CN101382525A - 一种中药复杂体系中系列成分的快速筛选及鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中药及药物分析领域，具体涉及中药复杂体系的成分分析，本发明提供了一种普适性的策略可用于中药复杂体系中系列成分的快速筛选及鉴定，步骤如下：制备含有中药复杂体系中各系列成分的供试品溶液、采用高效液相－离子阱－飞行时间串联质谱仪对供试品溶液进行正或负离子全扫描得到总离子流色谱图以及多级碎片信息、运用诊断离子延伸策略进行中药复杂体系中系列成分的快速筛选及鉴定。本发明可应用于中药注射液等中药制剂的质量控制以及中药复杂体系中有效成分的确定。

Description

一种中药复杂体系中系列成分的快速筛选及鉴定方法

技术领域

本发明涉及中药及药物分析领域，具体涉及中药复杂体系的成分分析，本发明可应用于中药注射液等中药制剂的质量控制以及中药复杂体系中有效成分的确定。

背景技术

中药是传统中医临床应用的主要形式，在人类健康事业中发挥着重要作用。尽管许多中药已有几千年临床应用的历史，其临床疗效值得肯定，但迄今为止绝大多数中药的成分构成仍未得以阐明，已成为中药药效物质基础、质量控制及作用机理等中药现代化关键科学问题研究的主要制约瓶颈。中药这一复杂体系组份分析的难点在于其所含成分的多样性、成分间物化性质迥异、缺乏相应的对照品进行结构确证。尽管近年来各种分析技术手段得到了长足的发展，但中药复杂成分的全面检测、鉴定仍是一个艰巨的挑战。

近年来，质谱特别是各种色谱联用质谱技术以及质谱串联技术如单级四极杆质谱、离子阱质谱、飞行时间质谱或三重四极杆质谱与高效液相联用及最新出现的高效液相-离子阱-飞行时间串联质谱仪等，已发展成为化学成分定性、定量分析的主流技术之一，并以其快速、灵敏、低成本的特性在中药复杂体系的研究中获得了广泛的应用。但总体来说，目前的研究方法还存在一些不足：(1)中药成分复杂，但多数研究并不能实现中药成分的全面鉴定，而只能对有标准对照品的化学成分进行选择性鉴定。(2)中药成分复杂，运用各种质谱联用技术进行中药复杂体系组分分析将产生海量的数据集，在为结构推断提供足够信息的同时，也对信息的处理技术提出了新的挑战。逐个鉴定化合物的方法费时费力，因此目前非常需要一种具有普遍适用性的、快速的中药复杂体系成分分析与结构鉴定方法。随着植物化学领域的快速发展，越来越多的结果表明中药的成分组成以系列化合物为主，大多数中药的成分组成类别及其母核结构已基本明确。如人参所含的主要有效成分为人参皂苷类成分，五味子中所含的主要有效成分为木脂素类成分。另外，具有相同的母核结构的系列化合物在碰撞诱导裂解模式中会产生相似的碎裂途径以及共有的与母核相关的诊断离子。基于中药复杂体系的这些特点，本发明建立了一种普适性的质谱信息处理方法诊断离子延伸策略，实现了对中药复杂体系中系列成分的快速筛选及鉴定。

发明内容

本发明公开了一种快速筛选及鉴定中药复杂体系中系列成分的分析方法。

中药复杂体系中系列成分的筛选及鉴定方法，包括以下步骤：

A、制备含有中药复杂体系中各系列成分的供试品溶液，

B、采用高效液相-离子阱-飞行时间串联质谱仪对供试品溶液进行正或负离子全扫描得到总离子流色谱图以及多级碎片信息，

C、运用诊断离子延伸策略进行中药复杂体系中系列成分的快速筛选及鉴定，

本发明中诊断离子延伸策略由如下几个步骤组成：

a、分别将标准品或系列成分的标准提取物注入高效液相-离子阱-飞行时间串联质谱仪，获得母离子及碎片离子的精确质量数，综合每一系列化合物的碎片信息，将普遍存在的、丰度较大的碎片离子选定为该系列成分的诊断离子，并根据碎裂的情况总结出系列成分的碎裂规律；

