CN109738552A - 一种筛选山茱萸降糖活性成分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种筛选山茱萸降糖活性成分的方法，包括如下步骤：用色谱‑质谱技术建立山茱萸水提物的成分分析方法，通过数据分析鉴定山茱萸中活性成分；将活性成分的化学结构和DrugBank数据库进行相似性对比，相似性打分卡值设定为0.8，得到成分靶标；检索疾病/证候靶标数据库，得到糖尿病的候选疾病靶标；采用网络药理学技术对山茱萸的化学成分进行相关的降糖作用靶标预测，构建山茱萸成分‑降糖靶点‑作用通路网络，预测其潜在的降糖活性成分及分子作用机制；通过细胞实验对潜在的活性成分进行活性评价和实验验证，从而明确山茱萸中真实有效的降糖活性成分；本发明提高了山茱萸活性成分筛选的效率，降低药物活性成分筛选成本。
Description
技术领域
本发明属于一种中药活性成分研究领域，具体是涉及到一种筛选山茱萸降糖活性成分的方法。
背景技术
我国糖尿病患者人数约占全球糖尿病患者总数的三分之一，糖尿病及其并发症已经成为继心脑血管疾病、癌症之后威胁人类生命健康的第三大杀手，由于其发病机理复杂，目前仍未找到根治糖尿病及其并发症的方法。中药治疗糖尿病在我国具有几千年的悠久历史，有一定临床应用基础，具有资源丰富，取材方便，毒性较小等优点，且现代医学理论指导下证实了中药治疗糖尿病及其并发症有着巨大潜力，因此从传统中药中研究开发新的治疗糖尿病及并发症的药物成为一个研究热点。
中药山茱萸为山茱萸科山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc.)属植物的去核干燥果肉，主产于陕西、山西、河南等省，山茱萸始载于《神农本草经》，是我国常见的药食两用型药材。山茱萸果肉味酸、湿，微温，归肝肾经，有补益肝肾、涩精固脱的功效，主治眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳凄遗精、遗尿尿频、崩漏带下、大汗虚脱、内热消渴，明代李时珍的《本草纲目》集历代医家应用山茱萸的经验，把山茱萸列为补血固精、补益肝肾、调气、补虚、明目、强身之药，属中医临床常用的传统抗衰老、治消渴(糖尿病)良药之一。山茱萸也是一些经典中药名方的主药，如六味地黄丸、金匮肾气丸、左归丸、十全大补丸等，因其较高的应用价值自古就受到关注。
山茱萸主要化学成分有环烯醚萜类、鞣质类、黄酮类、三萜类、苯丙素类等，现代药理学研究，山茱萸在糖尿病防治、心脑血管的保护、免疫调节、抗氧化、抗炎、抗休克、保肝及抗肿瘤等方面均表现出较好的活性。目前关于山茱萸对2型糖尿病改善的研究主要在总成分上，对山茱萸活性成分的作用机理集中在调节糖脂代谢和胰岛素信号通路的作用机制等方面，由于中药所含成分的多样性和复杂性，对其降糖的活性成分及其作用机制缺乏系统研究及阐述。
目前山茱萸的化学成分研究主要是以传统的先分离纯化后再利用波谱技术鉴定其结构，分析模式烦琐，存在重复分离已知成分和获得新成分纯品困难等问题。由于山茱萸所含成分的多样性和复杂性，其治疗糖尿病的分子机制尚未得到完全阐释，每种活性成分对疾病的治疗机理是不一样的，网络药理学能够通过对药物组、疾病组、分子相互作用进行分子网络构建，获取药物-靶标间的作用关系，对药物的筛选具有一定作用，但是糖尿病的分子机制是复杂的，尚未得到完全阐释，即使完全获取了药物-靶标网络，其依然只能得到常规的山茱萸的降糖活性成分，不能知晓这些活性成分之间的配合关系，从而筛选得到最有效的山茱萸的降糖活性成分组合。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种筛选山茱萸降糖活性成分的方法，以提高山茱萸活性成分筛选的效率，降低药物活性成分筛选成本。
本发明的内容为一种筛选山茱萸降糖活性成分的方法，包括如下步骤：
(1)、用超高效液相色谱-电喷雾四极杆-飞行时间质谱技术建立山茱萸水提物的成分分析方法，并通过数据分析鉴定山茱萸中主要的活性成分；
(2)、将活性成分的化学结构和DrugBank数据库进行相似性对比，相似性打分卡值设定为0.8，得到成分靶标；
