CN103592376B - 一种疏血通注射液的高效液相色谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种药物制剂的质量控制方法，特别涉及疏血通注射液质量控制的新方法。本发明提供了一种液相色谱(HPLC)分离，质谱(MS)检测，结合主成分分析(PCA)统计学软件，建立疏血通注射液的LC-MS-PCA分析、检测、统计相结合的模型，并用此模型进行疏血通注射液质量控制。

Description

一种疏血通注射液的高效液相色谱检测方法

技术领域

本发明属于中药分析领域，涉及一种中药制剂的质量控制方法，具体来说，就是采用一种液相色谱(HPLC)分离，进行质谱(MS)检测，结合主成分分析(PCA)统计学软件，建立疏血通注射液的LC-MS-PCA分析、检测、统计相结合的质量控制模型，并用此模型进行疏血通注射液质量控制。 

背景技术：

中药成分复杂，中药中任何一种成分的质量检测标准都不能代表整个中药的质量标准，美国FDA、世界卫生组织、中国食品药品监督管理局等相继认可并使用中药指纹图谱控制中药工艺稳定、中药制剂半成品及成品质量，证明产品的一致性。 

中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或者光谱图，是一种综合的，可量化的鉴定手段。它的两大特色是“整体性”和“模糊性”，即通过待测样品的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度比对，可以直接评价中药制剂半成品及成品质量的真实性、优良性和稳定性。中药指纹谱图虽然已被普遍接受，但在实际应用中也存在一些不足：一是中药来源不稳，不同药材其指纹图谱有一定的差异，不利于指纹图谱的应用，因此在制定标准指纹图谱时，所选取的药材来源及成药的工艺应相对稳定，有足够的代表性，同时保证质量，才能保证标准指纹图谱的先进性和代表性；二是对大量信息的化学计量处理方法还不够完善，指纹图谱的特征性不够明确具体，指纹图谱与药理作用的相关性缺乏研究；三是分离技术不够成熟，目前通常采用的单一分离、检测器很难对中药复杂的化学成分或有效成分进行完全分离，致使大量信息丢失；四、灵敏度不高，不能将所有成分有效检测；五是指纹图谱的不确定性，待测品的指纹图谱与标准指纹图谱比对，相似度大于某一值即认为是合格品，但差异性却往往导致不合格产品的存在。 

本发明专利将LC-MS技术与PCA(Principal component analysis)分析技术相结合，从整体考察各个成分及相互关系，通过有效的找出数据中最主要的元素和结构，将原有复杂的数据降维，对众多成分进行分析，弥补指纹图谱检测方法的不足： 

1、由于LC-MS仪器自身特点，测试数据灵敏度高，可检测更多用原方法因检测限较低导致未检测出的物质，且稳定性和重现性好； 

2、LC-MS分离检测原理是质荷比，不会出现因单纯色谱不显色而导致的检测、分析偏差； 

3、LC-MS-PCA检测分析技术的模型是由全成分分析后的大量统计学数据获得，测试者可通过已建立的模型，迅速、直观判定产品是否合格，测试结果精确性高，且受药材来源影响较小；目前疏血通注射液采用大类成分的指纹图谱技术对成品进行控制，即分别采用氨基酸类、糖类和内源性小分子，实际操作复杂，且无法解释经检验合格后，临床仍有不良反应的发生，即该方法作为质量控制标准仍存在不足。而本发明专利对拟补现有指纹图谱的不足具有重要的临床运用价值，可有效针对疏血通产品的质量控制。 

发明内容：

1、发明的目的 

本发明的目的在于提供一种液相色谱(HPLC)分离，质谱(MS)检测，结合主成分分析(PCA)统计学软件，建立疏血通注射液的LC-MS-PCA分析、检测、统计相结合的模型，并用此模型进行疏血通注射液质量控制。 

2、本发明的具体技术方案 

疏血通注射液质量控制的LC-MS-PCA方法，包括如下步骤： 

(1)疏血通注射液正常批次样品：近两年来在市场上销售未出现不良反应的100批样品，作为LC-MS-PCA分析正常批次样品。 

(2)疏血通注射液异常批次样品：近两年来在市场上销售出现不良反应的30批样品，作为LC-MS-PCA分析异常批次样品。 

(3)检测：分别精密吸取各批次疏血通注射液样品2μl，注入液质联用仪，获得原始分析数据。 

其中，色谱分离条件：色谱柱为亲水性色谱柱，优选色谱柱填料为经过特殊正相处理的十八烷基键合硅胶，或者磺酸根和氨根键合硅胶。使用第一种色谱柱时，柱温优选25℃，使用第二种色谱柱时，柱温优选40℃。使用第一种色谱柱时，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，按体积比计算，0min-8min，1％的流动相B，12min时，11％的流动相B，20min时，30％的流动相B，25min时，99％的流动相B，30min时，99％的流动相B；使用第二种色谱柱时，流动相A为20mM的乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，按体积比计算，0min-5min，95％的流动相B，15min时，50％的流动相B，25min时，50％的流动相B。流速为0.3ml/min。 

