CN105044223A - 一种参芎葡萄糖注射液的化学成分鉴定及活性成分筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种参芎葡萄糖注射液的化学成分鉴定及活性成分筛选方法，属于中药制剂质量控制的技术领域。本发明采用超高效液相色谱-二极管阵列检测器-串联四级杆飞行时间质谱(UPLC-DAD-Q/TOF)对参芎葡萄糖注射液中主要化学成分进行全面的在线分析鉴定，确定化合物的结构；同时进一步将心肌细胞萃取技术和超高效液相色谱-电喷雾-三重四级杆串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)分析技术相结合，对参芎葡萄糖注射液中活性成分进行筛选。本发明可以快速、有效地确定中药各成分的化学结构及其主要活性成分，可为参芎葡萄糖注射液的质量评价提供科学试验依据。
Description
技术领域
本发明属于中药制剂质量控制的技术领域，特别涉及一种参芎葡萄糖注射液的化学成分鉴定及活性成分筛选方法。
背景技术
“参芎葡萄糖注射液”由丹参和盐酸川芎嗪采用现代制剂技术制备而成的复方制剂，临床上主要广泛应用于心血管疾病的治疗。现代研究表明，丹参中的多种化学成分以及盐酸川芎嗪均具有心脏保护作用的生物活性，但丹参及盐酸川芎嗪配伍所制成的复方制剂“参芎葡萄糖注射液”，其化学成分与药效之间的关系目前尚无文献报道。由于“参芎葡萄糖注射液”药效物质基础尚不明确，参芎葡萄糖注射液现行质量标准的含量测定项目只对丹参素和盐酸川芎嗪进行定量控制，难以全面反映制剂的化学成分特征。因此，建立一种能快速、有效地确定参芎葡萄糖中各成分的化学结构及其主要活性成分的方法，实现对其物质群的全面控制，为参芎葡萄糖注射液的质量评价提供科学试验依据，具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种参芎葡萄糖注射液的化学成分鉴定及活性成分筛选方法。
本发明针对“参芎葡萄糖注射液”药效物质基础尚不明确，现行质量标准的含量测定成分单一的问题，首次对参芎葡萄糖注射液的化学成分进行系统、整体研究，建立的方法可以快速、有效地确定参芎葡萄糖注射液中各成分的化学结构及其主要活性成分，可为参芎葡萄糖注射液的质量评价提供科学依据，提升制剂的质量控制水平。
本发明所述的参芎葡萄糖注射液的化学成分鉴定及活性成分筛选方法，由以下步骤组成：
步骤一、拟定化学成分鉴定分析条件步骤
运用超高效液相色谱-二极管阵列检测器-串联四级杆飞行时间质谱方法，运用超高效液相色谱-二极管阵列检测器-串联四级杆飞行时间质谱(UPLC-DAD-Q/TOF)技术，拟定的分析条件；
步骤二、获取参芎葡萄糖注射液中各个色谱峰/成分步骤
根据步骤一中所拟定的化学成分鉴定分析条件，分别吸取对照品溶液和参芎葡萄糖注射液供试品溶液进样测定，获取参芎葡萄糖注射液中各个色谱峰/成分的保留时间tR、紫外光谱图UV、分子式、各个成分的质量的一级质谱图和某成分的特征碎片离子的二级质谱图；
步骤三、化学成分结构鉴定步骤
针对步骤二所获取的参芎葡萄糖注射液中各个色谱峰/成分的保留时间tR、紫外光谱图UV、分子式、各个成分的质量的一级质谱图和某成分的特征碎片离子的二级质谱图来鉴定步骤二的参芎葡萄糖注射液供试品溶液中所含有的化学成分的特征；其中一方面，通过步骤二的对照品溶液比对试验，分析步骤二的参芎葡萄糖注射液供试品溶液中已知化合物的结构；另一方面，通过未知化合物的分子式、紫外最大吸收波长、分子离子及碎片离子信息、质谱裂解特征，鉴定步骤二的参芎葡萄糖注射液供试品溶液的未知化合物结构；
步骤四、心肌细胞萃取实验步骤
利用固相萃取小柱富集纯化，制备参芎葡萄糖注射液样品，选择与参芎葡萄糖注射液样品临床适应症心血管疾病相关的H9c2心肌细胞作为载体进行心肌细胞萃取，制备细胞萃取阴性对照溶液、参芎葡萄糖注射液细胞萃取样品溶液和细胞萃取空白对照溶液；
步骤五、活性成分筛选步骤
