CN112114073A - 一种枳壳质量标志物及其筛选方法和其应用 - Google Patents

一种枳壳质量标志物及其筛选方法和其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种枳壳质量标志物及其筛选方法，该方法是首先比较江西道地优质枳壳和非道地枳壳的化学表型和差异成分，通过血清药物化学和体内外和虚拟健胃活性筛选的药理研究，最终确定枳壳中具有健胃功效的化学成分群。本发明发现，灌胃给予枳壳醇提物可以显著抵抗阿托品诱导的胃肠动力障碍，通过体外化学成分的健胃活性筛选，最终确定了能反映枳壳临床用药有效性的化学成分群，该化学成分群可以作为枳壳的质量标志物，实现基于药效成分的枳壳的质量控制。本发明解决了枳壳药材质量的良莠不齐和临床药效不稳定，以及传统枳壳质量标准不反映药效不关联等中药质量控制难题。

Description

一种枳壳质量标志物及其筛选方法和其应用
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及中药质量标志物的发现及应用，具体地说，涉及一种代表枳壳健胃药效的有效成分群、枳壳的质量标志物及其筛选方法。
背景技术：
中药是个复杂丰富的化学实体库，传统的中药质量控制仅采用简单的指纹图谱和单一成分的定量测定来评价其质量，存在着质控片面有限，并不能全面客观反映中药的化学成分复杂性和多样性。另外传统指标专属性差，并不能关联药效。
作为目前新兴中药质控思路，中药质量标志物“Quality-marker”，是存在中药和中药制剂中存在的或加工过程中形成的化学物质，可进行定量测定的成分。也是指中药功效/药效密切相关的化学物质，这些化学物质含量的高低可以反映中药的品质属性的安全性和有效性
分子网络(Molecular networking，MN)是一种可视化的计算二级质谱碎片离子方法，可直观展示同一分析样本中检测到的所有准分子及其二级碎片离子之间的化学关系，对于已知化合物的快速鉴定、结构表征以及天然产物去重、未知新颖化合物的发现、活性先导化合物物的发现具有重要的指导作用。
代谢组学(metabolomics)是一种新兴的分析化学组学技术，是系统生物学的重要组成部分。目前代谢组学在中草药研究应用广泛，可系统分析中草药化学成分，比较不同来源的中药化学成分异同，无偏客观评价中药等级和质量。
枳壳为芸香科植物酸橙(Citrus aurantium L.)及其栽培变种的干燥未成熟果实，为传统理气宽中，行滞消胀的中草药。传统以江西产的枳壳为道地药材，质量佳，药效确切，但市售枳壳品种繁多混乱，质量参差不齐。因此需要合理有效评价和监控枳壳质量，寻找道地药材的质量标志物。另外枳壳作为临床常用的健胃中药，但其健胃活性成分和药效物质尚不清晰，为此，以中药质量标志物的思路，以枳壳的健胃功效为药理活性，筛选具有健胃功效的枳壳的质量标志物，可以发掘枳壳质控成分，使得枳壳质控成分与枳壳的传统药效密切相连，有利于对枳壳进行综合全面质控。
发明内容：
本发明的第一目的在于提供一种枳壳质量标志物及其筛选方法，所述枳壳的质量标志物为代表枳壳健胃活性的有效成分群；本发明的第二目的在于提供一种以新橙皮苷、柚皮苷和橙皮内酯为代表的具有健胃药效的活性成分群，其作为枳壳的质量标志物；本发明的第三目的在于提供枳壳具有健胃药效的有效成分群在枳壳药材质量评价中的应用，旨在通过枳壳的质量标志物对枳壳进行系统的质量评价。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
一种筛选枳壳质量标志物的方法，所述枳壳的质量标志物为代表枳壳健胃活性的有效成分群，所述筛选枳壳质量标志物的方法包括下述步骤：，
(1)基于文献报道和TCMSP整理枳壳中的小分子化合物信息，采用以高分辨质谱为基础的分子网络技术分析枳壳的化学成分，建立枳壳的小分子化合物库；
