟子注射液中复杂化学成分快速准确的分类与鉴定。中药注射液的化学成分表征是寻找药物有效成分及确认药物效应的基础，然而通过传统的液相色谱-紫外检测的分析手段得到的化合物指纹图谱往往存在灵敏度低且专一性差，不能得到确切结构信息的缺点。
发明内容
本发明的目的是针对上述不足，提供一种基于UPLC-Q-TOF-MS技术实现对苦碟子注射液中成分的快速分类及鉴定的方法，从而大大简化了苦碟子注射液分析过程中的工作量，同时通过诊断碎片过滤策略及其它碎片与中性丢失分子的辅助分析，有利于复杂成分的快速分类及鉴定。通过建立诊断碎片过滤策略及中性丢失过滤策略，并用于苦碟子注射液指纹图谱中的归属成分群的快速筛选，有效解决了中药注射液因成分复杂造成的解析、分类及鉴定困难的技术难题。
本发明的技术解决方案是：基于UPLC-Q-TOF-MS技术实现对苦碟子注射液中化学成分的快速分类及鉴定，其步骤如下：（1）对苦碟子注射液中黄酮类、有机酸类、氨基酸类及核苷类成分进行信息整合，发现并总结这四类物质的诊断碎片及中性丢失的规律；同时采用UPLC-Q-TOF-MS技术对不同类别化合物的对照品进行质谱分析，加以验证；（2）利用诊断碎片及中性丢失作为筛选鉴定的工具，构建苦碟子注射液中化学成分快速分类及鉴定的方法；（3）基于UPLC-Q-TOF-MS技术，取苦碟子注射液进行指纹分析，快速提取并鉴定这四类物质，并对其进行鉴定。
基于UPLC-Q-TOF-MS技术实现对苦碟子注射液中化学成分的快速分类及鉴定，其方法包括以下条件：
UPLC：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18 Column, 2.1×50 mm, 1.7 μm；柱温设定为35℃；流动相：水相为0.05%甲酸水溶液，有机相为0.05%甲酸乙腈溶液；流速：0.3mL/min；采用梯度洗脱方式进行色谱分离，梯度程序如下：0-2min，2-2%B；2-5min，2-9%B；5-10min，9-12%B；10-16min，12-12%B；16-19min，12-16%；19-25min，16-20%B；25-30min，20-25%B；30-32min，25-100%B；32-34min，100-100%B；34-36min，100-2%B；36-38min，2-2%B。
Q-TOF-MS：超高效液相色谱法耦合到Q-TOF-MS，配备电喷雾电离源，采用正离子和负离子模式进行扫描分析。
MS参数如下：干燥气体温度为325℃；干燥气体流量为10毫升/分钟；脱溶剂气体流量为600 L／h；毛细管电压为3.5 kV；碰撞诱导解离电压为6 kV；碰撞能量10-20ev，分别20-30ev和30-40ev；雾化器，压力为350 psi的蒸发气；辅助气体为高纯氮气；参考离子来确保在光谱采集精度；数据采集的范围是50到1000大。
从苦碟子注射液中筛选并鉴定确认了黄酮类化合物8种，分别是槲皮素、芦丁、木犀草素-7-o-葡萄糖醛酸苷、木犀草苷、木犀草素、芹菜素-7-o-葡萄糖苷、芹菜素-7-o-葡萄糖醛酸苷、芹菜素；有机酸类化合物15种，分别为1-呋喃甲酸、3,4-二羟基苯甲酸、4-甲氧基肉桂酸、单咖啡酰酒石酸、咖啡酸、3-咖啡酰奎宁酸、4-咖啡酰奎宁酸、5-咖啡酰奎宁酸、香草酸、阿魏酰奎宁酸、阿魏酸及其两个同分异构体、2-甲氧基肉桂酸、菊苣酸；氨基酸类化合物6种，分别为丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸；核苷类化合物4种，分别为尿苷、尿嘧啶、腺苷、鸟苷。
本发明的优点是：1、UPCL-Q-TOF-MS高分辨质谱，可以得到更多的化合物信息。2、本发明通过对苦碟子注射液中成分的的综合分析与系统整合，根据同一类物质的结构共性和不同类别之间的特异性，借助数据后处理技术诊断碎片过滤及中性丢失过滤，建立快速分类与鉴定的方法，这对复杂中药注射液成分的分类、鉴定具有重要的意义。本发明一定程度上可以解决中药注射液复杂化学成分鉴定的关键难题—分类与识别，有力的推动了中药成分快速鉴定的发展；此外，本发明也为其他复杂样本中筛选目标成分提供了一条新的思路。3、UPLC条件：采用Waters Acquity UPLC BEH C18 Column, 2.1 x 50 mm, 1.7 μm的色谱柱；柱温在35℃时，色谱峰的分离度、峰型以及基线稳定性均优于其他温度；采用梯度洗脱，实验的结果表明：A相为0.05%甲酸水溶液，B相为0.05%甲酸乙腈溶液的流动相系统可以使谱图上各主要色谱峰达到较好的分离度，且保留时间适中，出峰时间短；流动相的流速在某种程度上对指纹图谱的分离度产生一定的影响，流速较快或较慢时，都不能使各种成分不能很好的分离开来，经过一系列色谱条件适用性的考察，我们采用流速为0.3 mL/min；进样量过小可能导致某些成分因含量低，响应低而达不到仪器检测限，相反进样量过大会导致色谱柱超载，从而使色谱峰峰宽增加或色谱峰峰尖钝化，并影响柱的寿命，综合考量选择进样量为7ul。4、针对苦碟子注射液中黄酮类、有机酸类、氨基酸类及核苷类四类成分，采用诊断碎片过滤策略及中性丢失筛选策略对通过UPLC-Q-TOF-MS得到的数据进行分析。与传统的数据分析模式相比，使用诊断碎片及中性丢失的筛选方法，首先，减少了繁冗复杂的工作量，有效的剔除了一些杂质离子，简化了利用碎片信息鉴别某一化合物的步骤；其次，有助于分析过程中成分的归属及分类，我们可以仅根据某个含有奎宁酸碎片离子的化合物将其归纳为含有奎宁酸基团的有机酸；另外，从一定程度上有利于发现某类成分中的未知成分，根据总结的诊断碎片及一定分子量的中性丢失，可以初步判断某一成分所属类别，进一步综合其它碎片信息及中性丢失的信息可以明确判断其分子量大小及结构组成。总而言之，诊断碎片过滤策略及中性丢失过滤策略，在苦碟子注射液的分析过程中的使用，大大简化了工作量，同时通过诊断碎片的筛选及其它碎片与中性丢失的辅助分析，使复杂成分的快速分类及鉴定成为可能。