运用超高效液相色谱-电喷雾-三重四级杆串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)技术，拟定的分析条件，分别对步骤四的参芎葡萄糖注射液样品、细胞萃取空白对照溶液、细胞萃取阴性对照溶液、参芎葡萄糖注射液细胞萃取样品溶液进样分析；应用多反应监测(MRM)的离子通道即MRM方式，通过对母离子和子离子特异性的跟踪监测，筛选出参芎葡萄糖注射液中能与心肌细胞有相互作用的成分，即为参芎葡萄糖注射液中具有心血管作用的潜在活性成分。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤二中，所述拟定的分析条件具体如下：
1)拟定UPLC液相条件：色谱柱：AgilentPlusPlusC18(2.1mm×100mm,1.8μm)柱；柱温：20℃；流速：0.30mL·min-1；流动相：0.1％甲酸乙腈(A)-0.1％甲酸水(B)；梯度洗脱条件：0～18min，5％～62％(A)；18～19min，62％～100％(A)；进样体积：1μL；
2、拟定Q-TOF质谱条件：采用电喷雾电离源ESI；在负离子模式下采集数据；数据采集范围m/z50～1000；毛细管电压2800V；雾化气N2，雾化气压力1.2Bar；去溶剂气N2，去溶剂气流速8L·min-1，去溶剂气温度200℃；质谱数据采集及处理软件为Compass1.2。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤二中，所述参芎葡萄糖注射液供试品溶液的制备方法如下：取参芎葡萄糖注射液10mL，加水稀释，定容至25mL，摇匀即可；所述对照品溶液的制备方法如下：分别精密称取丹参素钠、盐酸川芎嗪、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸D适量，分别置于8个10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度分别为1.056，1.049，1.084，1.103，1.020，1.046，1.036，1.057mg·mL-1的丹参素钠、盐酸川芎嗪、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸D对照品溶液。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤三中，通过参芎葡萄糖注射液供试品溶液与对照品比较各个色谱峰/成分的保留时间tR、紫外光谱图UV、各个成分的质量的一级质谱图和某成分的特征碎片离子的二级质谱图，分别鉴定丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、盐酸川芎嗪、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸A和丹酚酸B；通过未知化合物的分子式、紫外最大吸收波长、分子离子及碎片离子信息、质谱裂解特征，分别鉴定丹酚酸I/H、紫草酸和丹酚酸C。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤四中，所述参芎葡萄糖注射液样品制备方法如下：取参芎葡萄糖注射液100mL，经减压浓缩至小体积，用1mol/L的盐酸溶液调节供试品溶液pH值至3，经OasisHLB固相萃取小柱(用5mL甲醇活化OasisHLB小柱，用2mL水冲洗至无醇味后上样)纯化，先用水洗脱以除去供试品中的糖类成分，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液减压浓缩得到浸膏，将浸膏用水溶解至浓度为2mg/mL得到参芎葡萄糖注射液样品。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤四中，所述制备细胞萃取阴性对照溶液、参芎葡萄糖注射液细胞萃取样品溶液和细胞萃取空白对照溶液的制备方法如下：
(1)DMEM培养基的配制
每袋培养基先加入600mL三蒸水，加入3.7gNaHCO3，0.11g丙酮酸钠，终浓度为100U/mL的青霉素和链霉素，适量两性霉素，充分搅拌溶解，定容至1L，调节pH值为7.0-7.2，0.22μm滤器过滤除菌，分装，4℃冰箱保存备用；
(2)H9c2心肌细胞的培养
