CN108732259A - 荭草花提取物中入血化学成分的检测方法 - Google Patents

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CN108732259A CN201810128827.9A CN201810128827A CN108732259A CN 108732259 A CN108732259 A CN 108732259A CN 201810128827 A CN201810128827 A CN 201810128827A CN 108732259 A CN108732259 A CN 108732259A
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Abstract

本发明公开了荭草花提取物中入血化学成分的检测方法，将荭草花提取物口服给予健康SD大鼠，连续灌胃给药3天，2次/d，于末次给药后30min股动脉采血，制备血清样品，通过UHPLC‑Q‑TOF MS检测分析，检测出至少12个入血成分。本发明采用血清药物化学研究方法，结合现代液质联用高分辨质谱UHPLC‑Q‑TOF‑MS技术对口服荭草花提取物后血清中的成分进行分析鉴定，能够全面地反映荭草花的体内直接作用物质。本发明操作简便，快速准确，为确定荭草花在体内发挥作用的有效组分群及药用开发提供了参考。

Description

荭草花提取物中入血化学成分的检测方法
技术领域
本发明涉及药物分析领域，特别涉及一种荭草花提取物中入血化学成分的检测方法。
技术背景
中药药效物质基础和作用机理的阐明是实现中药现代化的关键所在。众所周知，任何药效的产生都是物质基础与机体相互作用的结果，因而单纯从孤立的体外进行中药药效物质研究显然存在明显不足，研究者开始逐渐认识到从体内环节研究中药药效物质的巨大优势。现代研究证明，药物口服后透过胃肠道上皮细胞进入血流，随体循环系统分布到各组织器官或靶点，并在达到一定的血药浓度时才能发挥疗效。基于此，药学学者提出“只有吸收入血的成分才可能是中药的药效成分”，因此，研究分析中药口服后吸收入血的成分及其代谢转化形式对其体内至关重要。
荭草花为蓼科植物荭草Polygonum orientale L.的花穗，以其全草收载于2003版《贵州省中药、民族药质量标准》中，为贵州省民间及少数民族常用药物，用于胸痛，胸闷，气短，中风偏瘫(嘴角歪斜)，风湿疼痛等疾病的治疗。现代研究对荭草各部位药理筛选实验中发现，荭草花有比其“全草”更为明显的抗心肌缺血作用，为荭草的主要药用有效部位。药效学实验中发现荭草花经水煮醇沉、正丁醇萃取部位，能够可抑制心电图S-T段、T波的抬高，明显降低麻醉比格犬冠脉结扎所致心肌缺血的程度和损伤范围，抑制冠脉结扎犬血清中CK、LDH的释放，为其活性部位。在此基础之上，进一步进行了荭草花提取物药动学研究，结果表明其吸收进入体内后，血浆中检测到少量原型成分(原儿茶酸、山奈素-葡萄糖苷、槲皮苷和山奈素-鼠李糖苷)。研究表明，原儿茶酸、山奈素-鼠李糖苷的绝对生物利用度很低，分别为2.5％、0.30％，但其抗心肌缺血药效确实明显，原因可能为其发挥药效的形式除了原型成分，代谢产物也可能为活性成分。因此开展荭草花提取物入血化学成分分析鉴定，明确其吸收进入体内的成分及其存在形式，分析代谢产物结构类型，探讨其体内直接作用物质，可为其创新药物研究及深层次开发利用奠定基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对背景技术中提到的问题，提供一种有效的荭草花抗心肌缺血活性成分的筛选方法。本发明中，若无特殊说明，百分比％均指的质量百分比。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明是一种荭草花提取物中入血化学成分的检测方法，包括以下步骤：将荭草花提取物口服给予健康SD大鼠，连续灌胃给药3天，2次/d，于末次给药后30min股动脉采血，制备血清样品，用于UHPLC-Q-TOF MS检测分析。