(3)、检索疾病/证候靶标数据库，得到糖尿病的候选疾病靶标；
(4)、采用网络药理学技术对山茱萸的化学成分进行相关的降糖作用靶标预测，构建山茱萸成分-降糖靶点-作用通路网络，预测其潜在的降糖活性成分及分子作用机制；
(5)、通过细胞实验对潜在的活性成分进行活性评价和实验验证，从而明确山茱萸中真实有效的降糖活性成分。
优选的，山茱萸水提物的成分分析方法，包括如下步骤：
a.山茱萸样品溶液的制备
b.对照品溶液的制备；
c.山茱萸化学成分液质分析；
色谱条件：色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0×100mm,1.8μm)，流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.1％的甲酸水溶液，梯度洗脱程序：0～15min，3％～10％A；15～25min，10％～25％A；25～40min，25％～70％A；流速：0.3mL/min，进样量：1μL；
质谱检测条件：离子化方式为电喷雾离子化，准确质量数用ESI-L LowConcentration TuningMix(G1969-85000)校正，正负离子分析模式，MRE扫描方式，扫描检测，m/z 100～1500，除溶剂气体为氮气，干燥气温度为325℃；干燥气流速：6.8L/min；鞘气温度：350℃；毛细管电压：4.0kv；Fragment电压110V，扫描范围为50-1000；
d.成分分析：通过UPLC-ESI-Q-TOF/MS对山茱萸的化学成分进行定性分析，得到ESI-MS的质谱总离子流图，采用Agilent Masshunter Qualitative Analysis工作站中的分子特征提取功能，通过设定合适的阈值参数，对山茱萸正负离子模式下采集到的总离子流图进行提取，获得化合物的准离子分子峰信息，根据供试品的色谱保留时间、质谱准分子离子峰和碎片离子信息，通过对SciFinder数据库、山茱萸属相关文献以及对照品信息进行数据分析。
优选的，所述山茱萸样品溶液的制备方法为，将山茱萸药材粉碎，优选过40目筛，称取5g，精密称定，加50mL 75％甲醇(体积浓度)超声提取3次，每次10min，合并提取液，减压回收甲醇至无醇味，冷冻干燥，加70％甲醇(体积浓度)超声溶解，定容到50ml，8000rpm离心5min，取上清液，摇匀，经0.22μm有机微孔滤膜滤过，即得山茱萸样品溶液。
优选的，所述对照品溶液的制备方法为，取5-羟甲基糠醛、獐牙菜苷、马钱苷、齐墩果酸对照品、槲皮素、山奈酚、胡萝卜苷、β-谷甾醇对照品各2.0mg，精密称定，分别置于10mL容量瓶中，加适量70％甲醇超声溶解，并以70％甲醇定容，制成浓度为200ug/mL的对照品贮备液，进样前将对照品贮备液用70％甲醇稀释10倍，经0.22μm有机微孔滤膜滤过。
优选的，检索疾病/证候靶标数据库的检索关键词为：“diabetes mellitus”、“diabetes”。
优选的，构建山茱萸成分-降糖靶点-作用通路网络的方法为，将山茱萸所含成分靶标和已知与糖尿病相关的疾病靶标之间的相互作用关系对提取出来，在PPI数据库获得蛋白质-蛋白质相互作用数据；以网络中节点拓扑结构特征值“节点连接度(degree)”的2倍中位数为卡值，选取中药靶标-疾病蛋白互作网络的核心节点(Hub节点)，将筛选到与糖尿病相关的关键靶标，构建成分靶标-疾病靶标核心网络图，并通过KEGG数据库中对这些核心靶标进行通路富集分析，选取其中具有统计学意义(p-value<0.01)及富集基因数量大于等于7的条目，得到关键核心靶标参与的关键通路信息；将中药与中药成分之间关系，中药成分与关键核心靶标相互作用关系，关键核心靶标与富集的关键通路相互作用关系，建立起“中药-成分-靶标-通路”关系网络。
优选的，所述细胞实验为Hep G2细胞葡萄糖摄取、增殖以及对Hep G2细胞胰岛素抵抗模型摄取葡萄糖的影响实验。
通过液质分析技术和网络药理学技术，筛选出18的活性成分中，对马钱苷、脱水莫诺苷、熊果酸、齐墩果酸，山奈酚，槲皮素6个活性成分通过体外细胞实验，考察Hep G2细胞葡萄糖摄取、增殖以及对Hep G2细胞胰岛素抵抗模型摄取葡萄糖的影响进行活性评价和实验验证。