下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步详细描述。
附图说明
图1是苦碟子注射液正负离子模式下的的总离子流图。
图2是苦碟子注射液正负离子模式下的质谱图流图。
具体实施方式
基于UPLC-Q-TOF-MS技术实现对苦碟子注射液中成分的快速分类及鉴定：
1 前言
苦碟子注射液为菊科苦荬菜属植物抱茎苦荬菜［Ixeris sonchifolia Hance］全草经提取加工制成。依照其所属化学物质组将已确认的化合物建立包含化学名、分子式、结构式、精确质量数的数据库，总结具有相应公共骨架的某类化合物的特征碎片及中性丢失，应用于指纹图谱原始数据的解析，力求达到快速、准确分类及鉴定的目的。如今，随着数据后处理技术的不断发展，诊断碎片过滤（Diagnostic fragments filter, PIF）与中性丢失过滤（Neutral loss, NIF）在化合物的筛选与鉴别方面显示出独特的优势。由于同一类别的化合物一般具有相同或者相似的母核结构，分子可在质谱中裂解成碎片，可根据其中一些碎片推断出裂解的类型，进而判断分析进入质谱仪的分子，这些碎片被称为特征碎片；中性丢失指的是分子离子峰与高质荷比区域的一些碎片峰的质荷比的差值，这些中性碎片的丢失在高质荷比区域有很重要的鉴定价值。由此可见，将诊断碎片与中性丢失相结合的方法，将有助于实现对苦碟子注射液中复杂成分快速准确的分类与鉴定。
构建苦碟子注射液中物质快速分类及鉴定的筛选方法，为中药注射液复杂成分的分类及鉴定提供一条快速、准确、可行的方法。首先, 通过查阅大量文献对苦碟子注射液中黄酮类、有机酸类、氨基酸类及核苷类成分进行信息整合，同时采用UPLC-Q-TOF-MS技术结合不同碰撞能量对不同类别化合物的对照品进行质谱分析，发现并总结这四大类物质的诊断碎片及中性丢失的规律。其次，利用诊断碎片及中性丢失作为筛选鉴定的工具，构建苦碟子注射液中复杂成分快速分类及鉴定的方法。最后，基于UPLC-Q-TOF-MS技术，取苦碟子注射液进行指纹分析，快速提取并鉴定四大主要类别的物质，并对其进行鉴定。本发明通过对苦碟子注射液中成分的的综合分析与系统整合，根据同一类物质的结构共性和不同类别之间的特异性，借助数据后处理技术诊断碎片过滤及中性丢失过滤（DI-MDF、NIF），建立快速分类与鉴定的方法，这对复杂中药注射液成分的分类、鉴定具有重要的意义。本发明一定程度上可以解决中药注射液复杂化学成分鉴定的关键难题—分类与识别，有力的推动了中药成分快速鉴定的发展；此外，本发明也为其他复杂样本中筛选目标成分提供了一条新的思路。
实验和方法
2.1标准品和试剂
苦碟子注射液(批号111201)由华夏药业有限责任公司提供（中国吉林）；甲酸（分析纯）购自化学试剂一厂（中国南京）；甲醇、乙腈为色谱纯试剂（Merck，Darmstadt，德国）；木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、芦丁（中国药品生物制品鉴定所0080-970）；脯氨酸、缬氨酸（中国药品生物制品鉴定所140624-200805）；尿苷（SIGMA-ALDRICH）、腺嘌呤（中国药品生物制品鉴定所）；单咖啡酰基酒石酸（上海源叶生物科技有限公司、批号PA0805RA13）；绿原酸（天津一方科技有限公司10081444）阿魏酸（中国药品生物制品鉴定所110773-201012）
2.2样品的制备
取吉林通化华夏药业有限责任公司生产的苦碟子注射液(批号111201)两支，混匀，经0.22μm的微孔滤膜过滤，待进样。
和MS条件
UPLC：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18 Column, 2.1×50 mm, 1.7 μm；柱温设定为35℃；流动相：水相（A）为0.05%甲酸水溶液，有机相（B）为0.05%甲酸乙腈溶液；流速：0.3mL/min。采用梯度洗脱方式进行色谱分离，梯度程序如下：0-2min，2-2%B；2-5min，2-9%B；5-10min，9-12%B；10-16min，12-12%B；16-19min，12-16%；19-25min，16-20%B；25-30min，20-25%B；30-32min，25-100%B；32-34min，100-100%B；34-36min，100-2%B；36-38min，2-2%B。
Q-TOF-MS：超高效液相色谱法耦合到Q-TOF-MS，配备电喷雾电离源（ESI），采用正离子和负离子模式进行扫描分析。MS参数如下：干燥气体温度为325℃；干燥气体流量为10毫升/分钟；脱溶剂气体流量为600 L／h；毛细管电压为3.5 kV；碰撞诱导解离电压为6 kV；碰撞能量10-20ev，分别20-30ev和30-40ev；雾化器，压力为350 psi的蒸发气；辅助气体为高纯氮气；参考离子（[M + H] + = 556.2771，[MH] - = 554.26）来确保在光谱采集精度。数据采集的范围是50到1000大。
数据分析
进样结束后，通过MassLynx软件（版本4.1）对峰值进行检测、校准、采集得到原始数据。参数如下：保留时间：0-40；质量：0-1000；消除噪声水平：6。然后对数据进行处理和转换成Excel格式，含有大量信息，包括保留时间、m/z值及各组峰面积。输出的数据通过处理得到目标化合物。最后，由数据库确定提取目标化合物。
结果与讨论
3.1 UPLC-MS条件的优化