取冻存于液氮中的H9c2细胞一株，置37℃水浴中迅速溶解后移入装有1mL含10％胎牛血清DMEM培养基的离心管中充分混合，经1000r/min，离心5min弃上清，沉淀用3mL含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬后置于37℃、5％CO2的条件下静置培养；生长2～3d细胞达到融合时用0.25％胰蛋白酶-0.53mmol/LEDTA配制的消化液传代，将细胞继续置于37℃、5％CO2的条件下静置培养；取对数生长期的H9c2心肌细胞，以每孔100μL，6-8×105个/mL接种于96孔培养板中，用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基于37℃、5％CO2培养箱中培养48h后得到H9c2心肌细胞；用于实验。
(3)细胞萃取实验
①选择步骤(2)制备的胞浆饱满、生长状态良好的H9c2细胞接种到6孔板中，实验首先用经37℃温浴的PBSA轻轻冲洗细胞表面，去除残留在细胞表面的死细胞及杂质，弃去PBSA，加入2mg/mL的参芎葡萄糖注射液样品，在37℃、5％CO2的培养箱中培养45min后，倒掉药液，用PBSA轻轻浸洗3次，每次3min，而后继续用水清洗3次，每次1.5min，留下最后一次清洗液经0.22μM滤膜过滤，作为细胞萃取阴性对照溶液；
②将清洗过的细胞用75％乙醇超声处理20min，使细胞膜上受体变性释放化合物，然后用显微镜检查，以确保其充分溶解，裂解物以10000rpm离心10min，而后将上清液合并，在真空下除去溶剂后，将获得的粘性浓缩物溶入5mL甲醇中，然后将溶液转移到epp管中，氮气流平稳干燥，并将之溶解在0.5mL甲醇中，经0.22μM滤膜过滤即为参芎葡萄糖注射液细胞萃取样品溶液；
③不加药物，以PBSA代替参芎葡萄糖注射液样品，同法操作进行空白对照试验，制得细胞萃取空白对照溶液。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤五中拟定的分析条件为拟定UPLC-ESI-MS/MS分析条件，具体如下：
UPLC液相条件：色谱柱：WatersBEHC18，2.1mm×100mm，1.7μm柱；保护柱：WatersVanGuardBEHC18，2.1mm×5mm，1.7μm；柱温：45℃；流动相：0.1％甲酸乙腈(A)-0.1％甲酸水(B)；流速为：0.30mL·min-1；梯度洗脱条件：0～5min，5％～15％(A)；5～26min，15％～100％(A)；3.0～4.0min，90％～5％(A)；进样体积：1μL；进样器的温度：15℃；
(2)拟定的UPLC-MS/MS质谱条件：电喷雾电离源(ESI)；毛细管电离电压：3kV；离子源温度：120℃；去溶剂气：N2，流速650L/h，去溶剂气温度：350℃；反吹气：N2，流速：50L/h；碰撞气：氩气，流速：0.16mL/min；质谱数据采集及处理软件为MassLynxV4.1工作站，扫描方式为多反应离子监测(MRM)，离子对条件见表1；
表1质谱条件
本发明可以快速、有效地确定中药各成分的化学结构及其主要活性成分，可为参芎葡萄糖注射液的质量评价提供科学试验依据。
附图说明
图1：参芎葡萄糖注射液UPLC-DAD-Q/TOF色谱图；1.丹参素；2.原儿茶醛；3.咖啡酸；9.丹酚酸D；10.迷迭香酸；11.丹酚酸A；12.丹酚酸B；A.参芎葡萄糖注射液UPLC-DAD色谱图；B.负离子模式下参芎葡萄糖注射液总离子流图；C.负离子模式下混合对照品总离子流图；D.正离子模式下参芎葡萄糖注射液总离子流图；E.正离子模式下盐酸川芎嗪对照品离子流图。
图2：紫草酸(化合物8)紫外光谱及质谱图；A.紫外光谱图；B.一级质谱图；C.二级质谱图。
图3：紫草酸(化合物8)质谱碎片裂解途径。
图4：丹酚酸C(化合物13)紫外光谱及质谱图；A.紫外光谱图；B.一级质谱图；C.二级质谱图。
图5：丹酚酸C(化合物13)质谱碎片裂解途径。
图6：参芎葡萄糖注射液中鉴定化学成分结构式。
图7：参芎葡萄糖注射液细胞萃取样品UPLC-(±)-ESI–MS色谱图；A.参芎葡萄糖注射液UPLC-PDA色谱图；B.负离子模式下参芎葡萄糖注射液UPLC-MS色谱图；C.正离子模式下参芎葡萄糖注射液UPLC-MS色谱图；D.细胞萃取空白对照液MRM筛选重叠色谱图；E.细胞萃取阴性对照液MRM筛选重叠色谱图；F.细胞萃取样品溶液MRM筛选重叠色谱图。
