CN106596807B - 荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法，应用心肌细胞选择性地结合荭草花提取物中的活性成分，洗去未结合的其他成分后，使细胞靶点失活，被结合的活性成分从心肌细胞中释放出来，然后采用UHPLC‑Q‑TOF/MS技术进行分析鉴定。本发明的优点是：采用特定的H9c2心肌细胞，能够特异地、有选择性地与荭草花提取物中的活性成分结合，可以满足中药作用多靶点的活性成分的筛选，并且采用UHPLC‑Q‑TOF/MS系统建立了生物样品中可靠的定性分析方法，能够较全面地反映心肌细胞萃取溶液中的药物成分，为快速确定荭草花药效物质基础及创新药物研究提供参考。

Description

荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法

技术领域

本发明涉及药物分析领域，特别涉及一种荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法。

背景技术

生物活性筛选/化学成分在线分析技术是由生命科学与色谱、质谱分离鉴定技术交叉形成的一种综合技术，它是利用药物产生作用一般通过药物与靶点结合的原理，将酶、受体、离子通道、神经介质等在生命活动中起重要生理作用的活性生物大分子、活性细胞膜甚至活性细胞作为靶标，建立中药药效物质基础的生物活性筛选/化学成分在线分析方法。而细胞萃取可以利用细胞的选择性筛选与细胞结合的成分，与细胞结合的成分同效应成分之间具有显著的相关性，不同效应成分作用程度的差别或与靶标具有不同的结合性能，筛选研究中药的活性成分。

荭草为蓼科植物荭草Polygonum orientale L.的干燥全草，为贵州省地产药材，具有行气活血、消积、止痛的功效，在贵州民间和少数民族地区常用于胸痛、胸闷、气短、中风偏瘫(嘴角歪斜)、风湿疼痛等疾病的治疗。现有研究中发现“荭草花”水煮醇沉后的正丁醇萃取部位比全株“荭草”有着更明显的抗心肌缺血作用，为荭草的主要药用有效部位，但其在体内的药效物质基础尚不明确，有待进一步研究筛选，为其创新药物研究及深层次开发利用奠定基础。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种有效的荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法，包括以下步骤：将含有荭草花提取物的缓冲液加入到处于对数生长期的H9c2心肌细胞中培养，去除溶液，清洗；向清洗后的所述H9c2心肌细胞加入pH值为4的磷酸盐缓冲液进行振摇，离心，收集上清液调节pH值为4，上样于Oasis HLB小柱，先用甲酸水清洗小柱，再用甲醇冲洗小柱，收集甲醇洗脱液，浓缩干燥，再加入甲醇溶解，离心分离，取上部的澄清液用于UHPLC-Q-TOF/MS检测分析。UHPLC-Q-TOF/MS称为：超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用仪。

根据前期对荭草花化学成分研究的结果表明，荭草花主要含有酚酸、黄酮等偏酸性化学成分，为了使上述成分能从含有荭草花提取物的缓冲液中游离出来并以分子状态存在于溶液中，故选择pH值为4的磷酸盐缓冲液进行振摇结合，并调整上样液的pH值也为4。

本发明中，将荭草花提取物溶于缓冲液中，在于让荭草花提取物溶液接近细胞内的环境，缓冲液的电解质和pH值等适宜正常细胞的生长发育。

优选的，所述荭草花提取物的制备方法包括以下步骤：取荭草花加水煎煮，所得煎煮液浓缩至1.04～1.05，加入乙醇至溶液的含醇量达65％以上，混匀，静置，过滤，所得滤液浓缩至1.04～1.05，然后加入正丁醇萃取，将正丁醇萃取液浓缩，得萃取物；将所述萃取物用乙醇溶解，上样于聚酰胺层析柱，用80％的乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得荭草花提取物。

优选的，所述煎煮的次数为3次；每次所述煎煮的时间为1小时；每次所述煎煮时，加水的重量为所述荭草花重量的10倍。

优选的，所述含有荭草花提取物的缓冲液是将荭草花提取物溶于pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中，过滤，得浓度为2mg/ml的溶液。