中药注射液的化学成分表征是寻找药物有效成分及确认药物效应的基础，通过传统的液相色谱-紫外检测的分析手段得到的化合物指纹图谱往往存在灵敏度低且专一性差，不能得到确切结构信息的缺点，因而我们所使用的为UPCL-Q-TOF-MS高分辨质谱，以求得到更多的化合物信息。
UPLC条件：本实验我们主要分析苦碟子注射液中的黄酮类、有机酸类、氨基酸类及核苷酸类几大类成分，综合几类化合物的物理及化学性质，使用反相高效液相色谱进行指纹图谱检测，通过实验比较，我们采用Waters Acquity UPLC BEH C18 Column, 2.1 x 50 mm, 1.7 μm的色谱柱；同样，柱温的选择与恒定是影响指纹图谱技术稳定的主要因素之一，过高或过低的柱温都会影响色谱峰的分离效果，引起色谱峰保留时间的改变，实验结果表明柱温在35℃时，色谱峰的分离度、峰型以及基线稳定性均优于其他温度；再者，为使注射液中各成分分离完全，出峰时间缩短，且具有相对稳定的保留时间，我们采用梯度洗脱，实验的结果表明：A相为0.05%甲酸水溶液，B相为0.05%甲酸乙腈溶液的流动相系统可以使谱图上各主要色谱峰达到较好的分离度，且保留时间适中，出峰时间短；然后，流动相的流速在某种程度上对指纹图谱的分离度产生一定的影响，流速较快或较慢时，都不能使各种成分不能很好的分离开来，经过一系列色谱条件适用性的考察，我们采用流速为0.3 mL/min；最后，虽然进样量的大小对指纹图谱的结果影响不显著，但进样量过小可能导致某些成分因含量低，响应低而达不到仪器检测限；相反进样量过大会导致色谱柱超载，从而使色谱峰峰宽增加或色谱峰峰尖钝化，并影响柱的寿命，综合考量我们进样量为7ul。
MS条件：首先，为了找到相应适合苦碟子注射液中成分的离解模式，分别于正、负离子模式下进样，在总离子流图中发现有机酸类物质基本只在负离子模式下出峰；黄酮类物质虽然在正负离子模式下都有出峰行为，但在正离子模式下出现的成分明显多于负离子模式；氨基酸类物质则在正负离子模式下有相似的出峰行为，核苷类物质也主要在正离子模式下出峰。同时参照对照品的质谱行为，选用两种模式同时进样。苦碟子注射液正负离子模式下的的总离子流图（TIC）及质谱图流图分别见图1及图2。其次，碰撞电压的选择：分子母离子进入质谱后，在碰撞电压的作用下裂解为不同程度的子离子，值得注意的是，碎片离子受能量碰撞的影响较大，碰撞能量过低可能导致碎片离子丰度过高，碰撞能量过高可能导致碎片离子断裂为其他离子，因此设置单一的碰撞能量会导致碎片离子信息的缺失。因而，为了得到理想丰度的碎片离子，我们对碰撞能量进行分级，碰撞电压分别设置为为10-20V，20-30V，30-40V。
结果：
通过对对照品的质谱碎片信息及现有参考文献中的碎片信息进行整合及规律总结，我们使用诊断碎片过滤及中性丢失过滤的方法对分子母离子及碎片离子进行提取及鉴定，由此对苦碟子注射液中的4类33种化合物进行了快速鉴定，包括黄酮类化合物8种，分别是槲皮素、芦丁、木犀草素-7-o-葡萄糖醛酸苷、木犀草苷、木犀草素、芹菜素-7-o-葡萄糖苷、芹菜素-7-o-葡萄糖醛酸苷、芹菜素；有机酸类化合物15种，分别为1-呋喃甲酸、3,4-二羟基苯甲酸、4-甲氧基肉桂酸、单咖啡酰酒石酸、咖啡酸、3-咖啡酰奎宁酸、4-咖啡酰奎宁酸、5-咖啡酰奎宁酸、香草酸、阿魏酰奎宁酸、阿魏酸及其两个同分异构体、2-甲氧基肉桂酸、菊苣酸；氨基酸类化合物6种，分别为丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸；核苷类化合物4种，分别为尿苷、尿嘧啶、腺苷、鸟苷。（具体信息见表1）
表1
3.3 诊断碎片和中性丢失
众所周知，苦碟子注射液中物质种类繁多、化学组成复杂，但同一类别的物质具有相似或相同的公共骨架，使得同类物质在质谱的碰撞诱导过程中存在相同的断裂行为。因此，我们利用质谱中同类化合物的这一特性，寻找其在质谱中的裂解规律。中性丢失是指一级质谱与二级质谱之间的质量差值，利用质量差值可对具有某一类特征取代基团的物质进行粗略的分类。在质谱碰撞诱导解离(CID)的过程中，中性丢失常常反应化合物类别的信息，如氨基酸易失去17Da(NH3)、46Da(HCOOH)的中性碎片,糖苷类易失去146Da（C6H10O4）、162Da（C6H10O5）的中性碎片。同时与现有文献进行比对，筛选出每类化合物的诊断碎片与中性丢失碎片（具体信息见表2）。将诊断碎片与中性丢失应用于母离子及碎片离子集合的进一步筛选及鉴定，得到最后结果如表1所示。
表2
3.3.1黄酮
苦碟子中的黄酮类化合物，从组成来看大致可分为苷元、单糖苷、双糖苷三类。在MS中，糖苷类的化合物均可以失去一分子或两分子的糖基，形成苷元结构，因而我们以苷元为基础进行特征碎片的分析。我们把黄酮类化合物按照结构分类，可分为木犀草素型（Type A）、芹菜素型（Type B）、刺槐素型（Type C）、槲皮素型（Type D）、异鼠李素型（Type E）。通过正离子模式下的质谱鉴定，我们可以得到m/z分别为153、165、181、287、271、284、303、315的8个碎片（具体信息见表2）。
首先，对于A-E型化合物而言，它们拥有相同的A环结构，可产生相同的1，3A+裂解成m/z为153的[C7H5O4]+碎片，可作为黄酮类化合物的诊断碎片。其次，A-C型化合物与D-E型化合物在C环上有所区别，D-E型化合物属于黄酮醇类，C环上含有3-OH，因而1,2A+断裂分别生成的m/z为165的[C8H5O4]+碎片以及m/z为181的[C8H8O5]+碎片。再者，A-C型化合物都拥有不同的苷元母离子，分别是m/z为287的[C15H11O6]+、271的[C15H11O5]+、284的[C16H13O5]+的碎片，分别用于A、B、C型化合物的筛选。最后，D-E型化合物也拥有不同的苷元母离子，分别是m/z为303的[C15H11O7]+、m/z为315的[C16H12O7]+ 的碎片，用于D、E型的筛选。