a.Hep G2细胞培养与传代
细胞培养条件为：37℃，5％的CO2气体，1-2天更换培养液一次，或者待培养液变黄后更换培养液，每隔3～5天，细胞快要长满培养瓶底时对细胞进行传代操作。
细胞传代步骤：将培养液用无菌吸管吸出，将无菌磷酸盐缓冲液(PBS)加入培养瓶中，左右摇晃，清洗细胞1～2次，吸出PBS后，每瓶用1～2mL胰酶消化细胞，约2～3min后，显微镜下观察细胞快要脱落时，往培养瓶中加入2～3mL培养液使胰酶失活，用无菌吸管反复吹打，使细胞脱落并分散到悬液中，将悬液吸出转移到15mL带旋盖的离心管中，离心(1000r/min，5min)，弃掉上清液，收集细胞，用完全培养液吹打细胞并稀释，按照1:3比例分装后，加入新的培养瓶中继续培养。
b.Hep G2细胞葡萄糖摄取研究
将对数期生长的Hep G2细胞按照细胞传代的步骤，将细胞制成单细胞悬液，然后稀释成104/mL，以每孔100μL将细胞接种于96孔板中，待细胞贴壁后，更换为不含胎牛血清的DMEM培养液，培养16h，让细胞适应无血清的环境，然后弃去培养基，加入各组培养液，实验设置空白组(无细胞)、对照组(不加药)、胰岛素组(10-4mg/m L)、盐酸二甲双胍组(0.01mg/m L)、药物组(0.5、0.2、0.1、0.05、0.01mg/m L)，其中药物组包括马钱苷、脱水莫诺苷、熊果酸、齐墩果酸、山奈酚、槲皮素，每组6个平行，继续培养24h，然后用葡萄糖检测试剂盒检测培养液上清中葡萄糖的含量，葡萄糖摄取量(GI)＝空白组葡萄糖含量-药物组葡萄糖的含量。
c.Hep G2细胞的增殖抑制研究
在b的基础上，弃去培养液，然后在每孔中加100μL MTT(0.5mg/m L)溶液，在培养箱中反应4h，吸走MTT溶液，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，室温下轻轻摇晃10min，充分溶解甲瓒(Formazan)，然后于酶标仪490nm处检测吸光度值，以吸光值反映活细胞的数量。
d.细胞胰岛素抵抗模型的建立
以每孔103个细胞接种于96孔培养板内，待贴壁后，更换不含血清的培养液培养16h，然后加入各组培养液，分为对照组及模型组，模型组加入含有不同梯度浓度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6mg/m L)的胰岛素，培养36h，然后弃去培养液，用PBS清洗细胞，加入正常高糖培养液培养24h，用葡萄糖检测试剂盒检测培养液上清葡萄糖含量，选择葡萄糖摄取量最少的浓度为最佳胰岛素浓度。同样上述操作方法，选择最佳胰岛素浓度，作用24、36、48、60h，然后用PBS清洗细胞，换正常高糖培养液培养24h，然后用葡萄糖检测试剂盒检测培养液上清葡萄糖含量，选择葡萄糖摄取量随浓度变化最小的时间为最佳培养时间。
e.胰岛素抵抗模型摄取葡萄糖的研究
取对数期的生长细胞，以每孔100μL、103个细胞接种于96孔板内，待细胞单层贴壁后换无血清培养液，培养16h后换各组培养液，分为空白组、对照组、胰岛素抵抗模型组，空白组不加细胞，对照组加入正常培养液，模型组加入筛选的最佳胰岛素浓度的培养液，培育到造模的最佳时间，然后弃去培养液，换上无血清的培养基，设置对照组、模型加药组，加药组分为盐酸二甲双胍组、山茱萸提取物组，培养24h后计算各组细胞葡萄糖摄取量。
本发明通过液质联用分析技术和网络药理学技术的结合来实现中药山茱萸降糖活性成分的快速筛选。利用了液质分析技术和网络药学学技术，液质联用分析技术能够在短时间内对中药山茱萸实现复杂成分进行“全分析”和快速鉴定40个化学成分，在此基础上通过网络药理学技术初步揭示了中药山茱萸降糖18个潜在的活性成分及可能的作用机制，最后通过体外细胞实验评价和验证其6个成分，齐墩果酸和马钱苷能够显著促进HepG2细胞及其胰岛素抵抗模型的葡糖糖摄取。以下是齐墩果酸和马钱苷的结构式