优选的，所述培养的条件为：在37℃、5％CO₂的条件下静置培养1小时；所述清洗采用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液来进行，所述清洗的次数为4次；每次所述清洗的时间为3分钟。

优选的，所述振摇的温度为37℃；所述振摇的时间为30分钟；所述振摇采用恒温水浴振荡器来进行；所述离心的时间为10分钟，离心的转速为10000r/分钟。

优选的，所述对数生长期的H9c2心肌细胞的培养方法包括以下步骤：取H9c2心肌细胞1株移入装有1mL含10％胎牛血清DMEM培养基的离心管中混合，离心，去除上清液，沉淀用3mL含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬后置于37℃、5％CO₂的条件下静置培养，生长2～3天后细胞达到融合时用胰蛋白酶-EDTA的消化液传代，将细胞继续置于37℃、5％CO₂的条件下静置培养；然后取对数生长期的H9c2心肌细胞，以每孔100μL，6～8×10⁵个/m L接种于96孔培养板中，用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基于37℃、5％CO₂培养箱中培养48h后，选择胞浆饱满、生长状态良好的细胞，备用。

优选的，所述DMEM培养基的配制方法为：每袋培养基先加入600m L三蒸水，加入3.7g Na HCO₃，0.11g丙酮酸钠，终浓度为100U/m L的青霉素和链霉素，适量两性霉素，充分搅拌溶解，定容至1L，调节PH值为7.0～7.2，采用0.22μm滤器过滤除菌，分装于4℃冰箱保存备用。

优选的，所述UHPLC-Q-TOF/MS检测分析的色谱条件为：色谱柱：Agilent EclipsePlus C18RRHD(2.1mm×100mm，1.8μm)，流动相：0.1％甲酸水(A)-0.1％甲酸乙腈(B)梯度洗脱，梯度洗脱(0～2min，95％A～79％A，2～5min，79％A～79％A，5～6.5min，79A～60％A，6.5～7.5min，60％A～55％A；7.5～9.5min，55％A～0％A；9.5～10min，0％A～95％A)，柱温40℃，流速0.3mL·min^-1，进样量1μL；质谱条件为：电喷雾离子源，扫描方式为正、负离子扫描，毛细管电压，锥孔电压：80V，离子源温度：110℃，雾化气压力：1.3bar，流速：6.0L/min，温度180℃，准确质量测定采用甲酸钠校正标准液，校正模式选用：Enhanced Quadratic；数据分析：Data Analysis软件、Metabolite ToolsTM。

优选的，所述甲酸水的浓度为0.1％；所述甲醇溶解的甲醇浓度为50％；所述离心分离的转速为15000r/分钟，所述离心分离的时间为10分钟。

本发明中，若无特殊说明，百分比％均指的质量百分比。

本发明具有以下有益效果：采用特定的H9c2心肌细胞，能够特异地、有选择性地与荭草花提取物中的活性成分结合，可以满足中药作用多靶点的活性成分的筛选，多次洗涤药物作用后的心肌细胞，可以排除大量非作用成分的干扰，并且采用UHPLC-Q-TOF/MS系统建立了生物样品中可靠的定性分析方法，能够较全面地反映心肌细胞萃取溶液中的药物成分，为快速确定荭草花药效物质基础及代谢研究提供参考。