具体实施方式：
下面列举实施例进一步详细说明本发明，该实施例仅用于说明本发明而对本发明并没有限制。
实施例1：参芎葡萄糖注射液化学成分UPLC-DAD-Q-TOF/MS分析鉴定
1、样品溶液的制备
(1)对照品溶液的配制
分别精密称取丹参素钠、盐酸川芎嗪、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸D适量，分别置于8个10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度分别为1.056，1.049，1.084，1.103，1.020，1.046，1.036，1.057mg·mL-1的对照品溶液。
(2)供试品溶液的制备
取参芎葡萄糖注射液10mL，加水稀释，定容至25mL，摇匀即可。
2、分析条件
(1)超高压液相色谱(UHPLC)液相条件
色谱柱：AgilentPlusPlusC18(2.1mm×100mm,1.8μm)柱；柱温：20℃；流速：0.30mL·min-1；流动相：0.1％甲酸乙腈(A)-0.1％甲酸水(B)；梯度洗脱条件：0～18min，5％～62％(A)；18～19min，62％～100％(A)；进样体积：1μL。
(2)UHPLC-Q-TOF质谱条件
采用电喷雾电离源(ESI)；在负离子模式下采集数据；数据采集范围m/z50～1000；毛细管电压2800V；雾化气N2，雾化气压力1.2Bar；去溶剂气N2，去溶剂气流速8L·min-1，去溶剂气温度200℃；质谱数据采集及处理软件为Compass1.2。
3、数据处理与分析
根据文献报道的参芎葡萄糖注射液组方药材丹参中化学成分的信，在TargetAnalysis1.2软件中建立参芎葡萄糖注射液组方中各化学成分的精确分子量数据库。其数据搜索主要通过sciencefinder，GoogleScholar，PubMedoftheUSNationalLibraryMedicine及清华同方等数据库完成，全面汇总文献中已报道的参芎葡萄糖注射液组方的化合物信息，包括化合物名称，分子式，化学结构、分子离子及碎片离子信息等。其鉴定过程一方面通过与自建的数据库匹对，确定已知化合物的结构，并通过对照品进行比对和确认；另一方面，通过已知化合物的“相关母离子结构-相关产物离子多级裂解模式”阐释未知化合物的质谱裂解特征，并鉴定未知化合物结构。
4、参芎葡萄糖注射液化学成分分析
运用UPLC-DAD-Q-TOF/MS联用分析技术，按拟定的色谱条件，分别吸取对照品溶液和供试品溶液进样测定，研究结果表明，尽管在UPLC-DAD色谱图中并无检测到很多色谱峰，但在质谱的负离子模式下可检测到了大量的色谱峰，盐酸川芎嗪则仅在正离子模式下得以检测。UPLC-ESI-Q-TOF/MS的正负离子模式可以成功用于鉴定参芎葡萄糖注射液中所含有的特征化学成分。
(1)参芎葡萄糖注射液中特征峰的ESI-Q/TOF-MS鉴定
参芎葡萄糖注射液中明显可见13个色谱峰，采用ESI-Q/TOF质谱仪的二级质谱进行分析研究。13个色谱峰的保留时间、分子式、紫外及高分辨ESI-MS数据见表2。在对注射液中化合物进行鉴定分析，除盐酸川芎嗪外，其响应灵敏度在负离子检测模式下均优于正离子模式。
表2参芎葡萄糖注射液中化合物的色谱和质谱数据
针对UPLC-DAD-Q/TOF获取信息，用于鉴定参芎葡萄糖注射液中所含有的特征化学成分。一方面，通过对照品比对试验，分析参芎葡萄糖注射液中已知化合物的结构；另一方面，通过未知化合物的分子式、紫外最大吸收波长、分子离子及碎片离子信息、质谱裂解特征，鉴定未知化合物结构。通过与化学对照品比较各个色谱峰/成分的保留时间、在线紫外光谱图、一级质谱图和二级质谱图等信息，分别鉴定化合物1，2，3，4，9，10，11，和12为丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、盐酸川芎嗪、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸A和丹酚酸B；通过分析未知化合物的分子式、紫外最大吸收波长、分子离子及碎片离子信息、质谱裂解特征，分别鉴定化合物7，8和13为丹酚酸I/H、紫草酸和丹酚酸C。