简单来讲，我们可以通过以下碎片来筛选A、B、C、D、E型化合物，具体如下：当含有m/z 153、165、287时被诊断为A型黄酮；当含有m/z 153、165、271这些碎片时被诊断为 B型黄酮；当含有m/z 153、165、284、593这些碎片时被诊断为 C型黄酮；当含有m/z153、181、303这些碎片时被诊断为D型黄酮；当含有m/z为153、181、315、479这些碎片时可诊断为E型黄酮。在分类后的A-E型化合物中，结合其准分子离子及中性丢失的分子来判断其属于苷元还是糖苷类。
化合物26为槲皮素，分子式为C15H10O7，其准分子离子[M+H]+（m/z 303）及对应碎片258 [M-CO2]+、135 [1，3A+- H2O ]+、91[135 -CO2]+；在分子离子（m/z 303）与碎片离子（m/z 258）相差一个45 Da的中性丢失分子；碎片离子（m/z 135）则为分子离子RDA裂解后的A环部分继续失去一分子H2O而成；碎片离子（m/z 91）则为（m/z 135）的碎片离子丢失一个44Da的CO2而成；且与文献报道一致（见：安,等, 基于HPLC–DAD–ESI–IT–TOF–MS 和 HPLC–DAD对罗布麻叶中黄酮类化合物的质量控制及酚酸类化合物的定性定量分析[J]. 制药和生物医学分析. 2013. 85: 295-304），因此推断化合物26为槲皮素。
化合物27为芦丁，为黄酮双糖苷，分子式为C27H30O16，其准分子离子[M+H]+（m/z 611）及对应碎片304[M-Glc+H]+、288[Y0+H]+、287[Y0]+、153 1，3A+、109[1，3A-CO2]+，同时在母离子（m/z 611）与碎片离子（m/z 304）相差一个307Da的中性丢失分子，其中碎片离子（m/z 304）为距苷元较远的糖苷Y键断裂后碎片结合一个H所得；另外母离子（m/z 611）与碎片离子（m/z 287）相差一个324Da的中性丢失分子，为距苷元较远的糖苷Z键断裂所得，均证实了糖苷键的断裂，且与文献报道一致（见：安,等, 基于HPLC–DAD–ESI–IT–TOF–MS 和 HPLC–DAD对罗布麻叶中黄酮类化合物的质量控制及酚酸类化合物的定性定量分析[J]. 制药和生物医学分析.2013. 85: 295-304），因而推断化合物27为芦丁。
化合物28为木犀草素-7-o-葡萄糖醛酸苷，分子式为C21H18O12，其准分子离子[M+H]+（m/z 463）及对应碎片288 [Y0+H]+、287 [Y0]+、153 1，3A+、135[ 153-H2O]+、117[ 135-H2O]+；在母离子（m/z 463）与碎片离子（m/z 287）相差一个176Da的中性丢失分子，证实了有醛酸苷Z键断裂；碎片离子（m/z 153）则为分子离子RDA裂解后的A环 部分，（m/z 135）的碎片离子则是在其基础上都是一分子H2O而成；碎片离子（m/z 117）则是在（m/z 135）碎片的基础上再次丢失一个H2O分子而成，与Massbank数据库中的离子碎片一致，因而推断化合物28为木犀草素-7-o-葡萄糖醛酸苷。
化合物29为木犀草苷, 分子式为C21H20O11，其准分子离子[M+H]+（m/z 449）及对应碎片288 [Y0+H]+、287 [Y0]+、241 [287-HCOOH]+、153 1，3A+、135[ 153-H2O]+、91[135-CO2]+；在母离子（m/z 449）与碎片离子（m/z 287）相差一个162Da的中性丢失分子，也证实了有糖苷Z键断裂；碎片离子（m/z 153）则为分子离子RDA裂解后的A环部分，（m/z 135）的碎片离子则是在其基础上都是一分子H2O而成；碎片离子（m/z 91）则是在（m/z 135）碎片的基础上再次丢失一个44Da的CO2而成，且与文献报道一致（见：安,等, 基于HPLC–DAD–ESI–IT–TOF–MS 和 HPLC–DAD对罗布麻叶中黄酮类化合物的质量控制及酚酸类化合物的定性定量分析[J]. 制药和生物医学分析. 2013. 85: 295-304），因而推断化合物29为木犀草苷。以木犀草苷为例，具体裂解过程如下分子式所示：
化合物30为木犀草素, 分子式为C15H10O6，其准分子离子[M+H]+（m/z 287）及对应碎片288 [M+2H]+、153 1，3A+、135[ 153-H2O]+、91[135-CO2]+；碎片离子（m/z 135）为碎片离子（m/z 153）脱去一分子H2O而成；碎片离子（m/z 91）则为（m/z 135）的碎片离子丢失一个44Da的CO2而成，且与文献报道一致（见：刘颖，卢建秋等.苦碟子药材及其注射液中化学成分的HPLC-ESI-MSn分析.中国中药杂志，2013,38(16),2675-2681），因而推断化合物30为木犀草素。
化合物31为芹菜素-7-o-葡萄糖苷，分子式为C21H20O10，其准分子离子[M+H]+（m/z 433）及对应碎片272 [Y0+H]+、271 [Y0]+、227 [Y0-CO2]+；同时在母离子（m/z 433）与碎片离子（m/z 271）相差一个162Da的中性丢失分子，证实了有糖苷Z键断裂；碎片离子（m/z 271）与碎片离子（m/z 227）相差一个44Da的中性丢失分子，与文献报道一致（见：安,等, 基于HPLC–DAD–ESI–IT–TOF–MS 和 HPLC–DAD对罗布麻叶中黄酮类化合物的质量控制及酚酸类化合物的定性定量分析[J]. 制药和生物医学分析.2013. 85: 295-304），因而推断化合物31为芹菜素-7-o-葡萄糖苷。