其中，质谱检测条件：正离子质谱模式，采用电喷雾离子源(ESI)，雾化气体和干燥气体为氮气，其中雾化压力为55psi，干燥气流速为6.0L/min，干燥气温度为350℃，鞘气为氮气，流速为11L/min，温度为350℃，毛细管高压为3500V，裂解电压为135V，全扫描，目标MS/MS扫描，所有离子MS/MS扫描。 

其中，数据处理采用分子特征峰的提取(MFE)，扣除背景噪音，归属同一个化合物的所有质谱信号(包括：不同加合离子、同位素、聚合体、多价离子、中性丢失)与保留时间相关联，使之成为代表一个化合物的数据集，并最终创建了一个化合物集合的交换格式文件。 

其中，PCA分析采用对LC-MS测试数据进行降维，对主成分进行分析，建立差异分析模型，通过多维图谱将数据清晰显现，其中正常批次疏血通注射液在多维图谱中集中的区域定义为疏血通合格产品区域。 

3、本发明的有益效果 

中药注射剂化学成分复杂，此方法可发挥LC-MS仪器自身优势，检测出液相方法因检测限较低而未能检出的物质，也可避免因单纯色谱不显色而导致的检测、分析偏差，同时本方法的分析模型是由大量数据的统计学分析获得，测试结果与指纹图谱的相似法相比精确性更高。 

而针对疏血通的质量控制，本方法与现有的指纹图谱方法相比，避免对疏血通样品进行氨基酸、糖、小分子三类成分的分别检测和指纹图谱比对，且不用进行柱前柱后等各种衍生化处理，只需对疏血通成品直接取样进行一次性检测，方法不仅简便，而且在较短时间内即可获得满意结果；同时此方法拟补了现有指纹图谱中使用相似法比对的不足，可有效减少或避免不良反应批次产品流入市场；另外此方法使用检测样品用量极少，对于实现长期生产应用具有实际意义。 

附图： 

图1：九次进样对应的色谱图重叠效果图(色谱柱：安捷能SB-AQ) 

图2：正常批次与异常批次差异分析结果图(PCA分析) 

图3：有监督的模式识别方法-PLSD模型图 

图4：正、异常批次差异成分显示图 

图5：实例的差异成分鉴定图 

图6：FigerPrint软件考察不同批次产品的相似度图 

图7：：疏血通注射液HPLC图(UV检测，HILIC色谱柱) 

图8：疏血通注射液HPLC图(ELSD检测，HILIC色谱柱) 

图9：PCA分析结果图 

图10：差异性化合物分析结果图 

图11：PCA分析趋势图 

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步说明本发明，但不构成对本发明的限制。 

实施例1： 

仪器：安捷伦1290液相色谱仪(HPLC)，安捷能6530高分辨率四极杆飞行时间串联质谱仪(Q-TOF MS) 

高效液相色谱分离条件：选择捷伦SB-Aq色谱柱；流动相：A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱液，按体积比计算，0min-8min，1％的流动相B，12min时，11％的流动相B，20min时，30％的流动相B，25min时，99％的流动相B，30min时，99％的流动相B；流速0.3ml/min； 

质谱检测条件：正离子质谱模式，采用电喷雾离子源(ESI)，雾化气体和干燥气体为氮气，其中雾化压力为55psi，干燥气流速为6.0L/min，干燥气温度为350℃，鞘气为氮气，流速为11L/min，温度为350℃，毛细管高压为3500V，裂解电压为135V，全扫描，目标MS/MS扫描，所有离子MS/MS扫描。 

PCA分析：采用有监督的模式识别方法-PLSD模型进行建模分析。 

结果：采用疏血通注射液质量控制的LC-MS-PCA方法，对6个正常批次疏血通注射液待测样品和1个异常疏血通注射液待测样品进行统计分析，发现有6个正常批次的疏血通样品均落在已建立的疏血通合格产品区域内，而1个批次产品落在了区域外，同时观察质谱图中第14.5min的出峰情况，发现仅异常批次产品在此处有质谱峰，我们判断该批次产品为异常批次产品。 