(3)未知化合物的结构鉴定
由HR-ESI-MS谱图中的准分子离子峰m/z537.1033[M-H]-显示化合物7和8具有相同的化学分子式：C27H22O12，提示化合物7，8两个化合物为同分异构体。且两个化合物在波长为220nm，280nm以及330nm处均有最大紫外吸收，提示这两个化合物是以咖啡酰基作为发色团的同分异构体，根据质谱结果显示，连续丢失中性分子CO2(m/z493,[M-H-44]-)以及羟基二氢咖啡酸(m/z493,[M-H-44-198]-)，提示化合物结构(与丹参素相似)中存在1个羧基取代基团和1个羟基二氢咖啡酸基团，基于文献中报道的两个化合物的洗脱顺序，化合物7和8分别被鉴定为丹酚酸I/H和紫草酸。这两个化合物的质谱裂解途径可以统一通过紫草酸(化合物8)来表示。
实施例2：心肌细胞萃取筛选参芎葡萄糖注射液中心血管活性成分
1、供试品溶液的制备
取参芎葡萄糖注射液100mL，经减压浓缩至小体积，用1mol/L的盐酸溶液调节供试品溶液pH值至3，经OasisHLB固相萃取小柱(用5mL甲醇活化OasisHLB小柱，用2mL水冲洗至无醇味后上样)纯化，先用水洗脱以除去供试品中的糖类成分，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液减压浓缩得到浸膏，将浸膏用水溶解至浓度为2mg/mL，供细胞萃取实验及UPLC-PDA-MS/MS分析用。
2、心肌细胞萃取实验
根据参芎葡萄糖注射液的功能主治，选择与其临床适应症心血管疾病相关的H9c2心肌细胞作为载体，开展心肌细胞萃取实验，通过化学成分与靶细胞亲和力筛选试验，简捷、快速分离并筛选出药理活性成分。
(1)DMEM培养基的配制
每袋培养基先加入600mL三蒸水，加入3.7gNaHCO3，0.11g丙酮酸钠，终浓度为100U/mL的青霉素和链霉素，适量两性霉素，充分搅拌溶解，定容至1L，调节pH值为7.0-7.2，0.22μm滤器过滤除菌，分装，4℃冰箱保存备用。
(2)H9c2心肌细胞的培养
取冻存于液氮中的H9c2细胞一株，置37℃水浴中迅速溶解后移入装有1mL含10％胎牛血清DMEM培养基的离心管中充分混合，经1000r/min，离心5min弃上清，沉淀用3mL含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬后置于37℃、5％CO2的条件下静置培养。生长2～3d细胞达到融合时用胰蛋白酶(0.25％)-EDTA(0.53mmol/L)的消化液传代，将细胞继续置于37℃、5％CO2的条件下静置培养。取对数生长期的H9c2心肌细胞，以每孔100μL，6-8×105个/mL接种于96孔培养板中，用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基于37℃、5％CO2培养箱中培养48h后，选择胞浆饱满、生长状态良好的细胞用于实验。
(3)细胞萃取实验
①H9c2细胞接种到6孔板中，实验首先用经37℃温浴的PBSA轻轻冲洗细胞表面，去除残留在细胞表面的死细胞及杂质，弃去PBSA，加入2mg/mL的参芎葡萄糖供试品溶液，在37℃、5％CO2的培养箱中培养45min后，倒掉药液，用PBSA轻轻浸洗3次，每次3min，而后继续用水清洗3次，每次1.5min，留下最后一次清洗液经0.22μM滤膜过滤，作为阴性对照溶液；②将清洗过的细胞用75％乙醇超声处理20min(使细胞膜上受体变性释放化合物)，然后用显微镜检查，以确保其充分溶解。裂解物以10000rpm离心10min，而后将上清液合并，在真空下除去溶剂后，将获得的粘性浓缩物溶入5mL甲醇中，然后将溶液转移到epp管中，氮气流平稳干燥，并将之溶解在0.5mL甲醇中，经0.22μM滤膜过滤即为参芎样品溶液；③不加药物，以PBSA代替参芎葡萄糖供试品溶液，同法操作进行空白对照试验，制得空白对照溶液，供UPLC-MRM分析用。
3、色谱条件