(2)基于代谢组学比较江西道地枳壳优于非道地枳壳的差异性化学成分；
(3)采用中药血清药物化学筛选枳壳入血成分的原型，系统筛选具有健胃活性的有效成分群；
(4)采用阿托品诱导的胃肠动力障碍模型，筛选病理状态下枳壳入血成分的原型，进一步筛选具有健胃活性的有效成分群；
(5)基于步骤(4)所得入血成分原型，将入血成分进行体外活性评价，以乙酰胆碱酯酶为消化不良靶点，评价入血成分对于胃源乙酰胆碱酯酶的抑制活力，从而得出枳壳质量标志物。
根据所述的方法，其中步骤(3)的具体方式为：对健康大鼠分别给予溶媒和枳壳提取物，比较入血成分差别，从而得到枳壳入血成分原型。在步骤(5)中，以乙酰胆碱酯酶为消化不良靶点，评价入血成分对于胃源乙酰胆碱酯酶的抑制活力，得出的枳壳质量标志物为新橙皮苷、柚皮苷和橙皮内酯。
本发明同时提供一种代表枳壳健胃药效的有效成分群，其包括新橙皮苷、柚皮苷、川陈皮素、柚皮素、橙皮内酯和异橙皮内酯。
以及所述的代表枳壳健胃药效的有效成分群的制备方法，其特征在于该方法包括下述步骤：
(1)基于文献报道和TCMSP整理枳壳中的小分子化合物信息，采用以高分辨质谱为基础的分子网络技术分析枳壳的化学成分，建立枳壳的小分子化合物库；
(2)基于代谢组学比较江西道地枳壳优于非道地枳壳的差异性化学成分；
(3)采用中药血清药物化学筛选枳壳入血成分的原型，系统筛选具有健胃活性的有效成分群；
(4)采用阿托品诱导的胃肠动力障碍模型，筛选病理状态下枳壳入血成分的原型，进一步筛选得到具有健胃活性的有效成分群。
同时提供所述的代表枳壳健胃药效的有效成分群作为枳壳的质量标志物在枳壳药材质量评价中的应用。
本发明另外还提供了一种枳壳质量标志物，所述枳壳质量标志物为代表枳壳健胃活性的有效成分群，其由下述方法制备而得：
(1)基于文献报道和TCMSP整理枳壳中的小分子化合物信息，采用以高分辨质谱为基础的分子网络技术分析枳壳的化学成分，建立枳壳的小分子化合物库；
(2)基于代谢组学比较江西道地枳壳优于非道地枳壳的差异性化学成分；
(3)采用中药血清药物化学筛选枳壳入血成分的原型，系统筛选具有健胃活性的有效成分群；
(4)采用阿托品诱导的胃肠动力障碍模型，筛选病理状态下枳壳入血成分的原型，进一步筛选具有健胃活性的有效成分群；
(5)基于步骤(4)所得入血成分原型，将入血成分进行体外活性评价，以乙酰胆碱酯酶为消化不良靶点，评价入血成分对于胃源乙酰胆碱酯酶的抑制活力，从而得出枳壳质量标志物。
如所述的枳壳质量标志物，其中所述的江西枳壳和非道地枳壳的差异性化学成分为黄酮类和香豆素类成分，所述的入血成分原型包括黄酮类和香豆素类成分，所述的黄酮类成分包括新橙皮苷、柚皮苷、川陈皮素和柚皮素；所述的香豆素类成分包括橙皮内酯和异橙皮内酯；所述的具有健胃活性的有效成分群包括新橙皮苷、柚皮苷、川陈皮素、柚皮素、橙皮内酯和异橙皮内酯。
本发明另外还提供了上述的枳壳质量标志物在枳壳药材质量评价中的应用。
在一个具体的实施方案中，其中步骤(2)中基于代谢组学得出江西枳壳和非道地枳壳的差异性化学成分为黄酮类和香豆素类成分。
在一个具体的实施方案中，其中步骤(3)采用中药血清药物化学筛选枳壳入血成分的原型，系统筛选具有健胃活性的有效成分群的具体方式为：对健康大鼠分别给予溶媒和枳壳提取物，比较入血成分差别，从而得到枳壳入血成分原型。比如得到的入血成分原型包括黄酮类和香豆素类成分，所述黄酮类成分包括新橙皮苷、柚皮苷、川陈皮素和柚皮素；所述香豆素类成分包括橙皮内酯和异橙皮内酯。
具体的一个方式是，采用阿托品诱导的胃肠动力障碍模型，筛选病理状态下枳壳入血成分的原型，以进一步筛选具有健胃活性的有效成分群，得到的有效成分群包括：新橙皮苷、柚皮苷、川陈皮素和柚皮素，以及橙皮内酯和异橙皮内酯。