本发明的有益效果是，液质联用分析技术具有高分离度、高灵敏度、高准确度的特点，能够在短时间内对中药实现复杂成分进行“全分析”和快速分离，对中药已知成分能够定性定量分析，对未知成分，能够给出大量的结构信息，是中药药效物质基础研究的一个强大分析手段，因此在中药的成分分析和鉴定中呈现出强大的优势。网络药理学通过网络的角度看待药物与靶点及疾病间的相互关系，结合系统生物学技术，将中药有效成分组学与网络生物学结合在一起，可从整体水平揭示中药对机体生物分子网络的作用，为中药作用机制阐释开辟新的道路。
本研究将液质联用分析技术与网络药理学技术相结合，对山茱萸的化学成分进行系统分析，并同时对其治疗糖尿病潜在的活性成分和作用机制进行预测和实验验证，建立了一种快速筛选中药山茱萸降糖活性成分的方法，解决了中药成分不清楚和作用机制不明确的问题，对于传统中药的研究开发具有重要的意义和广泛实用性。
附图说明
图1为山茱萸的ESI-MS的质谱总离子流图。
图2为不同物质对Hep G2细胞葡萄糖摄入量的影响图。
图3为不同物质对Hep G2细胞增殖的影响图。
图4为不同物质Hep G2胰岛素抵抗模型细胞葡萄糖摄入的影响图。
具体实施方式
实验例一、
步骤一：山茱萸化学成分的液质系统分析
1仪器与材料
Agilent 1290UPLC-6540accurate mass Q-TOF色谱-质谱联用仪(美国Agilent科技公司)；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0×100mm,1.8μm)色谱柱；MassHunter质谱工作站(美国Agilent公司)；超声仪(上海科导超声仪器有限公司)，Biofuge primoR台式离心机(美国Thermo公司)；Milli-Q超纯水制备仪(美国Millipore公司)；x S105型电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；乙腈(质谱纯，德国Merck Millipore)；
5-羟甲基糠醛对照品(批号：1116265-201704，中国食品药品检定研究院)、獐牙菜苷对照品(批号：110785-201404-201703，中国食品药品检定研究院)、马钱苷对照品(批号：111865-201704，中国食品药品检定研究院)、齐墩果酸对照品(实验室自制，HPLC分析，纯度>99％)、槲皮素对照品(实验室自制，HPLC分析，纯度>99％)、山奈酚对照品(实验室自制，HPLC分析，纯度>99％)、胡萝卜苷(实验室自制，HPLC分析，纯度>99％)、β-谷甾醇(实验室自制，HPLC分析，纯度>99％)；
山茱萸药材购于湖南九芝堂大药房,批号201704007。
2色谱条件和质谱条件
色谱条件：色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0×100mm,1.8μm)，流动相：乙腈(A)水(B)(水中含0.1％甲酸，质谱级)，梯度洗脱程序：0～15min，3％～10％A；15～25min，10％～25％A；25～40min，25％～70％A；流速：0.3mL/min，进样量：1μL。
质谱检测条件：离子化方式为电喷雾离子化(ESI)，准确质量数用ESI-L LowConcentration Tuning Mix(G1969-85000)校正，正负离子分析模式，MRE扫描方式。扫描检测，m/z 100～1500，除溶剂气体为氮气，干燥气温度为325℃；干燥气流速：6.8L/min；鞘气温度：350℃；毛细管电压：4.0kv；Fragment电压110V，扫描范围为50-1000。
3山茱萸样品溶液的制备
将山茱萸药材粉碎过40目筛，称取5g，精密称定，加50mL75％甲醇超声提取3次，每次10min，合并提取液，减压回收甲醇至无醇味，冷冻干燥，加70％甲醇超声溶解，定容到50ml，8000rpm离心5min，取上清液，摇匀，经0.22μm有机微孔滤膜滤过，即得山茱萸样品溶液，作为液质分析样品。
4、对照品溶液的制备