UPLC液相条件：色谱柱：WatersBEHC18(2.1mm×100mm，1.7μm)柱；保护柱：WatersVanGuardBEHC18(2.1mm×5mm，1.7μm)；柱温：45℃；流动相：0.1％甲酸乙腈(A)-0.1％甲酸水(B)；流速为：0.30mL·min-1；梯度洗脱条件：0～5min，5％～15％(A)；5～26min，15％～100％(A)；3.0～4.0min，90％～5％(A)；进样体积：1μL；进样器的温度：15℃。
UPLC-MS/MS质谱条件：电喷雾电离源(ESI)；毛细管电离电压：3kV；离子源温度：120℃；去溶剂气：N2，流速650L/h，去溶剂气温度：350℃；反吹气：N2，流速：50L/h；碰撞气：氩气，流速：0.16mL/min；质谱数据采集及处理软件为MassLynxV4.1工作站，扫描方式为多反应离子监测(MRM)，离子对条件见表3。
表3质谱条件
4、参芎葡萄糖注射液心肌细胞萃取样品UPLC-(±)-ESI–MS分析
采用UPLC-MS/MS(正/负离子模式)技术，将参芎葡萄糖注射液、细胞萃取空白对照液、细胞萃取阴性对照液、参芎葡萄糖注射液细胞萃取样品溶液分别进样分析，比较参芎葡萄糖注射液与心肌细胞结合前后生物指纹图谱峰面积的变化，分析细胞破碎液中与活性细胞相结合的成分，从而筛选出参芎葡萄糖注射液中能与心肌细胞有相互作用的成分。
应用LC-MS-MRM技术分析鉴定参芎葡萄糖注射液中潜在的心血管活性成分，通过对母离子和子离子特异性的跟踪监测，将待检测的成分与内源性杂质完全区分开来，有效消除基质干扰，专属性强、灵敏度高。在所测定到的UPLC-(±)-ESI-MS色谱图中，有11个色谱峰(峰1,2,4,5,6,7,8,9,10,12,13)明显可辨，具有清晰可识别的信号和分子量，使用正模式(对川芎嗪)或负模式将其用以二级质谱研究，以检测其在细胞萃取后的多反应监测的离子对。细胞萃取的空白对照和阴性对照叠加图中均未出现所检测的化合物。然而，在这11个化合物中有8个(化合物1,4,7,8,9,10,12与13)目标化合物在细胞萃取物的MRM检测模式的叠加图中被检测到，可被视为参芎葡萄糖注射液中能与心肌细胞有相互作用的成分。经鉴定，这些化合物分别丹参素、盐酸川芎嗪、丹酚酸I/H、紫草酸、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸C，上述成分即为参芎葡萄糖注射液中具有心血管作用的潜在活性成分，是其发挥药理作用的效应物质基础。
Claims (7)
1.参芎葡萄糖注射液的化学成分鉴定及活性成分筛选方法，其特征在于，由以下步骤组成：
步骤一、拟定化学成分鉴定分析条件步骤
运用超高效液相色谱-二极管阵列检测器-串联四级杆飞行时间质谱方法，运用超高效液相色谱-二极管阵列检测器-串联四级杆飞行时间质谱(UPLC-DAD-Q/TOF)技术，拟定的分析条件；
步骤二、获取参芎葡萄糖注射液中各个色谱峰/成分步骤
根据步骤一中所拟定的化学成分鉴定分析条件，分别吸取对照品溶液和参芎葡萄糖注射液供试品溶液进样测定，获取参芎葡萄糖注射液中各个色谱峰/成分的保留时间tR、紫外光谱图UV、分子式、各个成分的质量的一级质谱图和某成分的特征碎片离子的二级质谱图；
步骤三、化学成分结构鉴定步骤
针对步骤二所获取的参芎葡萄糖注射液中各个色谱峰/成分的保留时间tR、紫外光谱图UV、分子式、各个成分的质量的一级质谱图和某成分的特征碎片离子的二级质谱图来鉴定步骤二的参芎葡萄糖注射液供试品溶液中所含有的化学成分的特征；其中一方面，通过步骤二的对照品溶液比对试验，分析步骤二的参芎葡萄糖注射液供试品溶液中已知化合物的结构；另一方面，通过未知化合物的分子式、紫外最大吸收波长、分子离子及碎片离子信息、质谱裂解特征，鉴定步骤二的参芎葡萄糖注射液供试品溶液的未知化合物结构；
步骤四、心肌细胞萃取实验步骤
利用固相萃取小柱富集纯化，制备参芎葡萄糖注射液样品，选择与参芎葡萄糖注射液样品临床适应症心血管疾病相关的H9c2心肌细胞作为载体进行心肌细胞萃取，制备细胞萃取阴性对照溶液、参芎葡萄糖注射液细胞萃取样品溶液和细胞萃取空白对照溶液；
步骤五、活性成分筛选步骤