根据前期对荭草花化学成分及制备工艺研究结果，荭草花提取物所优化的制备方法如下，取荭草花药材1kg，水煮3次(10倍量，1h/次)，过滤，合并滤液，浓缩至1g生药/mL。加入乙醇使溶液含醇量达65％，混匀，静置12h，抽滤,浓缩至1g生药/mL。水饱和正丁醇(1/2倍)萃取4次，合并正丁醇液，回收正丁醇，残留物加80％乙醇溶解，上聚酰胺柱(500g，Ф8cm，径高比1：6，吸附流速：0.5BV·h-1，BV–湿柱体积＝干树脂重量的5倍体积)，用80％乙醇洗脱(洗脱流速：1.5BV·h-1)，收集流穿液和洗脱液，回收乙醇，残留物水浴挥干。取干燥提取物0.09g用50％甲醇水100mL溶解，15000rpm·mL-1离心5min，备用。
优选的，荭草花提取物的动物口服给药方法包括以下步骤：取健康SD大鼠，雌雄参半，体重(250±10)g，正常饲养一周，饲养于代谢笼中给药前禁食12h(不禁水)，口服给予荭草花提取物每次86g·Kg-1(生药量)，连续灌胃给药3天，2次/d。于末次给药后30min股动脉采血，取全血置于37℃恒温水浴至上层有黄色液体析出，取出后于台式离心机5000r·min-1(2683g)离心10min，取上层血清，置于-20℃保存，备用。
优选的，前述的血清样品制备方法包括以下步骤：取大鼠血清1mL，置于10mL进口塑料离心管中，加入4mL甲醇，涡混震荡2min后，超声5min，15000rpm(20627g)离心5min，取上清液于37℃氮气吹干，加入1mL甲醇于吹干的样品中，按上述处理方法三次沉淀蛋白，加入200μL50％甲醇水溶液溶解残留物。
优选的，所述UHPLC-Q-TOF-MS检测分析的色谱条件为：色谱柱：Agilent EclipsePlus C18RRHD(2.1mm×100mm，1.8μm)，柱温：45℃，流速0.3mL·min-1，流动相：0.1％甲酸水-0.1％甲酸乙腈梯度洗脱，进样体积为1μL。质谱条件为：电喷雾离子源，扫描方式为正、负离子扫描(ESI+、ESI-，m/z 50～1000)，毛细管电压：ESI-(3.5kV)、ESI+(4kV)，离子源温度:200℃，雾化气(N2)压力：1.2bar,干燥气温度：200℃，气体体积流量：6L/min，准确质量测定采用甲酸钠校正标准液，校正模式选用：Enhanced Quadratic.数据分析：DataAnalysis软件、Metabolite ToolsTM(包括Metabolite Predict及Metabolite Detect)软件、质量亏损过滤(MDF)。
采用上述技术方案，从荭草花含药血清样品中发现了12个入血成分，包括3个原型入血成分：N-p-香豆酰酪胺、N-反式-对羟基苯乙基阿魏酰胺、山奈素-3-O-α-L-鼠李糖苷，以及9个代谢产物，其代谢形式包括葡萄糖醛酸化代谢产物、羰基化代谢产物、双羟基化代谢产物、硫酸化代谢产物等。
本发明具有以下有益效果：采用血清药物化学研究方法，结合现代UHPLC-Q-TOF-MS技术对口服荭草花提取物后血清中的成分进行分析鉴定，具有操作简便，实验条件易于控制、快速准确，重现性好的优势和特点。将液质联用高分辨质谱UHPLC-Q-TOF-MS技术应用于药物体内成分研究，既利用了UPLC的超高在线分离能力、超高分析速度、超高分析灵敏度，又充分利用了高分辨质谱对复杂样品分析的高灵敏度、高选择性、高容量的特性，能够同时对复杂生物样品进行多种成分的快速分析，所得实验结果能够全面地反映荭草花的体内直接作用物质，通过口服给予大鼠荭草花有效组分，在其血清样品中检测到大量代谢产物，原型成分入血较少，提示荭草花有效组分吸收进入体内发生了剧烈的生物转化过程，因此其在体内发挥药效的形式除了原型成分外，其代谢产物也可能是其活性成分，为其药效物质基础及创新药物研究开发提供参考。
附图说明
图1为大鼠口服荭草花提取物后含药血清样品的ESI-总离子流色谱图；
图2为大鼠空白血清样品的ESI-总离子流色谱图；
图3为含药血清与空白血清ESI-差异色谱图；
图4为大鼠口服荭草花提取物后含药血清样品的ESI+总离子流色谱图；
图5为大鼠空白血清样品的ESI+总离子流色谱图；