附图说明

图1为荭草花提取物样品液的质谱总离子流色谱图；

图2为荭草花提取物在H9c2心肌细胞萃取溶液的质谱总离子流色谱图；

图3为空白H9c2心肌细胞萃取溶液的质谱总离子流色谱图；

图4为图2与图3的差异色谱图；

图5为混合标准品溶液的质谱总离子流色谱图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

1.材料

1.1试药

DMEM高糖培养基(Gibco公司，USA)、胎牛血清(Biochrom公司，GER)、胰蛋白酶(Solarbio公司)、磷酸缓冲盐PBS(A)(PH 7.4，Boster公司，中国武汉)、磷酸缓冲盐PBS(B)(PH4，由PBS(A)与1mol/L的盐酸混合而制)。原儿茶酸、儿茶素、山奈素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈素-3-O-α-L-鼠李糖苷对照品(自制，纯度≥95％)；槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷对照品(大连美仑生物科技有限公司，批号MB6680，纯度≥98％)；槲皮素对照品(中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，批号1166-101216，纯度≥98％)；N-P-香豆酰酪胺、山奈酚对照品(四川省维克奇生物科技有限公司，批号分别为151222、150328，纯度≥98％)；甲酸(美国TEDIA有限公司，色谱纯)；色谱纯甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)；乙腈(德国Merck公司，色谱纯)；其余试剂均为分析纯。荭草花药材采于贵州省鹿关冲植物园，由贵州医科大学药用植物与生药学教研室龙庆德副教授鉴定，标本存于贵州省中药民族药研究开发中心。

1.2仪器

ESI-Q-TOF MS(布鲁克道尔顿电喷雾-四极杆-飞行时间质谱仪，包括MetaboliteToolsTM)；Agilent Technologies 1290 Infinity液相色谱系统(配有1290 Infinity二元泵，高性能自动进样器，二级管阵列检测器，柱温箱)；Allegra 64R低温高速离心机(美国Beckman Coulter公司)；CO₂细胞培养箱(Thermo scientific公司)；超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；恒温水浴振荡器(THZ-82)；Allegra64R低温高速离心机(美国Beckman Coulter公司)；EL204万分之一电子天平(梅特勒托利多仪器上海有限公司)；GILSON移液器(四川吉尔森仪器有限责任公司)；超纯水机(四川沃特尔科技发展有限公司)；MTN-2800D氮吹浓缩装置(天津奥特塞恩斯仪器有限公司)；CQ250A-TS超声波清洗机(上海跃进医用光学器械厂)；Oasis HLB SPE固相萃取小柱(Waters公司，USA)。

1.3细胞株

H9c2心肌细胞株购买于中科院细胞库(中国，上海)。

2实验方法

2.1样品制备

取荭草花提取物溶于PBS(A)中(2mg/ml)，溶液经0.22μM滤膜过滤后，取滤液用于细胞萃取实验及UHPLC-Q-TOF/MS分析。

2.1 DMEM培养基的配制

每袋培养基先加入600mL三蒸水，加入3.7gNaHCO₃，0.11g丙酮酸钠，终浓度为100U/mL的青霉素和链霉素，2.5μg/ml两性霉素，充分搅拌溶解，定容至1L，调节pH值为7.0-7.2，采用0.22μm滤器过滤除菌，分装于4℃冰箱保存备用。

2.3 H9c2心肌细胞的培养

取冻存于液氮中的H9c2细胞一株，置37℃水浴中迅速溶解后移入装有1mL含10％胎牛血清DMEM培养基的离心管中充分混合，经1000r/min，离心5min弃上清液，沉淀用3mL含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬后置于37℃、5％CO₂的条件下静置培养。生长2～3天细胞达到融合时用胰蛋白酶(0.25％)-EDTA(0.53mmol/L)的消化液传代，将细胞继续置于37℃、5％CO₂的条件下静置培养。取对数生长期的H9c2心肌细胞，以每孔100μL，6-8×10⁵个/mL接种于96孔培养板中，用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基于37℃、5％CO₂培养箱中培养48h后，选择胞浆饱满、生长状态良好的细胞用于实验。