b、将得到的每一系列成分的诊断离子分别输入数据处理工作站，从而对通过B步骤得到的中药复杂体系的总离子流色谱图中所检测到的峰进行分类；

c、基于分类后化合物的母离子与碎片离子的精确质量数之差及各系列成分的碎裂规律判断各化合物所含的基团；

d、结合分类的结果与化学基团的结果以及系列成分的碎裂规律对化合物的结构进行确证。

其中中药复杂体系优选单味中药或中药复方经炮制后的产物。

1、制备含有中药复杂体系中各系列成分的供试品溶液

制备时既要尽可能多地提取主要成分，又要尽量去除辅料等的干扰，根据中药复杂体系自身特性选择适宜的提取方法。提取方法通常包括过滤、液液萃取、固相萃取。液液萃取溶剂包括水饱和正丁醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、苯、正己烷单一或按一定的比例混合使用，固相萃取则可以根据实际情况选择不同填料的固相小柱。

2、采用高效液相-离子阱-飞行时间串联质谱仪对供试品溶液进行正或负离子全扫描得到总离子流色谱图以及多级碎片信息

根据所研究中药复杂体系的特性优化色谱(包括色谱柱的长度、内径、填料，柱温，流速，流动相组成，洗脱梯度)、质谱条件(仪器的各设定参数)，运用高效液相-离子阱-飞行时间串联质谱仪全扫描得到其在正或负离子模式下的总离子流色谱图以及多级碎片信息。碰撞诱导裂解的过程可采用自动模式，软件会自动地基于一定的标准(如超过一定的丰度)选择母离子进行多级碎裂。在本发明中，三级碎裂的碎片离子信息就足以完成化合物结构分析，尽管高效液相-离子阱-飞行时间串联质谱仪能够完成十级碎裂。

其中色谱条件优选为：

色谱柱：柱长100-300mm，内径2-16mm，填料粒度2-7μm；

柱温：10-70℃；

进样量：1-50μl；

流速：0.01-1.50ml/min；

流动相组成：由水相和有机相组成，水相为含酸、碱或盐的水，有机相为甲醇或乙腈；

进行梯度或等度洗脱。

3、应用高效液相-离子阱-飞行时间串联质谱仪基于标准品或系列成分的标准提取物，获得系列成分的诊断离子以及碎裂规律

基于母核结构的相似性可将中药复杂体系中的化合物分为若干系列。每一系列的化合物具有相同的母核结构，并且在碰撞诱导裂解模式中会产生相似的碎裂途径以及共有的与母核相关的诊断离子。诊断离子延伸策略关键的第一步就是通过对于部分标准品的研究，确定系列成分的诊断离子及碎裂规律。由于中药中某些成分的标准品难以获得，因此系列成分的标准提取物也可以用于此类信息的获得。

分别将系列成分的标准品或标准提取物注入高效液相-离子阱-飞行时间串联质谱仪，获得母离子及碎片离子的精确质量数，综合每一系列化合物的碎片信息，将普遍存在的、丰度较大的碎片离子选定为该系列成分的诊断离子，并根据碎裂的情况总结出系列成分的碎裂规律。

本发明中诊断离子和碎裂规律的获得优选岛津公司最新推出的高效液相-离子阱-飞行时间串联质谱仪。该仪器是目前唯一的连接离子阱和飞行时间质谱的串联质谱仪，实现了既可以做多级质谱，又能达到高质量精度的强大功能，特别适合于获得系列成分的碎裂规律及诊断离子。但本发明并不限于岛津公司生产的高效液相-离子阱-飞行时间串联质谱仪，也可以通过其它公司生产的高效液相、离子阱质谱和飞行时间质谱组合应用来完成。

4、将得到的每一系列成分的诊断离子分别输入数据处理工作站，从而对通过步骤2得到的中药复杂体系的总离子流色谱图中所检测到的峰进行分类

诊断离子可作为“marker”用于快速筛选出各系列成分。将每一系列成分的诊断离子分别输入数据处理工作站，从通过步骤2得到的总离子流色谱图中逐一筛选出各系列化合物，同时也将总离子流色谱图中所检测到的峰划分到相应的类别中。在筛选过程中，碎片离子精确质量数的测定值在诊断离子精确质量数的理论值±20ppm的范围内均被筛选出来。