运用超高效液相色谱-电喷雾-三重四级杆串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)技术，拟定的分析条件，分别对步骤四的参芎葡萄糖注射液样品、细胞萃取空白对照溶液、细胞萃取阴性对照溶液、参芎葡萄糖注射液细胞萃取样品溶液进样分析；应用多反应监测(MRM)的离子通道即MRM方式，通过对母离子和子离子特异性的跟踪监测，筛选出参芎葡萄糖注射液中能与心肌细胞有相互作用的成分，即为参芎葡萄糖注射液中具有心血管作用的潜在活性成分。
2.如权利要求1所述的参芎葡萄糖注射液的化学成分鉴定及活性成分筛选方法，其特征在于，所述步骤二中，所述拟定的分析条件具体如下：
1)拟定UPLC液相条件：色谱柱：AgilentPlusPlusC18(2.1mm×100mm,1.8μm)柱；柱温：20℃；流速：0.30mL·min-1；流动相：0.1％甲酸乙腈(A)-0.1％甲酸水(B)；梯度洗脱条件：0～18min，5％～62％(A)；18～19min，62％～100％(A)；进样体积：1μL；
2、拟定Q-TOF质谱条件：采用电喷雾电离源ESI；在负离子模式下采集数据；数据采集范围m/z50～1000；毛细管电压2800V；雾化气N2，雾化气压力1.2Bar；去溶剂气N2，去溶剂气流速8L·min-1，去溶剂气温度200℃；质谱数据采集及处理软件为Compass1.2。
3.如权利要求2所述的参芎葡萄糖注射液的化学成分鉴定及活性成分筛选方法，其特征在于，所述步骤二中，所述参芎葡萄糖注射液供试品溶液的制备方法如下：取参芎葡萄糖注射液10mL，加水稀释，定容至25mL，摇匀即可；所述对照品溶液的制备方法如下：分别精密称取丹参素钠、盐酸川芎嗪、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸D适量，分别置于8个10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度分别为1.056，1.049，1.084，1.103，1.020，1.046，1.036，1.057mg·mL-1的丹参素钠、盐酸川芎嗪、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸D对照品溶液。
4.如权利要求3所述的参芎葡萄糖注射液的化学成分鉴定及活性成分筛选方法，其特征在于，所述步骤三中，通过参芎葡萄糖注射液供试品溶液与对照品比较各个色谱峰/成分的保留时间tR、紫外光谱图UV、各个成分的质量的一级质谱图和某成分的特征碎片离子的二级质谱图，分别鉴定丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、盐酸川芎嗪、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸A和丹酚酸B；通过未知化合物的分子式、紫外最大吸收波长、分子离子及碎片离子信息、质谱裂解特征，分别鉴定丹酚酸I/H、紫草酸和丹酚酸C。
5.如权利要求4所述的参芎葡萄糖注射液的化学成分鉴定及活性成分筛选方法，其特征在于，所述步骤四中，所述参芎葡萄糖注射液样品制备方法如下：取参芎葡萄糖注射液100mL，经减压浓缩至小体积，用1mol/L的盐酸溶液调节供试品溶液pH值至3，经OasisHLB固相萃取小柱(用5mL甲醇活化OasisHLB小柱，用2mL水冲洗至无醇味后上样)纯化，先用水洗脱以除去供试品中的糖类成分，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液减压浓缩得到浸膏，将浸膏用水溶解至浓度为2mg/mL得到参芎葡萄糖注射液样品。
6.如权利要求5所述的参芎葡萄糖注射液的化学成分鉴定及活性成分筛选方法，其特征在于，所述步骤四中，所述制备细胞萃取阴性对照溶液、参芎葡萄糖注射液细胞萃取样品溶液和细胞萃取空白对照溶液的制备方法如下：
(1)DMEM培养基的配制
每袋培养基先加入600mL三蒸水，加入3.7gNaHCO3，0.11g丙酮酸钠，终浓度为100U/mL的青霉素和链霉素，适量两性霉素，充分搅拌溶解，定容至1L，调节pH值为7.0-7.2，0.22μm滤器过滤除菌，分装，4℃冰箱保存备用；