化合物32为芹菜素-7-o-葡萄糖醛酸苷，分子式为C21H18O11，其准分子离子[M+H]+（m/z 447）及对应碎片272 [Y0+H]+、271 [Y0]+、227 [Y0-CO2]+、209 [227-H2O]+、163[209-HCOOH]+、153 1，3A+、91[153- H2O -CO2]+；同时在母离子（m/z 447）与碎片离子（m/z 271）相差一个176Da的中性丢失分子，证实了有醛酸苷Z键断裂；碎片离子（m/z 227）为碎片离子（m/z 271）脱去一分子CO2而成；碎片离子（m/z 91）则为（m/z 135）的碎片离子丢失一个44Da的CO2而成；（m/z 209）的碎片则是在此基础上脱去一分子H2O形成；（m/z 163）的碎片则是进一步脱去一分子HCOOH形成；碎片离子（m/z 153）则为分子离子RDA裂解后的A环部分；（m/z 91）的碎片离子则是在其基础上都是一分子H2O及一分子CO2而成，且与文献报道一致（见：安,等, 基于HPLC–DAD–ESI–IT–TOF–MS 和 HPLC–DAD对罗布麻叶中黄酮类化合物的质量控制及酚酸类化合物的定性定量分析[J]. 制药和生物医学分析.2013. 85: 295-304），因而推断化合物32为芹菜素-7-o-葡萄糖醛酸苷。
化合物33为芹菜素，分子式为C15H10O5，其准分子离子[M+H]+（m/z 271）及对应碎片227 [Y0-CO2]+、209 [227-H2O]+、153 1，3A+、135[ 153-H2O]+；在分子离子（m/z 271）与碎片离子（m/z 227）相差一个44Da的中性丢失分子；碎片离子（m/z 153）则为分子离子RDA裂解后的A环部分；（m/z 135）的碎片离子则是在其基础上都是一分子H2O而成，与Massbank数据库中的离子碎片一致，因而推断化合物33为芹菜素。
有机酸
苦碟子中的有机酸类化合物从组成上看，可分为简单有机酸、单酰化及双酰化的有机酸。对于简单有机酸类化合物，根据母离子的准分子离子[M+H]+碎片，结合中性丢失进行鉴定。
其中有机酰酸中化合物因结构的不同可以被分为单咖啡酰酒石酸（Type A）、单咖啡酰奎宁宁酸CQA（Type B）、双咖啡酰奎宁酸DICQA（Type C）、阿魏酰奎宁酸FQA（Type D）、肉桂酰奎宁酸（Type E）5个类型。通过标准品负离子模式下的质谱行为及参考文献中总结的碎片信息，我们可以得到m/z分别为191、173、179、135、193、163、149的7个诊断碎片，具体信息见表2。
首先，我们根据含有B-E型的化合物中常见的m/z 为191（C7H11O6 -）的[Quinic acid-H]_碎片以及m/z为 173（C7H9O5 -）的[Quinic acid-H-H2O]-碎片进行初步鉴定；同时，对于B型及C型化合物来说，m/z 为179 (C9H7O4 —) 的[Caffeic acid-H]-碎片以及m/z为 135(C8H7O2 -) 的[Caffeic acid-H-CO2]_碎片可进一步用来作为诊断碎片；当只存在m/z 为353 (C16H17O9 _)的[CQA-H]-碎片时可诊断为B型有机酸。当同时存在m/z 为353 (C16H17O9 -)的[CQA-H]-碎片及m/z 515 为(C25H23O12 _ )的[DICQA-H]-碎片时可诊断为C型有机酸。再者，当存在193(C10H9O4 -) 的[ Ferulic acid-H]-碎片及m/z为367（C17H19O9 -）的[M-H]-碎片时可诊断为D型有机酸。存在m/z 163（C9H7O3 -）的[Cinnamic acid]-碎片及m/z为321（C16H17O7 -）的[M-H]-碎片时可诊断为E型有机酸。对于A型有机酸，当含有m/z 为179 (C9H7O4 -) 的[Caffeic acid-H]-碎片、m/z为 135(C8H7O2 -) 的[Caffeic acid-H-CO2] -碎片、m/z149（C4H5O6 -）的[ Tartaric acid] -碎片、m/z311（C13H11O9 -）的[单咖啡酰酒石酸-H]-碎片时，可诊断为A型有机酸。
简单来讲，我们可以通过以下碎片来筛选A、B、C、D、E型化合物，具体如下：当含有m/z 为311、179、149、135的碎片时被诊断为A型有机酸；当含有m/z 为353、191、179、173、135这些碎片时被诊断为 B型有机酸；当含有m/z 为515 、353、191、173、179、135这些碎片时被诊断为 C型有机酸；当含有m/z 为367、193、191、173这些碎片时被诊断为D型有机酸；当含有m/z为321、191、173、163这些碎片时可诊断为E型有机酸。
化合物11为1-呋喃甲酸，为简单有机酸，分子式为C5H4O3,其准分子离子[M-H]-（m/z 111）及对应碎片67[M-H- CO2]-，分子离子与碎片离子间相差一个44Da的中性丢失分子，与Massbank数据库中的离子碎片一致，因而推断化合物11为1-呋喃甲酸。
化合物12为3,4-二羟基苯甲酸，属于简单有机酸，分子式为C7H6O4，其准分子离子[M-H]-（m/z 153）及对应碎片109[M-H- CO2]-，分子离子与碎片离子间相差一个44Da的中性丢失分子，与Massbank数据库中的离子碎片一致，因而推断化合物12为3,4-二羟基苯甲酸。