本发明的一个优选的实施方案是，以乙酰胆碱酯酶为消化不良靶点，评价入血成分对于胃源乙酰胆碱酯酶的抑制活力，得出的枳壳质量标志物为新橙皮苷、柚皮苷和橙皮内酯。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
本发明提供了一种快速发现和验证中药质量标志物的思路。小分子化合物建库→分子网络识别枳壳成分→道地枳壳和非道地枳壳化学型区分→道地枳壳入血成分研究→枳壳治疗消化不良初步评价→以乙酰胆碱酯酶为消化不良模型确定枳壳质量标志物。
本发明提供了基于药效学的枳壳的质量标志物，所述的质量标志物为代表枳壳健胃药效的有效成分群，并用于枳壳的质量评价，实现了枳壳基于药效成分的质量评价，解决了枳壳药材质量的参差不齐导致用药疗效预期不明确及对枳壳质量评价与其药效不关联的问题。可制备成药物走向国际医药市场。
附图说明：
图1本发明枳壳的分子网络图，包含黄酮类成分簇和香豆素类成分簇等。
图2本发明21批枳壳的指纹图谱对比。
图3江西道地枳壳和非道地枳壳主成分表型区分。(A)道地枳壳和非道地枳壳收集；(B)主成分分析区分道地枳壳和非道地枳壳的化学表型；(C)正交偏最小二乘判别分析区分道地枳壳和非道地枳壳的化学表型；(D)正交偏最小二乘判别分析模型置换检验；(E)层次聚类分析区分道地枳壳和非道地枳壳的化学表型。
图4正交偏最小二乘判别分析模型筛选道地枳壳和非道地枳壳的差异性成分。(A)正交偏最小二乘判别分析散点图区分道地枳壳和非道地枳壳的差异性成分；(B)正交偏最小二乘判别分析散点图(VIP)区分道地枳壳和非道地枳壳的差异性成分；(C)和(D)差异性成分分布图。(E)差异性成分色谱分布图。
图5正交偏最小二乘判别分析模型筛选道地枳壳吸收入血成分。(A)正交偏最小二乘判别分析散点图区分给药前大鼠和给药后大鼠的代谢表型；(B)、(C)和(D)枳壳入血成分分布图。
图6枳壳提取物健胃活力初筛。胃内酚红吸光度。***P<0.05，mean±SD。“*”表示相比空白组。
图7胃源乙酰胆碱酯酶筛选枳壳质量标志物。
图8分子对接虚拟筛选枳壳质量标志物。
具体实施方式：
下面结合附图，用本发明的具体实施例来进一步说明本发明的实质性内容，应理解，以下实施例仅用于说明本发明，但并不以此来限定本发明的保护范围。
下述各实施例中，涉及动物及药品与试剂如下：
动物：Sprague Dawley(SD)雄性大鼠，体重200-250g，10-12周龄，由昆明医科大学实验动物中心提供。C57小鼠体重18-22g，10-12周龄，由辽宁长生实验动物公司提供。
药品与试剂：安捷伦1260液相色谱-G6530三级四极杆串联飞行时间质谱联用(UPLC-QTOF-MS)购买于美国安捷伦有限公司。固相萃取小柱购买于美国安捷伦公司，液相水购买于娃哈哈公司，液相乙腈购买于赛默飞世尔科技公司thermo fisher scientific。ECL808酶标仪。其他液相色谱等有机溶剂及试剂均为最高等级的商业产品。新橙皮苷、橙皮素和川陈皮素等对照品均采购于成都瑞芬思科技有限公司。
沿用小分子化合物建库→分子网络识别枳壳成分→道地枳壳和非道地枳壳化学型区分→道地枳壳入血成分研究→枳壳治疗消化不良初步评价→以乙酰胆碱酯酶为消化不良模型确定枳壳质量标志物。
实施例1：
运用分子网络研究方法得到枳壳的化学组成及主要化学成分。
固相分段萃取富集方法：1)固相萃取小柱活化：固相萃取小柱采用纯乙腈每次1mL，冲洗三次，然后纯水每次1mL，冲洗三次。2)上样：将赣产枳壳50％醇提取液旋干后，1mL30％乙腈复溶，18000g离心后，取上清缓缓上样。3)洗脱：上样后分别采用30％乙腈、50％乙腈、70％乙腈、90％乙腈冲洗，每个梯度每次冲洗1mL，三次。4)浓缩：将各梯度馏分旋转蒸发后，加入1mL 70％乙腈复溶，离心，取上清进样，进行UPLC-MS采集色谱和相应的一级质谱。