实施例2 

仪器：安捷伦1290液相色谱仪(HPLC)，安捷能二极管阵列检测器(G4212B-DAD)， 蒸发光散射检测器(380-ELSD) 

高效液相色谱分离条件：选HILIC色谱柱；流动相：A为20mm乙酸铵的水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱液，按体积比计算，0min-5min，95％的流动相B，15min时，50％的流动相B，25min时，50％的流动相B；流速0.3ml/min； 

紫外检测波长：254nm。 

ELSD条件：喷雾室温度40℃；蒸发室温度90℃；气体流速1.6SLM；LED强度100％；滤波3.0％；增益值1.0。 

结果：采用HILIC色谱柱和选择的色谱条件，紫外检测器和蒸发光散射检测器相配合，可实现在较低检测限时，对疏血通注射液有紫外和无紫外吸收全成分的检测。 

实施例3 

仪器：Waters ACQUITY UPLC液相色谱仪，Waters Xevo G2-S高分辨率四极杆飞行时间串联质谱仪(Q-TOF MS) 

高效液相色谱分离条件：选择ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱；流动相：A为乙腈∶水＝90∶10+0.1％甲酸+10mM乙酸铵，流动相B为水+0.1％甲酸+10mM乙酸铵，梯度洗脱液，按体积比计算，0min-0.3min，99％的流动相B，15min时，55％的流动相B，16min时，1％的流动相B，17min时，1％的流动相B，17.5min时，99％的流动相B，20min时，99％的流动相B；流速0.3ml/min； 

质谱检测条件：正离子质谱模式，采用电喷雾离子源(ESI)，雾化气体和干燥气体为氮气，毛细管电压为3500V，锥孔电压45V，离子源温度150℃，脱溶剂气体温度450℃，脱溶剂气流速900L/h，椎孔气体流速50L/h，碰撞能量30eV全扫描，目标MS/MS扫描，所有离子MS/MS扫描。 

PCA分析：采用MarkerLynx软件考察不同批次产品的差异。 

结果：采用疏血通注射液质量控制的LC-MS-PCA方法，对4个正常批次疏血通注射液待测样品和1个异常疏血通注射液待测样品进行统计分析，发现有4个正常批次的疏血通样品均落在已建立的疏血通合格产品区域内，而1个批次产品落在了区域外。 

Claims (4)

1.一种疏血通注射液的高效液相色谱检测方法，其特征在于：

(1)色谱条件：安捷伦SB-Aq色谱柱；流动相：A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，按体积比计算，0min-8min，1％的流动相B，12min时，11％的流动相B，20min时，30％的流动相B，25min时，99％的流动相B，30min时，99％的流动相B；流速0.3ml/min；MS/MS检测；(2)对照品溶液的制备方法：取次黄嘌呤对照品适量，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含0.01mg～1mg的溶液，即得次黄嘌呤对照品溶液；取丙氨酸对照品适量，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含0.01mg～0.5mg的溶液，即得丙氨酸对照品溶液；(3)供试品溶液制备方法：取疏血通注射液直接作为供试品溶液；(4)分别量取等量的对照品溶液与供试品溶液各1μl～20μl，注入高效液相色谱仪，测定30分钟以上色谱图，检测后运用主成分分析。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于质谱检测条件：正离子模式，电喷雾离子源，雾化气体和干燥气体为氮气，其中雾化压力为55psi，干燥气流速为6.0L/min，干燥气温度为350℃，鞘气为氮气，流速为11L/min，温度为350℃，毛细管高压为3500V，裂解电压为135V，全扫描，目标MS/MS扫描，所有离子MS/MS扫描。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于主成分分析步骤如下：

(1)疏血通注射液近两年来在市场上销售未出现不良反应的3-300批样品，作为主成分分析合格批次建模对象；(2)疏血通注射液近两年来在市场上销售出现不良反应的3-100批样品，作为主成分分析不合格批次建模对象；(3)样品基于预测模型可被分配至相应模型组，以一种无偏的方式预测新样品归属，生成分类结果并以可视化的形式输出。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于主成分分析具体步骤：

(1)疏血通注射液近两年来在市场上销售未出现不良反应的100批样品，作为主成分分析合格批次建模对象；(2)疏血通注射液近两年来在市场上销售出现不良反应的30批样品，作为主成分分析不合格批次建模对象；(3)采用偏最小二乘判别分析法(PLSD)为类别预测算法建立模型，样品基于预测模型可被分配至相应模型组，以一种无偏的方式预测新样品归属，生成分类结果并以可视化的形式输出。