取5-羟甲基糠醛、獐牙菜苷、马钱苷、齐墩果酸对照品(实验室自制，HPLC分析，纯度>99％)、槲皮素、山奈酚、胡萝卜苷、β-谷甾醇对照品各2.0mg，精密称定,分别置于10mL容量瓶中，加适量70％甲醇超声溶解，并以70％甲醇定容，制成浓度为200ug/mL的对照品贮备液，进样前将对照品贮备液用70％甲醇稀释10倍，经0.22μm有机微孔滤膜滤过。
5山茱萸提取物的液质成分分析
通过UPLC-ESI-Q-TOF/MS对山茱萸的化学成分进行定性分析，得到(+)ESI-MS的质谱总离子流图，见图1。采用Agilent Masshunter Qualitative Analysis工作站中的分子特征提取(MFE)功能，通过设定合适的阈值参数，对山茱萸正离子模式下采集到的总离子流图进行提取，获得化合物的准离子分子峰信息，根据供试品的色谱保留时间、质谱准分子离子峰和碎片离子等信息。通过对SciFinder数据库、山茱萸属相关文献以及对照品信息进行数据分析，得到山茱萸40个化学成分(见图1和表1)，其中包括环烯醚萜类4个，黄酮类3个，三萜和甾体类11个，酚酸类8个，氨基酸及其它14个。
表1山茱萸化学成分的UPLC-UPLC-ESI-Q-TOF/MS2鉴定结果
步骤二山茱萸降糖作用机制的网络药理学研究
1、化学成分来源及靶标的预测
通过UPLC-Q-TOF分析得到山茱萸的化学成分，并通过整合药理学平台“中药成分数据库”，检索添加这些化学成分，然后通过该平台整合的DrugBank数据库，对所含化学成分与DrugBank数据库中的药物进行相似性比对，相似性打分卡值设定为0.8(Score>0.8)，预测每一个成分的潜在靶标。通过液质分析技术得到山茱萸中40个化学成分，通过与DrugBank数据库中的药物进行相似度打分，大于等于0.8的相似性药物被认为与山茱萸所含的化学成分具有高度的相似性，共得到山茱萸131对“成分-靶标”对信息。
2、疾病候选靶标来源
在疾病/证候靶标数据库，以“diabetes mellitus”、“diabetes”作为糖尿病疾病或症状关键词进行检索，作为候选的疾病靶标。
3、成分靶标-疾病靶标网络构建
将山茱萸所含成分靶标和已知与糖尿病相关的疾病靶标之间的相互作用关系对提取出来，在PPI数据库获得了蛋白质-蛋白质相互作用数据。以网络中节点拓扑结构特征值“节点连接度(degree)”的2倍中位数为卡值，选取中药靶标-疾病蛋白互作网络的核心节点(Hub节点)，将筛选到与糖尿病相关的关键靶标，构建成分靶标-疾病靶标核心网络图，并通过KEGG数据库中对这些核心靶标进行通路富集分析，选取其中具有统计学意义(p-value<0.01)及富集基因数量大于等于7的条目，得到关键核心靶标参与的关键通路信息。
对中药成分靶标和与糖尿病相关的疾病靶标的相互作用网络进行构建，共得到69个节点和356对相互作用。在这个网络中，所有节点＂连接度＂的中位数为2，故选取＂连接度＂两倍中位数4作为临界值，共筛选到46个与糖尿病相关的关键靶标，对46个关键节点的相互作用关系进行提取，构建蛋白与蛋白相互作用关系网络，通过提取关键核心节点的214对相互作用关系，便得到关键节点的核心靶标网络。
为进一步明确核心关键靶标的生物学功能，通过技术平台中的GO数据库中对这些关键核也节点进行通路富集分析，可以看出该部分靶标显著富集于多条与糖尿病相关的通路，包括GO0035235：ionotropic glutamate receptor signaling pathway(离子型谷氨酸受体信号通路)，GO0008652：cellular amino acid biosynthetic process(细胞氨基酸生物合成)，GO0006541：glutamine metabolic process(谷氨酰胺代谢过程)，GO0071377：cellular response to glucagon stimulus(胰高血糖素刺激的细胞应答)，GO0007215:glutamate receptor signaling pathway(谷氨酸受体信号通路)，GO0007190：activationof adenylate cyclase activity(激活腺苷酸环化酶活性)等，根据P-Value值列出前10条富集通路，具体见表2.