5、基于分类后化合物的母离子与碎片离子的精确质量数之差及各系列成分的碎裂规律判断该化合物所含的基团

多级碎裂过程中的中性丢失相应于化合物所含的基团。基于多级碎裂过程中母离子与碎片离子的精确质量数之差及各系列成分的碎裂规律可以详细地判断出待鉴定化合物所含的基团。基团判断过程中精确质量数的测定值与理论值之间相差要小于20ppm。考虑到中药复杂体系在检测过程中，成分间的干扰是一个普遍现象，因此选定20ppm作为筛选和鉴定化合物过程中的标准是比较合适的。

6、结合分类的结果与化学基团的结果以及系列成分的碎裂规律对化合物的结构进行确证。

快速分类的结果是确定了待鉴定化合物的母核结构，结合上一步骤中待鉴定化合物所含基团的确定并参照参考文献可初步确定该化合物的结构。若有相应的标准品，还可进一步与标准品的保留时间、精确分子量、多级碎裂图谱进行比较，以确认化合物的结构。

本发明具有以下优点：

1.对中药复杂体系进行系列成分的快速筛选及鉴定，所得结果符合中药的整体作用特点；

2.不完全依赖于标准品，在获得诊断离子及碎裂规律的基础上，首先将所检测到的峰进行分类，进一步基于多级质谱碎裂信息和精确质量测定进行复杂成分(包括已知成分和未知成分)的分析与结构鉴定。

3.本发明中运用高效液相-离子阱-飞行时间串联质谱仪可以获得化合物高质量精度的多级质谱信息，不仅能快速获得系列化合物的诊断离子和碎裂规律，也为中药复杂体系中化合物鉴定的准确性提供了保障。

4.诊断离子延伸策略是一种普适性的质谱信息处理方法。随着植物化学领域的快速发展，大多数中药的成分组成类别及其母核结构已基本明确，具有全新未知母核结构的化合物很少。因此运用诊断离子延伸策略结合已知的植化信息，可以实现(1)将总离子流色谱图中复杂的峰快速归类于已知化合物类别，极大地简化结构鉴定的繁琐过程；(2)中药复杂体系中新化合物的发现(已知母核结构)；(3)理论上可以应用于各种系列成分的分析。

5.诊断离子延伸策略还可以延伸应用于其它有机混合物的分析，比如水质量分析、土壤中天然有机物分析、食物中多种农药残渣分析等。

附图说明：

图1生脉注射液在负离子模式下的总离子流色谱图。

图2生脉注射液在正离子模式下的总离子流色谱图。

具体实施方式

实施例1

生脉注射液中系列成分的快速筛选与鉴定。

a、制备含有生脉注射液中各系列成分的供试品溶液

将市售生脉注射液(No.07010606，江苏苏中药业股份有限公司)用超纯水稀释10倍后，用5倍量水饱和正丁醇提取，取有机层挥干，甲醇溶解待分析。

b、采用高效液相-离子阱-飞行时间串联质谱仪对供试品溶液进行正或负离子全扫描得到总离子流色谱图，并设定在数据采集过程中，将丰度超过一定标准的离子自动进行多级碎裂。

仪器及工作站软件：高效液相-离子阱-飞行时间串联质谱仪(岛津，日本)，LCMS solution3.0。

人参皂苷系列成分的色谱参数如下：柱型，Hypersil ODS2 C18，250mm×4.6mm i.d.，(大连，中国)；柱温，35℃；进样量，5μl；流速，1ml/min；流动相组成，水(含0.02％冰醋酸，A)和乙腈(含0.02％冰醋酸，B)；洗脱梯度，0-15min：20％(B)、15-35min：20-35％(B)、35-55min：35-40％(B)、55-70min：40-65％(B)、70-75min：65％(B)、75-80min：20％(B)。柱后分流一部分进质谱，一部分作为废液排出。