化合物13为4-甲氧基肉桂酸，负离子模式下的准分子离子m/z 177 [M-H]- ，分子式为C10H10O3，具有碎片离子m/z 133[M-H-HCOOH]-、149[M-CO]-、105[133-CO]- 与89[133-CO2]-，作为简单有机酸，与文献报道一致（刘颖，卢建秋等.苦碟子药材及其注射液中化学成分的HPLC-ESI-MSn分析.中国中药杂志，2013,38(16),2675-2681），因而可以推断化合物13为4-甲氧基肉桂酸。
化合物14为单咖啡酰酒石酸，分子式为C13H12O9,其准分子离子[M-H]-（m/z 311）及对应碎片179、149、135、133，可判断其属于A型有机酸，其准分子离子m/z为311 [M-H]-与碎片离子m/z 为149的碎片离子的质量差为162Da，表明失去了一个咖啡酸脱水后基团；碎片离子m/z 179为咖啡酸基团，而m/z为135的碎片离子则是在其基础上失去一个44Da的分子,与文献报道一致（见：张，等 . 通过HPLC-ESI-MSn，将基于诊断碎片的延伸策略及强度分析用于金银花中绿原酸类异构体的鉴定. [J] .塔兰塔. 2013.104: 1–9）。由此我们可以推测化合物14的结构中含有一个咖啡酸基团和一个酒石酸基团，即单咖啡酰酒石酸。
化合物15为咖啡酸，为简单有机酸，分子式为C9H8O4，其准分子离子m/z 179[M-H]- 及对应碎片离子135[M- CO2]-；分子离子m/z 179与碎片离子m/z 135相差一个44Da的中性丢失分子，且与文献报道一致（见：安,等, 基于HPLC–DAD–ESI–IT–TOF–MS 和 HPLC–DAD对罗布麻叶中黄酮类化合物的质量控制及酚酸类化合物的定性定量分析[J]. 制药和生物医学分析.2013. 85: 295-304），因而推断化合物15为咖啡酸。
化合物16-18，分子式为C16H18O9，其准分子离子[M-H]-（m/z 353）及对应碎片191、179、173、135，可判断其属于B型有机酸。其准分子离子m/z为353 [CQA-H]-与碎片离子m/z 为191的碎片离子的质量差为162Da，表明失去了一个咖啡酸基团；m/z 为191 的碎片以及m/z为 163的碎片质量相差28Da，表明失去了一个CO分子；同时，准分子离子m/z为353 [CQA-H]-与碎片离子m/z 为179的碎片离子的质量差为174Da，表明失去了一个奎宁基团；同样，m/z 为179 的碎片以及m/z为 135的碎片质量相差44Da，表明失去了一个CO2分子。由此我们可以推测其结构中含有一个咖啡基团和一个奎宁基团，即单咖啡酰奎宁宁酸。但对于化合物13-15来说，它们拥有相同的191、179、173、135等碎片，且具有相同的分子母离子m/z 353，很难通过特征碎片的方式辨别，于是我们可以根据碎片离子的相对丰度来判断它们的精确结构。一般来看，3位或5位取代的酰酸其基峰一般为奎宁酸的m/z191的碎片，并且3位取代的m/z为179的咖啡基团丰度较5位大，4位取代的酰酸其基峰则是m/z为173的奎宁酸脱水后的基团，与文献报道一致（见：张 JY，等 . 通过HPLC-ESI-MSn，将基于诊断碎片的延伸策略及强度分析用于金银花中绿原酸类异构体的鉴定. [J] .塔兰塔2013.104 :1–9。根据这样的分别我们可以依次推断化合物16、17、18依次为3、5、4--咖啡酰奎宁酸。以3-咖啡先奎宁酸为例，其裂解过程如下分子式所示：
化合物19为香草酸，属于简单有机酸，分子式为C8H8O4，其准分子离子[M-H]-（m/z 67）及对应碎片121[M-H-H COOH]-；分子离子与碎片离子间相差一个46Da的中性丢失分子，与Massbank数据库中的离子碎片一致，因而推断化合物19为香草酸。
化合物20为阿魏酰奎宁酸，分子式为C17H20O9,其准分子离子[M-H]-（m/z 367）及对应碎片193、173、149，可判断其属于D型有机酸，其准分子离子m/z为367 [FQA-H]-与碎片离子m/z 为193的碎片离子的质量差为174Da，表明失去了一个奎宁酸脱水后基团；分子离子与碎片离子m/z 为173的碎片离子的质量差为194Da，表明失去了一个阿魏酰基团；m/z 为193 的碎片以及m/z为 149的碎片质量相差44Da，表明失去了一个CO2分子，与文献报道一致（见：张 JY，等 通过HPLC-ESI-MSn，将基于诊断碎片的延伸策略及强度分析用于金银花中绿原酸类异构体的鉴定. [J] . 塔兰塔 2013.104: 1–9）。由此我们可以推测其结构中含有一个阿魏酸基团和一个奎宁基团，即阿魏酰奎宁宁酸。
化合物21-23为阿魏酸或其同分异构体，分子式为C10H10O4，其准分子离子m/z 193 [M-H]- 及对应碎片离子为193、179、173、116、163、151、167、89，与Massbank数据库中的离子碎片一致，因而推断为阿魏酸或其同分异构体。
化合物24为2-甲氧基肉桂酸，为简单有机酸，分子式为C10H10O3，其准分子离子m/z 177 [M-H]- 及对应碎片离子m/z 133[M-H-HCOOH]-、159[M-H-H2O]-、116[M-H2O - CO2]- 与89[133-CO2]-，其碎片子离子符合有机酸类化合物中性丢失的规律，与文献报道一致（刘颖，卢建秋等.苦碟子药材及其注射液中化学成分的HPLC-ESI-MSn分析.中国中药杂志，2013,38(16),2675-2681），因而推断化合物24为2-甲氧基肉桂酸。