(2)H9c2心肌细胞的培养
取冻存于液氮中的H9c2细胞一株，置37℃水浴中迅速溶解后移入装有1mL含10％胎牛血清DMEM培养基的离心管中充分混合，经1000r/min，离心5min弃上清，沉淀用3mL含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬后置于37℃、5％CO2的条件下静置培养；生长2～3d细胞达到融合时用0.25％胰蛋白酶-0.53mmol/LEDTA配制的消化液传代，将细胞继续置于37℃、5％CO2的条件下静置培养；取对数生长期的H9c2心肌细胞，以每孔100μL，6-8×105个/mL接种于96孔培养板中，用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基于37℃、5％CO2培养箱中培养48h后得到H9c2心肌细胞；用于实验。
(3)细胞萃取实验
①选择步骤(2)制备的胞浆饱满、生长状态良好的H9c2细胞接种到6孔板中，实验首先用经37℃温浴的PBSA轻轻冲洗细胞表面，去除残留在细胞表面的死细胞及杂质，弃去PBSA，加入2mg/mL的参芎葡萄糖注射液样品，在37℃、5％CO2的培养箱中培养45min后，倒掉药液，用PBSA轻轻浸洗3次，每次3min，而后继续用水清洗3次，每次1.5min，留下最后一次清洗液经0.22μM滤膜过滤，作为细胞萃取阴性对照溶液；
②将清洗过的细胞用75％乙醇超声处理20min，使细胞膜上受体变性释放化合物，然后用显微镜检查，以确保其充分溶解，裂解物以10000rpm离心10min，而后将上清液合并，在真空下除去溶剂后，将获得的粘性浓缩物溶入5mL甲醇中，然后将溶液转移到epp管中，氮气流平稳干燥，并将之溶解在0.5mL甲醇中，经0.22μM滤膜过滤即为参芎葡萄糖注射液细胞萃取样品溶液；
③不加药物，以PBSA代替参芎葡萄糖注射液样品，同法操作进行空白对照试验，制得细胞萃取空白对照溶液。
7.如权利要求6所述的参芎葡萄糖注射液的化学成分鉴定及活性成分筛选方法，其特征在于，所述步骤五中拟定的分析条件为拟定UPLC-ESI-MS/MS分析条件，具体如下：
UPLC液相条件：色谱柱：WatersBEHC18，2.1mm×100mm，1.7μm柱；保护柱：WatersVanGuardBEHC18，2.1mm×5mm，1.7μm；柱温：45℃；流动相：0.1％甲酸乙腈(A)-0.1％甲酸水(B)；流速为：0.30mL·min-1；梯度洗脱条件：0～5min，5％～15％(A)；5～26min，15％～100％(A)；3.0～4.0min，90％～5％(A)；进样体积：1μL；进样器的温度：15℃；
(2)拟定的UPLC-MS/MS质谱条件：电喷雾电离源(ESI)；毛细管电离电压：3kV；离子源温度：120℃；去溶剂气：N2，流速650L/h，去溶剂气温度：350℃；反吹气：N2，流速：50L/h；碰撞气：氩气，流速：0.16mL/min；质谱数据采集及处理软件为MassLynxV4.1工作站，扫描方式为多反应离子监测(MRM)，离子对条件见表1；
表1质谱条件
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Denomination of invention: Chemical component identification and active ingredient screening method of Shenxiong Glucose Injection Effective date of registration: 20231122 Granted publication date: 20171212 Pledgee: Qingdao Qishun Investment Management Co.,Ltd. Pledgor: GUIZHOU JINGFENG INJECTION Co.,Ltd. Registration number: Y2023980066820 |
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