人参皂苷系列成分的质谱参数如下：离子化模式，ESI(-)；喷雾氮气流速，1.5L/min；干燥气压力，0.1MPa；接口电压，-3.5kV；检测电压，1.7kV；脱溶剂温度，200℃；加热块温度，200℃；碎裂模式：自动三级碎裂模式，MS1中丰度超过10000的离子自动进行MS2碎裂，MS2中丰度超过10000的离子自动进行MS3碎裂；碰撞气，氩气；碰撞能量，MS2和MS3均为50％；碰撞气：MS2和MS3均为50％；碰撞时间：MS2和MS3均为30ms测定范围，MS¹：m/z 200-1500，MS²：m/z 100-1500，MS³：m/z 50-1500；离子蓄积时间，10msec。在数据采集之前，先用三氟醋酸钠进行仪器在m/z 50-5000的较正。

木脂素系列成分的色谱参数如下：流动相组成，水和乙腈；其它参数与人参皂苷相同。

木脂素系列成分的质谱参数如下：离子化模式，ESI(+)；接口电压，4.5kV；测定范围，MS¹：m/z 300-600，MS²：m/z 100-600，MS³：m/z 50-600；其它参数与人参皂苷相同。

在以上条件下，全扫描得到生脉注射液在负、正离子模式下的总离子流色谱图分别如图1，2所示。

c、应用高效液相-离子阱-飞行时间串联质谱仪基于标准品或系列成分的标准提取物，获得系列成分的诊断离子以及碎裂规律

基于母核结构可将人参皂苷分为A，B，C，D，E五系列成分，木脂素分为I，II，III，IV，V五系列成分。将标准品20(S)-人参皂苷R1，Rb1，Rb2，Rb3，Rc，Rd，Re，Rg1，Rg2，Rg3，Rh1，Rh2，五味子甲素，五味子乙素及五味子醇甲分别注入高效液相-离子阱-飞行时间串联质谱仪，获得母离子及碎片离子的精确质量数，综合每一系列化合物的碎片信息，将普遍存在的、丰度较大的碎片离子选定为该系列成分的诊断离子，并根据碎裂的情况总结出系列成分的碎裂规律。由于木脂素系列的标准品难以获得，五味子标准提取物也用木脂素系列成分信息的获得。

基于以上方法，所获得的人参皂苷各系列成分的碎裂规律和诊断离子的结构如下：

木脂素各系列成分的碎裂规律和诊断离子的结构如下：

d、将得到的每一系列成分的诊断离子分别输入数据处理工作站，从而对通过步骤b得到的总离子流色谱图中所检测到的峰进行分类

应用LCMS solution 3.0进行数据处理，将每一系列成分的诊断离子分别输入工作站，从通过步骤2得到的总离子流色谱图中逐一筛选出各系列化合物，同时也将总离子流色谱图中所检测到的峰划分到相应的类别中。在筛选过程中，碎片离子精确质量数的测定值在诊断离子精确质量数的理论值±20ppm的范围内均被筛选出来。负、正离子模式下所筛选出的各系列化合物及总离子流色谱图中所检测到的峰的分类结果分别如表1，2所示。

e、基于分类后化合物的母离子与碎片离子的精确质量数之差及各系列成分的碎裂规律判断该化合物所含的基团

以人参皂苷为例，根据其碎裂规律，母离子与一系碎片离子的精确质量数之差与糖残基(如戊糖C5H804，132.0422；已糖C6H1005，162.0528；脱氧已糖C6H1004，146.0579)、右上方脂肪链(C6H12，84.0939)或水(H2O，18.0211)相关。基团判断过程中精确质量数的测定值与理论值之间相差要小于20ppm。

f、结合分类的结果与化学基团的结果以及系列成分的碎裂规律对化合物的结构进行确证

快速分类的结果是确定了待鉴定化合物的母核结构，结合e中待鉴定化合物所含基团的确定并参照参考文献可初步的确定该化合物的结构。对于有标准品的成分20(S)-人参皂苷R1，Rb1，Rb2，Rb3，Rc，Rd，Re，Rg1，Rg2，Rg3，Rh1，Rh2，五味子甲素，五味子乙素及五味子醇甲，可进一步与标准品的保留时间、精确分子量、多级碎裂图谱进行比较，以确证化合物的结构。