分子网络方法：基于二级质谱的分子网络构建：采集质量亏损筛选的化合物的MSMS质谱，模式选择靶向采集模式。采集的原MSMS数据采用MS covert软件(ProteoWizardhttp://proteowizard.sourceforge.net/)转化生成成.mzXML格式的数据文件，在全球天然产物社会分子网络(Global NaturalProducts Social Molecular Networking,GNPS)数据库(http://gnps.ucsd.edu)上建立分子网络，并将分析结果下载出来，将分析结果导入Cytoscape软件，碎片离子便可视化呈现，即构建分子网络可视化图谱完成。采用MS2LDA在线服务器(http://ms2lda.org/)分析栀子中天然产物二级质谱中多次出现模体，识别天然产物亚结构。采用MolNetEnhancer在线服务器(GitHub at https://github.com/madeleineernst/pyMolNetEnhancer)对栀子天然产物进行分类。GNPS数据库参数设置如下：分子网络主要根据GNPS(http://gnps.ucsd.edu)的在线流程(https://ccms-ucsd.github.io/GNPSDocumentation/)创建。数据选择全谱中二级碎片±17Da的离子，而过滤通过去除二级碎片±17Da的前体离子。前体离子的阈值设置为2.0Da，碎片离子的阈值设置为0.5Da。然后创建一个网络，保留分子网络的边余弦分数(MSMS质谱相似性指标)大于0.7且匹配峰值大于6。此外，当且仅当每个节点出现在彼此最相似的前10个节点中时，网络中保持两个节点之间的边缘。最后，将一个分子家族的最大大小设置为100，并从分子家族中移除得分最低的边缘，直到分子家族的大小低于此阈值。
采用分子网络非靶向注释枳壳中化学成分，达到快速分门别类注释的目的。枳壳中化学成分多样，主要含有黄酮苷簇、多甲氧基黄酮苷元簇、异戊烯基取代香豆素簇、香叶基取代香豆素簇、咖啡酸簇，经过调整相似度参数，可将黄酮苷簇和多甲氧基黄酮苷元簇、异戊烯基取代香豆素簇和香叶基取代香豆素簇进行有效区分识别。快速匹配70种天然产物(图1)。
实施例2：
采用代谢组学区分赣产枳壳与非赣产枳壳的化学成分。
药材收集：12批枳壳药材于2017年收集于江西省，编号为ZQ1-12；3批药材收集于湖南省益阳市，编号为ZQ13-15；5批药材收集于重庆市，编号为ZQ16-21。所有标本经江西中医药大学张守文教授鉴定，存于本实验室中4℃冰箱。
药材提取：将枳壳药材粉碎后，过40目标准筛，筛选药材细粉。精确称量50g药粉加入10倍量50％乙醇回流提取三次。过滤，合并三次滤液，减压浓缩除乙醇后，冷冻干燥，加入100mL的50％乙醇复溶，超声，离心，取上清进样。每批药材重复提取处理三次。
经指纹图谱叠加发现，江西省枳壳高于湖南省枳壳和重庆枳壳的成分是在色谱中3-6min的黄酮苷和7-10min黄酮苷元和香豆素(图2)。通过多元变量统计寻找产地差异成分。采用主成分分析区分三个产地成分枳壳的化学表型。根据成分相似与差异，12批江西产枳壳基本聚成一簇，3批湖南产枳壳基本聚成一簇，5批重庆产枳壳基本聚成一簇，说明地区内药材成分差异不大，比较一致。两两比较分析，江西组和湖南组距离最近，层次聚类分析也提示江西组和湖南组药材成分接近，这个化学表型也支持枳壳地理分布表型(图3)。通过正交偏最小二乘判别分析继续分析江西道地枳壳高于湖南枳壳和重庆枳壳的是黄酮类和香豆素类成分(图4)。
实施例3：
枳壳的血清药物化学研究筛选枳壳的入血成分。
清洁级SD大鼠(雄性，20-22g)购买昆明医科大学实验动物中心。10只SD大鼠随机分成两组，枳壳组灌胃给予1g/kg枳壳冻干粉悬浮液，空白组给予蒸馏水处理，灌胃体积2mL/200g。连续给予三天处理，所有大鼠在给药后1h、2h、3h、4h、6h和24h，眼呲静脉取血，2000g/4℃离心取血清。液相检测后，采用非靶标药物代谢组学筛选栀子入血成分。