2.4心肌细胞萃取实验

2.4.1细胞培养选择处于对数生长期的H9c2心肌细胞，用胰蛋白酶(0.25％)-EDTA(0.53mmol/L)的消化液铺板，接种到6孔板中(共20个孔)，每孔2ml，继续培养48h后，选均匀铺满瓶底、排列整齐、胞浆饱满、生长状态良好均一的细胞供实验用。实验时用经37℃温浴的PBS(A)轻轻冲洗细胞表面去除残留在细胞表面的死细胞及杂质。弃PBS(A)，加入荭草花提取物磷酸缓冲盐液PBS(A)2mg/ml，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养1h后，倒掉药液；用PBS(A)轻轻浸洗4次，每次3min，留下最后一次清洗液(a)作为阴性对照。洗过的细胞，加入PBS(B)置于37℃恒温水浴振荡器中振摇30min后(使细胞膜上受体变性释放化合物)，将上清液(1)收集备用。再向6孔板中加入PBS(A)，反复冻融3次破碎细胞，经10000r/min，离心10min后，取上清液(2)调PH值至4，合并上清液(1)、(2)得细胞破碎夜(b)。不加药物，以PBS(A)代替荭草花提取物缓冲液，同法作空白对照实验，制得空白对照溶液(c)。分别将溶液(a)、(b)、(c)调PH值至4后备用。

2.4.2生物样品处理分别将溶液(a)、(b)、(c)调pH值至4后，过Oasis HLB小柱，使样品保留在小柱上。随后用约5ml0.1％甲酸水清洗小柱，除去样品中的盐溶液；用1.5ml甲醇冲洗小柱，收集洗脱液，用氮吹仪低温吹干后，加50％甲醇定容至500ul，经15000r/min,离心10min后，分别取上清液用于UHPLC-Q-TOF/MS检测分析。

2.5标准溶液的制备

精密称取对照品原儿茶酸、儿茶素、山奈素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈素-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素、N-P-香豆酰酪胺、山奈酚对照品适量至10ml容量瓶中，用甲醇定容，得原儿茶酸(1.160g·L^-1)、儿茶素(1.010g·L^-1)、山奈素-3-O-β-D-葡萄糖苷(1.100g·L^-1)、山奈素-3-O-α-L-鼠李糖苷(0.9801g·L^-1)、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷(1.101g·L^-1)、槲皮素(1.221g·L^-1)、N-P-香豆酰酪胺(1.031g·L^-1)、山奈酚(1.109g·L^-1)的储备液。分别精密量取上述八种对照品储备液30uL混合，得混合系列标准溶液。置冰箱(-20℃)保存，备用。

2.6分析条件

2.6.1色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD(2.1mm×100mm，1.8μm)，流动相：0.1％甲酸水(A)-0.1％甲酸乙腈(B)梯度洗脱，梯度洗脱(0～2min,95％A～79％A,2～5min,79％A～79％A,5～6.5min,79A～60％A,6.5～7.5min,60％A～55％A；7.5～9.5min,55％A～0％A；9.5～10min,0％A～95％A)，柱温40℃，流速0.3mL·min^-1，进样量1μL。

2.6.2质谱条件

电喷雾离子源，扫描方式为正、负离子扫描(ESI+、ESI-，m/z 50～1000)，毛细管电压(正离子模式4kV,负离子模式3.5kV)，锥孔电压：80V，离子源温度：110℃，雾化气(N2)压力：1.3bar，流速：6.0L/min，温度180℃，准确质量测定采用甲酸钠校正标准液，校正模式选用：Enhanced Quadratic.数据分析：Data Analysis软件、Metabolite ToolsTM(包括Metabolite Predict及Metabolite Detect)软件、质量亏损过滤(MDF)。