表2关键靶标的GO通路富集分析结果
Table2 GO functional analysis of the candidate targets for the TCMformulation
4、“成分-靶标-通路”网络构建与分析
为了更加直观地反映中药、化学成分、靶标和通路之间的关系，通过技术平台的关系网络绘图，将中药与中药成分之间关系，中药成分与关键核心靶标相互作用关系，关键核心靶标与富集的关键通路相互作用关系，建立起“中药-成分-靶标-通路”关系网络，并对通过网络图进行可视化展示。
靶点网络特征分析显示，统计结果发现：所检测到的山茱萸40个成分中有18个活性成分：葡萄糖，苹果酸，熊果酸，棕榈酸，亚油酸，谷氨酸，苏氨酸，5-羟甲基糠醛，香草醛，绿原酸，齐墩果酸，绿原酸，山楂酸，脱水莫诺苷，马钱苷，槲皮素，山奈酚，亚油酸乙酯，与葡萄糖激酶(GCK)，腺苷酸环化酶(ADCY2,ADCY8,ADCY3,ADCY9)，环氧化酶(COX7A1,COX6C,COX5B,COX7C,COX5A,COX6B1),前列腺素内源性过氧化物合酶(PTGS1、PTGS2)、谷氨酸转运体(SLC1A1，SLC1A2，SLC1A3)谷氨酸离子受体(GRIN1,GRIK3,GRIN2D,GRIA1,GRIK1,GRIK5,GRIN2C,GRIK2,GRIA4,GRIA3),过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)等一些主要蛋白有很强的相互作用，网络富集分析显示通过相关通路主要有谷氨酸的代谢和转运通路(glutamate receptor signaling pathway)，胰高血糖素刺激的细胞应答(cellularresponse to glucagon stimulus)、腺苷酸环化酶激活(activation of adenylatecyclase activity)等多条信号通路相关，参与对糖尿病病理过程不同环节的调控。
通过网络药理学预测的GCK和ADCY与糖尿病密切相关，GCK是糖代谢途径中的关键酶，参与糖酵解第一步反应，催化葡萄糖磷酸化，通过增加胰岛素释放和促进肝脏葡萄糖的利用双重作用机制来降低血糖，在维持血糖稳态过程中发挥重要作用。研究表明胰高血糖素刺激受体时，激活G蛋白，引起细胞内cAMP水平升高，cAMP又激活PKA，PKA激活糖原磷酸化酶b激酶，促进糖原分解代谢，同时抑制糖原合酶，抑制糖原合成，从而使血糖升高。
步骤三山茱萸活性成分的实验验证
通过液质分析技术和网络药理学技术，筛选出18种活性成分中，对马钱苷、脱水莫诺苷、熊果酸、齐墩果酸，山奈酚，槲皮素6个活性成分通过体外细胞实验，考察Hep G2细胞葡萄糖摄取、增殖以及对Hep G2细胞胰岛素抵抗模型摄取葡萄糖的影响进行活性评价和实验验证。
(1)Hep G2细胞培养与传代
采用DMEM高糖培养液，葡萄糖含量为4.5g/L；
DMEM完全培养液配方：DMEM高糖培养液体积比89％，新生胎牛血清体积比10％、青霉素和链霉素抗体体积比1％；
细胞培养条件为：37℃，5％的CO2气体，1-2天更换培养液一次，或者待培养液变黄后更换培养液，每隔3-5天，细胞快要长满培养瓶底时对细胞进行传代操作。
细胞传代步骤：将培养液用无菌吸管吸出，将无菌磷酸盐缓冲液(PBS)加入培养瓶中，左右摇晃，清洗细胞1-2次，吸出PBS后，每瓶用1-2mL胰酶消化细胞，约2-3min后，显微镜下观察细胞快要脱落时，往培养瓶中加入2-3mL培养液使胰酶失活，用无菌吸管反复吹打，使细胞脱落并分散到悬液中，将悬液吸出转移到15mL带旋盖的离心管中，离心(1000r/min，5min)，弃掉上清液，收集细胞，用完全培养液吹打细胞并稀释，按照1:3比例分装后，加入新的培养瓶中继续培养。
(2)Hep G2细胞葡萄糖摄取研究