图6为含药血清与空白血清ESI+差异色谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1：
1材料
1.1仪器与试剂
UHPLC-ESI-Q-TOF MS(Agilent Technologies 1290Infinity液相色谱系统,布鲁克道尔顿电喷雾-四极杆-飞行时间质谱仪)；Allegra 64R低温高速离心机(美国BeckmanCoulter公司)；MTN-2800D氮吹浓缩装置(天津奥特塞恩斯仪器有限公司)；代谢笼(由意大利Tecniplast公司进口)；10mM甲酸钠校正液[1mL 1M NaOH+99mL甲酸:异丙醇:水(0.002:1:1)]；水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，批号20151011)；乙腈(色谱纯，德国Merck公司)、甲酸(色谱纯，德国Merck公司)、纯净水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)、其他试剂均为分析纯。
1.2试药
荭草花药材(购自贵州贵阳鹿冲关贵州省药用植物园种植基地，由贵州医科大学药学院生药学教研室龙庆德副教授鉴定)；荭草花有效组分(自制，批号20150915)；山奈酚对照品(四川维克奇生物科技有限公司,批号150328)；槲皮素对照品(四川维克奇生物科技有限公司,批号151222)；原儿茶酸对照品(四川维克奇生物科技有限公司,批号150710)；槲皮苷对照品(四川维克奇生物科技有限公司,批号150702)；没食子酸对照品(中药固体制剂制造技术国家工程研究中心,批号M32-110518)；山奈素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照品、山奈素-3-O-α-L-鼠李糖苷对照品、儿茶素对照品(自制)。
1.3动物
健康大鼠(SD)，雌雄各半，250±10g,，购买自长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号SCXK(湘)2014-0011。动物饲养于动物房中，保持室温22±2℃，相对湿度保持室温50-60％，饲养一周以适应环境。
2方法
2.1荭草花提取物制备
取荭草花药材1kg，水煮3次(10倍量，1h/次)，过滤，合并滤液，浓缩至1g生药/mL。加入乙醇使溶液含醇量达65％，混匀，静置12h，抽滤,浓缩至1g生药/mL。水饱和正丁醇(1/2倍)萃取4次，合并正丁醇液，回收正丁醇，残留物加80％乙醇溶解，上聚酰胺柱(500g，Ф8cm，径高比1：6，吸附流速：0.5BV·h-1，BV–湿柱体积＝干树脂重量的5倍体积)，用80％乙醇洗脱(洗脱流速：1.5BV·h-1)，收集流穿液和洗脱液，回收乙醇，残留物水浴挥干。取干燥提取物0.09g用50％甲醇水100mL溶解，15000rpm·mL-1离心5min，备用。
2.2色谱条件
色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18RRHD(2.1mm×100mm，1.8μm)，柱温：45℃，流动相：0.1％甲酸水(A)-0.1％甲酸乙腈(B)梯度洗脱，洗脱表见表1。进样体积为1μL。
表1洗脱梯度表
t(min) 流速(mL·min-1) A相(％) B相(％)
0 0.3 95 5
4 0.3 80 45
10 0.3 80 95
15 0.3 55 100
20 0.3 5 95
21 0.3 100 0
22 0.3 95 5
2.3质谱条件
电喷雾离子源，扫描方式为正、负离子扫描(ESI+、ESI-，m/z 50～1000)，毛细管电压：ESI-(3.5kV)、ESI+(4kV)，离子源温度:200℃，雾化气(N2)压力：1.2bar,干燥气温度：200℃，气体体积流量：6L/min，准确质量测定采用甲酸钠校正标准液，校正模式选用：EnhancedQuadratic.数据分析：Data Analysis软件、Metabolite ToolsTM(包括Metabolite Predict及Metabolite Detect)软件、质量亏损过滤(MDF)。