实验结果显示在给予枳壳1h后，枳壳化学种类暴露相比较多。在生理状态下，血清药物化学揭示枳壳中黄酮类、香豆素类成分得到较好暴露，入血循环的黄酮类成分包括新橙皮苷、柚皮苷、川陈皮素和柚皮素。入血循环的香豆素类成分包括橙皮内酯和异橙皮内酯(图5)。
实施例4：
枳壳对抗阿托品诱导胃肠动力障碍。
本研究开展消化不良状态下的血清药物化学。采用阿托品复制消化不良模型。野生型C57BL/6J小鼠(雄性，20-22g)购买于辽宁长生实验公司。12只C57小鼠随机分成三组，空白组、消化不良组、消化不良+栀子组。消化不良组给予枳壳1g/kg连续3天后，其他两组按体重给予等比例生理盐水。末次给药1h后，阿托品1mg/kg腹腔注射，造模20min后，每只小鼠灌胃给予酚红糊0.2mL，灌胃20min后，摘除眼球取血，2000g/4℃离心取血清。立即解剖取胃、肠，取胃组织。检测胃内酚红剩余量的吸光度。
采用阿托品复制消化不良模型，采用酚红法测定评价胃肠功能，消化不良模型建立后，其胃内的酚红残留量显著增加，预给予枳壳提取物后，可减少胃内酚红滞留量(图6)。与生理状态入血成分接近，在病理状态下，血清药物化学揭示枳壳中黄酮类、香豆素类成分得到较好暴露，入血循环的黄酮类成分包括新橙皮苷、柚皮苷、川陈皮素和柚皮素。入血循环的香豆素类成分包括橙皮内酯和异橙皮内酯。
实施例5：
以胃源乙酰胆碱酯酶为靶点，筛选枳壳潜在质量标志物。
外周乙酰胆碱酯酶是治疗消化不良的新型靶点。改良Ellman法测试枳壳化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性。在37℃恒温条件时，胆碱酯酶与底物结合生成的产物可与显色剂发生显色反应，根据吸光度值的变化来表征枳壳化合物对胆碱酯酶的抑制率。乙酰胆碱酯酶催化的反应底物为碘代乙酰胆碱(Acetylthiocholine Iodide,ATCI)，显色剂均为二硫代双硝基苯甲酸(5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB)。
测试枳壳的化合物包括柚皮素、川陈皮素、新橙皮苷、柚皮苷、橙皮内酯、异橙皮内酯，终浓度1μM。测试化合物母液配制如下0.6mmoL/L二硫代双硝基苯甲酸DTNB MW＝396.35，10mM母液：3.96mg DTNB-1mL PBS。0.6mmoL/L碘代乙酰胆碱ATCI MW＝273.11，10mM母液：2.73mg ATCI-1mL DMSO。阿考替胺MW＝487.013，10mM母液：4.87mg ATCI-1mL DMSO。分别取10μL测试样品溶液，140μL的PBS缓冲液中(pH＝8.0)，10μL的0.5U/mL的乙酰胆碱酯酶溶液，和20μL的0.6mmoL/L DTNB置于96孔板中，混匀，在37℃预孵10min，然后加20μL的0.6mmoL/L ATCI于37℃恒温反应30min后，加50μL无水乙醇终止反应。实验对照组用PBS(pH＝8)代替AChE溶液；空白组用甲醇替代测试样品溶液；空白对照组用甲醇替代测试样品溶液、PBS替代AChE溶液。利用酶标仪在412nm波长测定吸光度值，计算公式如下：抑制率(％)＝100％(空白组-空白对照组)-(实验组-实验对照组)/(空白组-空白对照组)。
基于分子对接软件Molecular Operating Environment(MOE)软件，对枳壳6个潜在标志物柚皮素、川陈皮素、新橙皮苷、柚皮苷、橙皮内酯和异橙皮内酯分别进行分子对接。AChE晶体结构从Protein Data Bank database获得，分辨率为
Figure BDA0002741064310000081
在进行分子对接前，蛋白进行去掉水和其他无关的小分子，并进行加氢、加电荷、能量优化，力场选择为MMFF94x，匹配设为Triangle Matcher，打分设为：London dG，立场定义：Force field。打分排列前30的结合构象导出。