将对数期生长的Hep G2细胞按照细胞传代的步骤，将细胞制成单细胞悬液，然后稀释成104/mL，以每孔100μL将细胞接种于96孔板中，待细胞贴壁后，更换为不含胎牛血清的DMEM培养液，培养16h，让细胞适应无血清的环境，然后弃去培养基，加入各组培养液，实验设置空白组(无细胞)、对照组(不加药)、胰岛素组(10-4mg/mL)、盐酸二甲双胍组(0.01mg/mL)、药物组(0.5、0.2、0.1、0.05、0.01mg/mL)，其中药物组包括马钱苷、脱水莫诺苷、熊果酸、齐墩果酸、山奈酚、槲皮素，每组6个平行，继续培养24h，然后用葡萄糖检测试剂盒检测培养液上清中葡萄糖的含量，葡萄糖摄取量(GI)＝空白组葡萄糖含量-药物组葡萄糖的含量。
(3)Hep G2细胞的增殖抑制研究
在(2)的基础上，弃去培养液，然后在每孔中加100μL MTT(0.5mg/mL)溶液，在培养箱中反应4h，吸走MTT溶液，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，室温下轻轻摇晃10min，充分溶解甲瓒(Formazan)，然后于酶标仪490nm处检测吸光度值，以吸光值反映活细胞的数量。
(4)细胞胰岛素抵抗模型的建立
以每孔103个细胞接种于96孔培养板内，待贴壁后，更换不含血清的培养液培养16h，然后加入各组培养液，分为对照组及模型组，模型组加入含有不同梯度浓度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6mg/m L)的胰岛素，培养36h，然后弃去培养液，用PBS清洗细胞，加入正常高糖培养液培养24h，用葡萄糖检测试剂盒检测培养液上清葡萄糖含量，选择葡萄糖摄取量最少的浓度为最佳胰岛素浓度。同样上述操作方法，选择最佳胰岛素浓度，作用24、36、48、60h，然后用PBS清洗细胞，换正常高糖培养液培养24h，然后用葡萄糖检测试剂盒检测培养液上清葡萄糖含量，选择葡萄糖摄取量随浓度变化最小的时间为最佳培养时间。
(5)胰岛素抵抗模型摄取葡萄糖的研究
取对数期的生长细胞，以每孔100μL、103个细胞接种于96孔板内，待细胞单层贴壁后换无血清培养液，培养16h后换各组培养液，分为空白组、对照组、胰岛素抵抗模型组，空白组不加细胞，对照组加入正常培养液，模型组加入筛选的最佳胰岛素浓度的培养液，培育到造模的最佳时间，然后弃去培养液，换上无血清的培养基，设置对照组、模型加药组，加药组分为盐酸二甲双胍组、山茱萸提取物组，培养24h后计算各组细胞葡萄糖摄取量。
各组对Hep G2细胞葡萄糖摄取均有促进作用,且呈剂量依耐性，浓度越高，促进作用越强；在低浓度能够促进细胞的增殖，在高浓度对细胞具有显著的增殖抑制作用，齐墩果酸在一定程度上能够促进细胞的增殖，其中马钱苷和齐墩果酸能够显著促进Hep G2细胞及其胰岛素抵抗模型的葡糖糖摄取。分别见图2-4。
本发明通过液质联用分析技术和网络药理学技术的结合来实现中药山茱萸降糖活性成分的快速筛选，其特征是利用了液质分析技术和网络药学学技术。液质联用分析技术能够在短时间内对中药山茱萸实现复杂成分进行“全分析”和快速鉴定40个化学成分，在此基础上通过网络药理学技术建立了山茱萸成分靶标-糖尿病疾病靶标的分子生物网络、中药-成分-靶标-通路网络，从多个角度探索山茱萸治疗糖尿病的潜在的分子机制，初步揭示了中药山茱萸降糖18个潜在的活性成分及可能的作用机制，最后通过体外细胞实验评价和验证其6个成分，齐墩果酸和马钱苷能够显著促进HepG2细胞及其胰岛素抵抗模型的葡糖糖摄取。本发明解决了中药成分不清楚和作用机制不明确的问题，对于传统中药的研究开发具有重要的意义和广泛实用性。
Claims (7)
1.一种筛选山茱萸降糖活性成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、用超高效液相色谱-电喷雾四极杆-飞行时间质谱技术建立山茱萸水提物的成分分析方法，并通过数据分析鉴定山茱萸中主要的活性成分；
(2)、将活性成分的化学结构和DrugBank数据库进行相似性对比，相似性打分卡值设定为0.8，得到成分靶标；
(3)、检索疾病/证候靶标数据库，得到糖尿病的候选疾病靶标；