化合物25为菊苣酸，分子式为C22H18O2,其准分子离子[M-H]-（m/z 473）及对应碎片311、293、179、177、149、135，可判断其属于B型有机酸，其准分子离子m/z为473 [M-H]-与碎片离子m/z 为311的碎片离子的质量差为162Da，表明失去了一个咖啡酸脱水后基团；而m/z为311与m/z 为149的碎片离子的质量差为162Da，表明失去了一个咖啡酸脱水后基团；碎片m/z293是在311的基础上丢失一分子H2O而成；碎片离子m/z 179为咖啡酸基团，而m/z为135的碎片离子则是继续失去一个44Da的分子,与文献报道一致（见：张，等 . 通过HPLC-ESI-MSn，将基于诊断碎片的延伸策略及强度分析用于金银花中绿原酸类异构体的鉴定. [J] .塔兰塔. 2013.104: 1–9）。由此我们可以推测化合物25的结构中含有两个咖啡酸基团和一个酒石酸基团，即菊苣酸。
氨基酸
氨基酸类化合物在结构上除含有-COOH及-NH2外，没有太大的共性，因而无法寻找具有代表性的碎片离子，但基于相同的-COOH及-NH2基团，在准分子离子[M+H]+碎片后，我们用中性丢失m/z 17[NH3]、18[H20]、46[HCOOH]和44[CO2]辅助鉴别，具体信息见表2。
化合物1为丝氨酸，分子式为C3H7NO3 其准分子离子m/z 104 [M-H]-与对应碎片离子87、75；其分子离子m/z104与m/z 87的碎片离子相比，失去了一个17Da的中性丢失分子NH3；与Massbank数据库中的离子碎片一致，因而推断化合物1为丝氨酸。
化合物2为苏氨酸，分子式为C4H9NO3 其准分子离子m/z118 [M-H]-与m/z 74的碎片离子相比，失去了一分子的CO2，与Massbank数据库中的离子碎片一致，因而推断化合物2为苏氨酸。
化合物3为谷氨酸，分子式为C5H9NO4其准分子离子m/z146 [M-H]-及对应碎片离子132、129、118、102、96；其分子离子m/z146与m/z 129的碎片离子相比，失去了一分子的NH3；与m/z 118的碎片离子相比，失去了一分子的CO；与m/z 102的碎片离子相比，失去了一分子的CO2; 与Massbank数据库中的离子碎片一致，因而推断化合物3为谷氨酸。
化合物4为脯氨酸，分子式为C5H9NO2，其准分子离子m/z 116 [M+H]+与对应碎片离子99[116 -NH3]+、98[116 -H2O]+、81[116-NH3-H2O]+、70[116-HCOOH]+；其m/z 99的碎片离子与分子离子m/z116相比，失去了一个17Da的NH3；其分子离子m/z 98与m/z 116的母离子相比，失去了一个18Da的中性丢失分子H2O；m/z 为81的碎片离子则是在母离子基础上先后失去一分子H2O及NH3形成；m/z 70的碎片离子与分子离子m/z116相比，失去了一个46Da的中性丢失分子HCOOH；与Massbank数据库中的离子碎片一致，因而推断化合物4为脯氨酸。
化合物5为缬氨酸，分子式为C5H11NO2，其准分子离子m/z 118 [M+H]+与对应碎片离子141[M+Na]+、101[M -NH3]+、83[101-H2O]+、72[118-HCOOH]+；其m/z 141的碎片离子与分子离子m/z118相比，多了一个23Da的Na；其分子离子m/z118与m/z 101的碎片离子相比，失去了一个17Da的中性丢失分子NH3；m/z 为83的碎片离子则是在此基础上失去一分子H2O形成；m/z 72的碎片离子与分子离子m/z118相比，失去了一个46Da的中性丢失分子HCOOH；与Massbank数据库中的离子碎片一致，因而推断化合物5为缬氨酸。
化合物6为异亮氨酸，分子式为C6H13NO2，其准分子离子m/z 132 [M+H]+与对应碎片离子115[M-NH3]+、86[M-HCOOH]+、69[M-HCOOH-NH3]+；其分子离子m/z132与m/z 115的碎片离子相比，失去了一个17Da的中性丢失分子NH3；m/z 69的碎片离子则是在分子离子基础上丢失一分子HCOOH与NH3形成，与Massbank数据库中的离子碎片一致，因而推断化合物6为异亮氨酸。
核苷
核苷类化合物从组成上可分为苷元及核苷类，同样，从分子结构看并不具有太大的共性，也没有特征性的碎片离子。由于核苷中的苷类一般连接有核糖，在MS中会首先断裂开来，可根据中性丢失116[C5H8O3]及132[C5H8O4]来筛选，结合准分子离子[M+H]+碎片进行鉴别，具体信息见表2。
化合物7为尿苷，化学式为C9H12N2O6， 其准分子离子m/z243[M-H]-，与相应碎片离子244[M]-、200[M-HNCO]-、128[M-116]-；m/z 为243的准分子离子与m/z为200的碎片离子相差一个43Da，恰好失去一分子的HNCO； 碎片离子m/z 128与碎片离子244相比，相差116Da，恰好为一分子的脱氧核糖，与文献报道一致（刘颖，卢建秋等.苦碟子药材及其注射液中化学成分的HPLC-ESI-MSn分析.中国中药杂志，2013,38(16),2675-2681），因而推断化合物7为腺苷。
化合物8为尿嘧啶，化学式为C4H4N2O2，其准分子离子m/z113 [M+H]+，与相应碎片离子96[113- NH3]+、70[113-HNCO]+； m/z为96的碎片离子与分子离子m/z 113质量差为17Da，正好失去了一分子的NH3；m/z为70的碎片离子与m/z为113的碎片离子质量差为43Da，恰好失去一分子的HNCO，与文献报道一致（刘颖，卢建秋等.苦碟子药材及其注射液中化学成分的HPLC-ESI-MSn分析.中国中药杂志，2013,38(16),2675-2681），因而推断化合物8为尿嘧啶。