2.4收集血清样品
取健康SD大鼠，雌雄参半，体重(250±10)g，正常饲养一周。实验分为2组，给药组和对照组(6只/组)，分别饲养于代谢笼中。给药组实验前禁食12h(不禁水)，口服给予荭草花提取物每次86g·Kg-1(生药量)，连续灌胃给药3天，2次/d。空白组给予灌胃同等体积的1％CMC-Na水溶液。分别于末次给药后30min股动脉采血，取全血置于37℃恒温水浴至上层有黄色液体析出，取出后于台式离心机5000r·min-1(2683g)离心10min，取上层血清。置于-20℃保存，备用。
2.5血清样品处理方法
取大鼠血清1mL，置于10mL进口塑料离心管中，加入4mL甲醇，涡混震荡2min后，超声5min，15000rpm(20627g)离心5min，取上清液于37℃氮气吹干，加入1mL甲醇于吹干的样品中，按上述处理方法三次沉淀蛋白，加入200μL50％甲醇水溶液溶解残留物，UHPLC-Q-TOFMS进样检测分析。
3结果
从荭草花含药血清样品中发现了12个入血成分以及9个代谢产物，结果见表2。
3.1荭草花提取物在大鼠血清中原型入血成分
化合物M14 TR为9.1min时，负模式下出现准分子离子峰[M-H]-m/z431.099C21H19O10(err-1.4ppm)，与山柰素-3-0-α-L-鼠李糖苷对照品一致，故推测TR为9.1min的化合物M8为山柰素-3-0-α-L-鼠李糖苷。
化合物M30 TR为10.2min时，正模式下，MS质谱出现准分子离子峰[M+H]+m/z284.1279C17H18NO3(err 0.7ppm)，碎片离子峰[M+H]+m/z C9H7O2147.0441(err-0.4ppm)。二级质谱分子离子峰[M+H]+m/z 284.1275C17H18NO3(err 2.3ppm)，碎片离子峰[M+H-C8H11NO]+m/z147.044C9H7O2(err-3.5ppm)。可见碎片离子峰[M+H-C8H11NO]+m/z147是由准分子离子峰[M+H]+m/z 284丢失137Da(-C8H11NO),参照相关文献[8]并结合质谱数据，推测TR为10.2min的化合物M30为N-p-香豆酰酪胺。
化合物M8 TR为11.8min时，负模式下出现准分子离子峰[M-H]-m/z312.1228C18H18NO4(err 4.1ppm)，参照相关文献[8]并结合质谱数据，推测TR为11.8min时的化合物M8为N-反式-对羟基苯乙基阿魏酰胺。
3.1.2荭草花提取物在大鼠血清中代谢产物
化合物M1 TR为2.2min时，负模式下出现准分子离子峰[M-H]-m/z343.0659C14H15O10(err-3.0ppm),故推测TR为2.2min的化合物M1为槲皮素O-C2键开环裂解、葡萄糖醛酸化代谢产物。
化合物M2 TR为3.2min时，负模式下出现准分子离子峰[M-H]-m/z304.0139C10H10NO8S(err-2.2ppm)，显示碎片离子峰[M-H-O2-SO]-m/z 224.0554C10H10NO5(err 4.9ppm)、[M-H-O2-C3H5NO2S]-m/z 153.0186C7H5O4(err 4.7ppm)。由离子碎片信息可见，准分子离子峰[M-H]-m/z 304丢失80Da(-O2-SO)形成碎片离子峰[M-H-SO3]-m/z 224，进而丢失71Da(-O2-C3H5NO2S)形成碎片离子峰[M-H-O2-C3H5NO2S]-m/z 153(原儿茶酸),故推测TR为3.2min的化合物M2为化合物M12(原儿茶酸)半胱氨酸结合、双羟基化代谢产物。
化合物M3 TR为3.5min时，负模式下出现准分子离子峰[M-H]-m/z246.9913C8H7O7S(err 1.8ppm)，显示碎片离子峰[M-H-OH-SO3]-m/z 167.0348C8H7O4(err 1.2ppm)。由离子碎片信息可见，准分子离子峰[M-H]-m/z 246.99丢失80Da(-SO3),故推测TR为3.5min的化合物M3为化合物M15槲皮素的O-C2键裂解开环、硫酸化代谢产物。