(4)、采用网络药理学技术对山茱萸的化学成分进行相关的降糖作用靶标预测，构建山茱萸成分-降糖靶点-作用通路网络，预测其潜在的降糖活性成分及分子作用机制；
(5)、通过细胞实验对潜在的活性成分进行活性评价和实验验证，从而明确山茱萸中真实有效的降糖活性成分。
2.如权利要求1所述的山茱萸活性成分分析的方法，其特征在于，山茱萸水提物的成分分析方法，包括如下步骤：
a.山茱萸样品溶液的制备；
b.对照品溶液的制备；
c.山茱萸化学成分液质分析；
色谱条件：流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.1％的甲酸水溶液，梯度洗脱程序：0～15min，3％～10％A；15～25min，10％～25％A；25～40min，25％～70％A；流速：0.3mL/min，进样量：1μL；
质谱检测条件：离子化方式为电喷雾离子化，正负离子分析模式，MRE扫描方式，扫描检测，m/z 100～1500，除溶剂气体为氮气，干燥气温度为325℃；干燥气流速：6.8L/min；鞘气温度：350℃；毛细管电压：4.0kv；Fragment电压110V，扫描范围为50-1000；
d.成分分析：通过UPLC-ESI-Q-TOF/MS对山茱萸的化学成分进行定性分析，得到ESI-MS的质谱总离子流图，采用Agilent Masshunter Qualitative Analysis工作站中的分子特征提取功能，通过设定合适的阈值参数，对山茱萸正负离子模式下采集到的总离子流图进行提取，获得化合物的准离子分子峰信息，根据供试品的色谱保留时间、质谱准分子离子峰和碎片离子信息，通过对SciFinder数据库、山茱萸属相关文献以及对照品信息进行数据分析。
3.如权利要求2所述的山茱萸活性成分分析的方法，其特征在于，所述山茱萸样品溶液的制备方法为，将山茱萸药材粉碎，称取5g，精密称定，加50mL75％甲醇超声提取3次，每次10min，合并提取液，减压回收甲醇至无醇味，冷冻干燥，加70％甲醇超声溶解，定容到50ml，8000rpm离心5min，取上清液，摇匀，经0.22μm有机微孔滤膜滤过，即得山茱萸样品溶液。
4.如权利要求2所述的山茱萸活性成分分析的方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备方法为，取5-羟甲基糠醛、獐牙菜苷、马钱苷、齐墩果酸对照品、槲皮素、山奈酚、胡萝卜苷、β-谷甾醇对照品各2.0mg，精密称定，分别置于10mL容量瓶中，加适量70％甲醇超声溶解，并以70％甲醇定容，制成浓度为200ug/mL的对照品贮备液，进样前将对照品贮备液用70％甲醇稀释10倍，经0.22μm有机微孔滤膜滤过。
5.如权利要求1-4任一项所述的山茱萸活性成分分析的方法，其特征在于，检索疾病/证候靶标数据库的检索关键词为：“diabetes mellitus”、“diabetes”。
6.如权利要求1或2所述的山茱萸活性成分分析的方法，其特征在于，构建山茱萸成分-降糖靶点-作用通路网络的方法为，将山茱萸所含成分靶标和已知与糖尿病相关的疾病靶标之间的相互作用关系对提取出来，在PPI数据库获得蛋白质-蛋白质相互作用数据；以网络中节点拓扑结构特征值“节点连接度”的2倍中位数为卡值，选取中药靶标-疾病蛋白互作网络的核心节点，将筛选到与糖尿病相关的关键靶标，构建成分靶标-疾病靶标核心网络图，并通过KEGG数据库中对这些核心靶标进行通路富集分析，选取其中具有统计学意义及富集基因数量大于等于7的条目，得到关键核心靶标参与的关键通路信息；将中药与中药成分之间关系，中药成分与关键核心靶标相互作用关系，关键核心靶标与富集的关键通路相互作用关系，建立起“中药-成分-靶标-通路”关系网络。
7.如权利要求1或2所述的山茱萸活性成分分析的方法，其特征在于，所述细胞实验为Hep G2细胞葡萄糖摄取、增殖以及对Hep G2细胞胰岛素抵抗模型摄取葡萄糖的影响实验。
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