以峰12b作为例子具体说明快速筛选及鉴定过程。峰12b的碎片离子中含有475.3785和391.2837，因此通过d步骤很容易将其归为B型人参皂苷。准分子离子783.4925与苷元离子(DFI1)475.3785的精确质量数之差为308.1140，对应于一个脱氧已糖与一个已糖的组合丢失。苷元离子(DFI1)与碎片离子637.4356的质量之差为162.0571对应于一个已糖残基，然而比苷元离子(DFI1)质量数大146.06的离子并不存在，说明脱氧已糖和已糖是以双糖的形式连接在苷元上的，而且已糖直接连在苷元上。碎片离子637.4356与准分子离子之间的差值是146.0569，进一步证明了末端脱氧已糖的存在。这些碎片离子提供了详细的单糖连接顺序的信息，结合母核结构的确定，峰12被初步鉴定为人参皂苷Rg2。进一步通过与标准品的保留时间、分子量、多级碎裂图谱的比较，峰12b被最终确定为20(S)-人参皂苷Rg2。

如表1，2所示，共分析出30余种人参皂苷类成分及20余种木脂素类成分，其中80％以上的人参皂苷和90％以上的木脂素可以运用诊断离子延伸策略快速鉴定。这些结果证明了本发明具有极高的可行性和有效性。但由于质谱分析自身的局限性，在缺乏相应标准品的前提下，本发明对于某此差异很小的同分异构体不能判别，如峰22可能是人参皂苷Rs1或Rs2。

表1.生脉注射液中人参皂苷类成分的鉴定

母离子的类型：A：[M-H]^-；B：[M-2H]^2-；C：[M+AcO]^-；D：[M-H+AcO]^2-。

^a：诊断离子没有出现；^s：用标准品进行确证了的组份；^*：诊断离子。

表2 生脉注射液中木脂素类成分的鉴定

^a：诊断离子没有出现；^s：用标准品进行确证了的组份；^*：诊断离子。

Claims (6)

1、一种中药复杂体系中系列成分的筛选及鉴定方法，包括以下步骤：

A、制备含有中药复杂体系中各系列成分的供试品溶液，

B、采用高效液相-离子阱-飞行时间串联质谱仪对供试品溶液进行正或负离子全扫描得到总离子流色谱图以及多级碎片信息，

C、运用诊断离子延伸策略进行中药复杂体系中系列成分的筛选及鉴定，其特征在于诊断离子延伸策略由如下几个步骤组成：

a、分别将标准品或系列成分的标准提取物注入高效液相-离子阱-飞行时间串联质谱仪，获得母离子及碎片离子的精确质量数，综合每一系列化合物的碎片信息，将普遍存在的、丰度较大的碎片离子选定为该系列成分的诊断离子，并根据碎裂的情况总结出系列成分的碎裂规律；

b、将得到的每一系列成分的诊断离子分别输入数据处理工作站，从而对通过B步骤得到的中药复杂体系的总离子流色谱图中所检测到的峰进行分类；

c、基于分类后化合物的母离子与碎片离子的精确质量数之差及各系列成分的碎裂规律判断各化合物所含的基团；

d、结合分类的结果与化学基团的结果以及系列成分的碎裂规律对化合物的结构进行确证。

2、权利要求1的筛选及鉴定方法，其中中药复杂体系是单味中药或中药复方经炮制后的产物。

3、权利要求1的筛选及鉴定方法，其中B步骤中色谱条件为：

色谱柱：柱长100-300mm，内径2-16mm，填料粒度2-7μm；

柱温：10-70℃；

进样量：1-50μl；

流速：0.01-1.50ml/min；

流动相组成：由水相和有机相组成，水相为含酸、碱或盐的水，有机相为甲醇或乙腈；

进行梯度或等度洗脱。

4、权利要求1的筛选及鉴定方法，其中a步骤中获得系列成分的诊断离子以及碎裂规律是基于标准品或系列成分的标准提取物得到。

5、权利要求1的筛选及鉴定方法，其中a步骤中获得的诊断离子与系列成分的母核相关。

6、权利要求1的筛选及鉴定方法，其中b与c步骤中筛选及鉴定中药复杂体系中系列成分的过程中，精确质量数的测定值与理论值之间相差小于20ppm。

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