化合物M4 TR为5.3min时，负模式下出现准分子离子峰[M-H]-m/z458.1462C23H24NO9(err-1.1ppm)，由此推测TR为5.3min时的化合物M4为化合物M30(N-p-香豆酰酪胺)葡萄糖醛酸化代谢产物。
化合物M5 TR为5.7min时,在MS质谱图中,正模式下出现准分子离子峰[M+H]+m/z460.1611C23H26NO9(err-2.0ppm)，显示[M+H]+m/z 284.1278C17H18NO3(err 1.3ppm)、m/z147.0439C17H18NO3(1.0ppm)主要碎片离子峰。进一步作MS2质谱分析，正模式下出现准分子离子峰[M+H]+m/z 460.1603C23H26NO9(-0.2ppm)，碎片离子峰[M+H-C6H8O6]+m/z284.1269C17H18NO3(4.2ppm)、[M+H-C6H8O6-C8H11ON]+m/z 147.0441C17H18NO3(err-0.5ppm)。根据以上碎片离子峰信息，可推断准化合物M5失去176Da(-C6H8O6)，形成[M+H-C6H8O6]+m/z284.1278C17H18NO3(化合物M30)，由此可见化合物M5为萄糖醛酸代谢产物；[M+H-C8H11ON]+m/z 147.0439C9H7O2为化合物M30(N-p-香豆酰酪胺)失去137Da(-C8H11ON)形成的特征碎片离子峰。综上，可推测TR为5.7min的化合物M5为化合物M30(N-p-香豆酰酪胺)葡萄糖醛酸化代谢产物。
化合物M6 TR为5.9min时，MS质谱图显示准分子离子峰[M+H]+m/z490.1714C24H28NO10(err-1.3ppm)，[M+H]+m/z 314.1384C18H20NO4(err 0.8ppm)的碎片离子峰。从MS2质谱图中，可见准分子离子峰为[M+H]+m/z 490.173C24H28NO10(err-4.5ppm)，先失去176Da(-C6H8O6)形成[M+H-C6H8O6]+m/z314.1373C18H20NO4(err 4.5ppm)，提示化合物M6为葡萄糖醛酸代谢产物；进而丢失137Da(-C8H11ON)形成碎片离子峰[M+H-C8H11ON]+m/z177.0536C10H9O3(err 6.0ppm)，为化合物M8(N-反式-对羟基苯乙基阿魏酰胺)的特征片段。根据以上碎片离子峰信息，可推测TR为5.9min的化合物M6为化合物M8(N-反式-对羟基苯乙基阿魏酰胺)葡萄糖醛酸化代谢产物。
化合物M7 TR为7.1min时，MS质谱图出现准分子离子峰[M+H]+m/z463.0871C21H19O12(err-0.0ppm)，显示[M+H]+m/z 287.0565C15H11O6(err-5.0ppm)离子碎片。从MS2质谱图中，可见准分子离子峰为[M+H]+m/z 463.0853C21H19O12(err 3.8ppm)，失去176Da(-C6H8O6)形成[M+H-C6H8O6]+m/z 287.0545C15H11O6(err 1.6ppm,山奈酚)，故推测TR为7.1min的化合物M7为山奈酚葡萄糖醛酸化代谢产物。
化合物M9 TR为13.1min时，负模式下出现准分子离子峰[M-H]-m/z329.0297C16H9O8(err 1.7ppm)，故推测TR为13.1min的化合物M9为化合物M15(槲皮素)羰基化代谢产物。
化合物M22 TR为6.2min时，正模式下出现准分子离子峰[M+H]+m/z490.1693C24H28NO10(err 3.0ppm)，故推测TR为6.2min的化合物M22为化合物M8(N-反式-对羟基苯乙基阿魏酰胺)葡萄糖醛酸化代谢产物。
表2UHPLC-ESI-Q-TOF MS检测大鼠口服荭草花提取物后在血清中的化学成分