化合物9为腺苷，化学式为C10H13N5O5，其准分子离子m/z 268[M+H]+，与相应碎片离子136[M+H-rib]+、119[136-NH3]+、93[136-HNCO]+；m/z为136的碎片离子与分子离子质量差为132Da，正好失去了一分子的核糖；m/z为136的碎片离子与m/z为93的碎片离子质量差为43Da，恰好失去一分子的HNCO，与文献报道一致（刘颖，卢建秋等.苦碟子药材及其注射液中化学成分的HPLC-ESI-MSn分析.中国中药杂志，2013,38(16),2675-2681），因而推断化合物9为腺苷。
化合物10为鸟苷，化学式为C10H13N5O5，其准分子离子m/z 284 [M+H]+，与相应碎片离子152[284-rib]+、135[152-NH3]+； m/z为152的碎片离子与分子离子m/z 284质量差为132Da，正好失去了一分子的核糖；m/z为152的碎片离子与m/z为135的碎片离子质量差为17Da，恰好失去一分子的NH3，与文献报道一致（刘颖，卢建秋等.苦碟子药材及其注射液中化学成分的HPLC-ESI-MSn分析.中国中药杂志，2013,38(16),2675-2681），因而推断化合物10为鸟苷。
讨论
针对苦碟子注射液中黄酮类、有机酸类、氨基酸类及核苷类四类成分，我们采用诊断碎片过滤策略及中性丢失筛选策略对通过UPLC-Q-TOF-MS得到的数据进行分析。与传统的数据分析模式相比，使用诊断碎片及中性丢失的筛选方法，首先，减少了繁冗复杂的工作量，有效的剔除了一些杂质离子，简化了利用碎片信息鉴别某一化合物的步骤；其次，有助于分析过程中成分的归属及分类，我们可以仅根据某个含有奎宁酸碎片离子的化合物将其归纳为含有奎宁酸基团的有机酸；另外，从一定程度上有利于发现某类成分中的未知成分，根据总结的诊断碎片及一定分子量的中性丢失，可以初步判断某一成分所属类别，进一步综合其它碎片信息及中性丢失的信息可以明确判断其分子量大小及结构组成。总而言之，诊断碎片过滤策略及中性丢失过滤策略，在苦碟子注射液也的分析过程中的使用，大大简化了我们的工作量，同时通过诊断碎片的筛选及其它碎片与中性丢失的辅助分析，使复杂成分的快速分类及鉴定成为可能。
结论
本发明当中，我们首先采用质量亏损过滤提取出苦碟子中的四大类物质的母离子集合，然后结合诊断碎片及中性丢失对所得化合物进行结构分析及鉴定。最终，从苦碟子注射液中筛选并鉴定了黄酮类化合物8种，有机酸类化合物15种，氨基酸类化合物6种，核苷类化合物4种，共33种。实现了苦碟子注射液中所含成分的快速分类及鉴定，解决了中药中因成分复杂造成的解析、分类及鉴定困难的技术难题。本发明一定程度上可以解决中药复杂化学成分鉴定的关键难题—分类与识别，有力的推动了中药成分快速鉴定的发展；此外，本发明也为其他复杂样本中筛选目标成分提供了一条新的思路。
Claims (3)
1. 一种基于UPLC-Q-TOF-MS技术实现对苦碟子注射液中化学成分的快速分类及鉴定，其特征在于步骤如下：（1）对苦碟子注射液中黄酮类、有机酸类、氨基酸类及核苷类成分进行信息整合，发现并总结这四大类物质的诊断碎片及中性丢失的规律；同时采用UPLC-Q-TOF-MS技术对不同类别化合物的对照品进行质谱分析，加以验证；（2）利用诊断碎片及中性丢失作为筛选鉴定的工具，构建苦碟子注射液中化学成分快速分类及鉴定的方法；（3）基于UPLC-Q-TOF-MS技术，取苦碟子注射液进行指纹分析，快速提取并鉴定这四类物质，并对其进行鉴定。
2.按照权利要求1所述的基于UPLC-Q-TOF-MS技术实现对苦碟子注射液中化学成分的快速分类及鉴定，其特征在于包括以下条件：
UPLC：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18 Column, 2.1×50 mm, 1.7 μm；柱温设定为35℃；流动相：水相为0.05%甲酸水溶液，有机相为0.05%甲酸乙腈溶液；流速：0.3mL/min；采用梯度洗脱方式进行色谱分离，梯度程序如下：0-2min，2-2%B；2-5min，2-9%B；5-10min，9-12%B；10-16min，12-12%B；16-19min，12-16%；19-25min，16-20%B；25-30min，20-25%B；30-32min，25-100%B；32-34min，100-100%B；34-36min，100-2%B；36-38min，2-2%B；
Q-TOF-MS：超高效液相色谱法耦合到Q-TOF-MS，配备电喷雾电离源，采用正离子和负离子模式进行扫描分析；
MS参数如下：干燥气体温度为325℃；干燥气体流量为10毫升/分钟；脱溶剂气体流量为600 L／h；毛细管电压为3.5 kV；碰撞诱导解离电压为6 kV；碰撞能量10-20ev，分别20-30ev和30-40ev；雾化器，压力为350 psi的蒸发气；辅助气体为高纯氮气；参考离子来确保在光谱采集精度；数据采集的范围是50到1000大。
3.按照权利要求1或2所述的基于UPLC-Q-TOF-MS技术实现对苦碟子注射液中化学成分的快速分类及鉴定，其特征在于从苦碟子注射液中筛选并鉴定确认了黄酮类化合物8种，分别是槲皮素、芦丁、木犀草素-7-o-葡萄糖醛酸苷、木犀草苷、木犀草素、芹菜素-7-o-葡萄糖苷、芹菜素-7-o-葡萄糖醛酸苷、芹菜素；有机酸类化合物15种，分别为1-呋喃甲酸、3,4-二羟基苯甲酸、4-甲氧基肉桂酸、单咖啡酰酒石酸、咖啡酸、3-咖啡酰奎宁酸、4-咖啡酰奎宁酸、5-咖啡酰奎宁酸、香草酸、阿魏酰奎宁酸、阿魏酸及其两个同分异构体、2-甲氧基肉桂酸、菊苣酸；氨基酸类化合物6种，分别为丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸；核苷类化合物4种，分别为尿苷、尿嘧啶、腺苷、鸟苷。
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