3结果

3.1荭草花提取物中化学成分鉴定

按“2.6”项方法分利用UHPLC-Q-TOF/MS对其中化学成分进行检测分析，运用Metabolite Detect软件将空白心肌细胞萃取溶液色谱图从荭草花提取物在H9c2心肌细胞萃取溶液色谱图中扣除，得到差异图谱(图4)。通过比较荭草花取物样品液的质谱总离子流图见图谱(图1)、荭草花提取物在h9c2心肌细胞萃取溶液的质谱总离子流图见图谱(图2)、空白H9c2心肌细胞萃取溶液的质谱总离子流图见图谱(图3)、混合标准品溶液的质谱总离子流图见图谱(图5)和差异色谱图(图4)发现，除去心肌细胞萃取溶液中的固有成分，荭草花提取物在h9c2心肌细胞萃取溶液中出现17个移行成分。通过与混合标准品溶液的保留时间(tR)和质谱数据比较，确定了8个色谱峰所表征的化学成分为原型成分，分别为1号为原儿茶酸、2号为儿茶素、8号为山奈素-3-O-β-D-葡萄糖苷、9号为槲皮素3-O-α-L-鼠李糖苷、11号为山奈素-3-O-α-L-鼠李糖苷、12号为N-P-香豆酰酪胺、14号为槲皮素、16号为山奈酚；另外通过参考文献和分析质谱信息，推断推测峰3为槲皮素-3-O-(2″-O-α-L-鼠李糖基)-β-D-葡萄糖醛酸苷；峰4为山柰酚-3-O-(2″-O-α-L-鼠李糖基)-β-D-葡萄糖醛酸苷；峰13为N-反式-对羟基苯乙基阿魏酰胺。相关数据见表1。

表1 H9c2心肌细胞萃取液中化学成分分析

细胞色谱法的基本原理是根据药物与靶点(受体、通道、酶等)结合产生的效应来进行研究的，通过模拟生理或病理状态下药物在体内与受体、靶点的选择性结合过程，旨在直接取用效应器官的细胞对效应成分进行特异性结合，由于心肌细胞上有多种受体，能够特异地、有选择性地与活性成分结合，可以满足中药作用多靶点的活性成分的筛选，多次洗涤药物作用后的心肌细胞，可以排除大量非作用成分的干扰，并且采用UHPLC-Q-TOF/MS系统建立了生物样品中可靠的定性分析方法，能够较全面地反映心肌细胞萃取溶液中的药物成分，为快速确定荭草花药效物质基础及代谢研究提供参考。

为了获得分离度好、灵敏性高以及信息量丰富的色谱图，对色谱条件进行了优化，包括了流动相的组成、进样体积、运行时间的选择。并且实验中分别采用正、负离子扫描方式对混合标准品溶液及荭草花提取物样品液进行全扫描，结果发现在负离子模式下荭草花提取物样品液中的化合物响应相对较高，各色谱峰之间都实现了较好的分离，因此实验选择了负离子模式为测试模式。而建立UHPLC-Q-TOF/MS方法对细胞萃取液进行分析，具有离子传输效率高、传输离子质量范围宽、灵敏度高、错误率低、重现性高等优点，为其深入研究提供有利依据。

心肌缺血，是指心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态。本次研究采用溶有荭草花提取物的培养基培养心肌缺血细胞，具有抗心肌缺血作用的成分选择性地与心肌细胞结合，利用液相质谱的方法检测荭草花提取物，空白细胞液、第四次PBS缓冲液的洗脱液及加药细胞液中化学成分，通过四者的比较，得出与心肌细胞结合的成分，最终通过质谱离子峰及碎片离子初步检测出荭草花提取物中可与心肌细胞结合的17个成分，采用对照品对照，确定8个色谱峰所表征的化学成分为，依次为原儿茶酸、儿茶素、山奈素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、山奈素-3-O-α-L-鼠李糖苷、N-P-香豆酰酪胺、槲皮素、山奈酚。而山奈素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、山奈素-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素、山奈酚为黄酮类成分，据文献报道黄酮类化合物广泛存在于食用或药用植物中，它们通常具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗动脉粥样硬化、抗过敏、抗突变或抑制血小板凝聚等多种生物学活性，并且研究发现黄酮类化合物有明显的抗心肌缺血作用。因此上述成分有可能为荭草花提取物中具有心肌活性的成分，可能是其发挥药理作用的相关效应物质，并且通过UHPLC-Q-TOF/MS质谱分析、代谢物预测和分析软件的原型药物和代谢产物关联分析，进一步为推测明确荭草花与抗心肌缺血作用相关的作用物质和创新药物研制提供依据。