本发明建立分析荭草花提取物大鼠血清UHPLC-ESI-Q-TOF MS检测方法，其具有离子传输效率高、传输离子质量范围宽、灵敏度高、错误率低、重现性高等优点，并结合超高压液相(UHPLC)的高灵敏度和基线稳定性为研究带来了优良的分析能力。实验中22min可完成对复杂生物样品的检测，此法可对检测样品色谱信息进行全采集，且各色谱峰分离较好，为后期分析处理海量的代谢数据奠定基础。
生物样品的检测分析中，其处理方案尤为重要。因此，本发明在生物样品进行分析处理中，对生物样品处理方案进行优化，比较甲醇沉淀蛋白方法、过SPE固相萃取小柱、液液萃取等生物样品处理方法，确定血清样品选择利用甲醇三次沉淀处理，既保留生物样品中最优代谢信息峰，又对检测分析仪器进行了保护。
从荭草花含药血清样品中发现了12个入血成分，包括N-p-香豆酰酪胺、N-反式-对羟基苯乙基阿魏酰胺、山奈素-3-O-α-L-鼠李糖苷原型成分，代谢形式为其葡萄糖醛酸化代谢产物。此外，还存在槲皮素O-C2键开环裂解葡萄糖醛酸化、羰基化代谢产物；原儿茶酸半胱氨酸结合、双羟基化代谢产物；山奈酚葡萄糖醛酸化代谢产物。所得实验结果能够全面地反映荭草花的体内直接作用物质，通过口服给予大鼠荭草花有效组分，在其血清样品中检测到大量代谢产物，原型成分入血较少，提示荭草花有效组分吸收进入体内发生了剧烈的生物转化过程，因此其在体内发挥药效的形式除了原型成分外，其代谢产物也可能是其活性成分，为其药效物质基础及创新药物研究开发提供参考。
以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。

Claims (5)

1.根据权利要求1所述的荭草花提取物中入血化学成分的检测方法，其特征在于：将荭草花提取物口服给予健康SD大鼠，连续灌胃给药3天，2次/d，于末次给药后30min股动脉采血，制备血清样品，通过UHPLC-Q-TOF MS检测分析，检测出至少12个入血成分。
2.根据权利要求1所述的荭草花提取物中入血化学成分的检测方法，其特征在于：所述将荭草花提取物口服给予健康SD大鼠包括以下步骤：取健康SD大鼠，雌雄参半，体重240-260g，正常饲养一周；给药前禁食不禁水12h，口服给予荭草花提取物，连续灌胃给药3天，2次/d；于末次给药后30min股动脉采血，取全血置于37℃恒温水浴至上层有黄色液体析出，取出后于台式离心机离心至少10min，取上层血清，置于-20℃保存，备用。
3.根据权利要求1所述的荭草花提取物中入血化学成分的检测方法，其特征在于：所述血清样品制备方法包括以下步骤：取大鼠血清1mL，置于10mL进口塑料离心管中，加入4mL甲醇，涡混震荡2min后，超声5min，离心5min，取上清液于37℃氮气吹干，加入1mL甲醇于吹干的样品中，按上述处理方法三次沉淀蛋白，加入200μL 50％甲醇水溶液溶解残留物即得。
4.根据权利要求1所述的荭草花提取物中入血化学成分的检测方法，其特征在于：所述UHPLC-Q-TOF-MS检测分析的色谱条件为：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18RRHD(2.1mm×100mm，1.8μm)，柱温：45℃，流速0.3mL·min-1，流动相：0.1％甲酸水-0.1％甲酸乙腈梯度洗脱，进样体积为1μL；质谱条件为：电喷雾离子源，扫描方式为正、负离子扫描(ESI+、ESI-，m/z 50～1000)，毛细管电压：ESI-(3.5kV)、ESI+(4kV)，离子源温度:200℃，雾化气(N2)压力：1.2bar,干燥气温度：200℃，气体体积流量：6L/min，准确质量测定采用甲酸钠校正标准液。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的荭草花提取物中入血化学成分的检测方法，其特征在于：检测出的12个入血成分包括：3个原型入血成分：N-p-香豆酰酪胺、N-反式-对羟基苯乙基阿魏酰胺、山奈素-3-O-α-L-鼠李糖苷，以及9个代谢产物，其代谢形式包括葡萄糖醛酸化代谢产物、羰基化代谢产物、双羟基化代谢产物、硫酸化代谢产物。
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