以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：将含有荭草花提取物的缓冲液加入到处于对数生长期的H9c2心肌细胞中培养，去除溶液，清洗；向清洗后的所述H9c2心肌细胞加入pH值为4的磷酸盐缓冲液进行振摇，离心，收集上清液调节pH值为4，上样于Oasis HLB小柱，先用甲酸水清洗小柱，再用甲醇冲洗小柱，收集甲醇洗脱液，浓缩干燥，再加入甲醇溶解，离心分离，取上部的澄清液用于UHPLC-Q-TOF/MS检测分析；

所述荭草花提取物的制备方法包括以下步骤：取荭草花加水煎煮，所得煎煮液浓缩至1.04～1.05，加入乙醇至溶液的含醇量达65％以上，混匀，静置，过滤，所得滤液浓缩至1.04～1.05，然后加入正丁醇萃取，将正丁醇萃取液浓缩，得萃取物；将所述萃取物用乙醇溶解，上样于聚酰胺层析柱，用80％的乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得荭草花提取物。

2.根据权利要求1所述的荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法，其特征在于：所述煎煮的次数为3次；每次所述煎煮的时间为1小时；每次所述煎煮时，加水的重量为所述荭草花重量的10倍。

3.根据权利要求1所述的荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法，其特征在于：所述含有荭草花提取物的缓冲液是将荭草花提取物溶于pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中，过滤，得浓度为2mg/ml的溶液。

4.根据权利要求1所述的荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法，其特征在于：所述培养的条件为：在37℃、5％CO₂的条件下静置培养1小时；所述清洗采用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液来进行，所述清洗的次数为4次；每次所述清洗的时间为3分钟。

5.根据权利要求1所述的荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法，其特征在于：所述振摇的温度为37℃；所述振摇的时间为30分钟；所述振摇采用恒温水浴振荡器来进行；所述离心的时间为10分钟，离心的转速为10000r/分钟。

6.根据权利要求1所述的荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法，其特征在于：所述对数生长期的H9c2心肌细胞的培养方法包括以下步骤：取H9c2心肌细胞1株移入装有1mL含10％胎牛血清DMEM培养基的离心管中混合，离心，去除上清液，沉淀用3mL含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬后置于37℃、5％CO₂的条件下静置培养，生长2～3天后细胞达到融合时用胰蛋白酶-EDTA的消化液传代，将细胞继续置于37℃、5％CO₂的条件下静置培养；然后取对数生长期的H9c2心肌细胞，以每孔100μL，6～8×10⁵个/m L接种于96孔培养板中，用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基于37℃、5％CO₂培养箱中培养48h后，选择胞浆饱满、生长状态良好的细胞，备用。

7.根据权利要求6所述的荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法，其特征在于：所述DMEM培养基的配制方法为：每袋培养基先加入600m L三蒸水，加入3.7g Na HCO₃，0.11g丙酮酸钠，终浓度为100U/m L的青霉素和链霉素，适量两性霉素，充分搅拌溶解，定容至1L，调节PH值为7.0～7.2，采用0.22μm滤器过滤除菌，分装于4℃冰箱保存备用。

8.根据权利要求1所述的荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法，其特征在于：所述UHPLC-Q-TOF/MS检测分析的色谱条件为：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD，流动相：0.1％甲酸水-0.1％甲酸乙腈梯度洗脱，梯度洗脱，柱温40℃，流速0.3mL·min^-1，进样量1μL；质谱条件为：电喷雾离子源，扫描方式为正、负离子扫描，毛细管电压，锥孔电压：80V，离子源温度：110℃，雾化气压力：1.3bar，流速：6.0L/min，温度180℃，准确质量测定采用甲酸钠校正标准液，校正模式选用：Enhanced Quadratic；数据分析：Data Analysis软件、Metabolite ToolsTM。

9.根据权利要求1所述的荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法，其特征在于：所述甲酸水的浓度为0.1％；所述甲醇溶解的甲醇浓度为50％；所述离心分离的转速为15000r/分钟，所述离心分离的时间为10分钟。