实验结果显示，新橙皮苷、柚皮苷、橙皮内酯显示出对外周乙酰胆碱酯酶有抑制活力(图7)。分子对接也模拟了新橙皮苷、柚皮苷、橙皮内酯对乙酰胆碱酯酶的抑制活力，新橙皮苷、柚皮苷、橙皮内酯可较好进入乙酰胆碱酯酶的活性口袋腔中，发生价键作用力(图8)。综合考虑三地差异成分、吸收入血成分、体外活性评价，初步确定枳壳的质量标志物为新橙皮苷、柚皮苷和橙皮内酯。
本领域技术人员公认的是，中药的化学成分极为复杂，起效模式为多成分、多靶点，相互协同与叠加，因此从药效成分群发现质量标志物是符合中药研究现状的。以关联药效的质量标志物，评价中药质量是合理可行的，也是中药迈向标准化和现代化的重要举措。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例中。

Claims (9)

1.一种筛选枳壳质量标志物的方法，其特征在于所述枳壳的质量标志物为代表枳壳健胃活性的有效成分群，所述筛选枳壳质量标志物的方法包括下述步骤：
(1)基于文献报道和TCMSP整理枳壳中的小分子化合物信息，采用以高分辨质谱为基础的分子网络技术分析枳壳的化学成分，建立枳壳的小分子化合物库；
(2)基于代谢组学比较江西道地枳壳优于非道地枳壳的差异性化学成分；
(3)采用中药血清药物化学筛选枳壳入血成分的原型，系统筛选具有健胃活性的有效成分群；
(4)采用阿托品诱导的胃肠动力障碍模型，筛选病理状态下枳壳入血成分的原型，进一步筛选具有健胃活性的有效成分群；
(5)基于步骤(4)所得入血成分原型，将入血成分进行体外活性评价，以乙酰胆碱酯酶为消化不良靶点，评价入血成分对于胃源乙酰胆碱酯酶的抑制活力，从而得出枳壳质量标志物。
2.根据权利要求1所述的一种筛选枳壳质量标志物的方法，其中步骤(3)采用对健康大鼠分别给予溶媒和枳壳提取物，比较入血成分差别，从而得到枳壳入血成分原型。
3.根据权利要求1所述的一种筛选枳壳质量标志物的方法，其中步骤(5)以乙酰胆碱酯酶为消化不良靶点，评价入血成分对于胃源乙酰胆碱酯酶的抑制活力。
4.一种代表枳壳健胃药效的有效成分群，其包括新橙皮苷、柚皮苷、川陈皮素、柚皮素、橙皮内酯和异橙皮内酯。
5.权利要求4所述的代表枳壳健胃药效的有效成分群的筛选方法，其特征在于该方法包括下述步骤：
(1)基于文献报道和TCMSP整理枳壳中的小分子化合物信息，采用以高分辨质谱为基础的分子网络技术分析枳壳的化学成分，建立枳壳的小分子化合物库；
(2)基于代谢组学比较江西道地枳壳优于非道地枳壳的差异性化学成分；
(3)采用中药血清药物化学筛选枳壳入血成分的原型，系统筛选具有健胃活性的有效成分群；
(4)采用阿托品诱导的胃肠动力障碍模型，筛选病理状态下枳壳入血成分的原型，进一步筛选得到具有健胃活性的有效成分群。
6.权利要求4所述的代表枳壳健胃药效的有效成分群作为枳壳的质量标志物在枳壳药材质量评价中的应用。
7.一种枳壳质量标志物，其特征在于所述枳壳质量标志物为代表枳壳健胃活性的有效成分群，其由下述方法制备而得：
(1)基于文献报道和TCMSP整理枳壳中的小分子化合物信息，采用以高分辨质谱为基础的分子网络技术分析枳壳的化学成分，建立枳壳的小分子化合物库；
(2)基于代谢组学比较江西道地枳壳优于非道地枳壳的差异性化学成分；
(3)采用中药血清药物化学筛选枳壳入血成分的原型，系统筛选具有健胃活性的有效成分群；
(4)采用阿托品诱导的胃肠动力障碍模型，筛选病理状态下枳壳入血成分的原型，进一步筛选具有健胃活性的有效成分群；
(5)基于步骤(4)所得入血成分原型，将入血成分进行体外活性评价，以乙酰胆碱酯酶为消化不良靶点，评价入血成分对于胃源乙酰胆碱酯酶的抑制活力，从而得出枳壳质量标志物。
8.如权利要求7所述的枳壳质量标志物，其特征在于所述的江西枳壳和非道地枳壳的差异性化学成分为黄酮类和香豆素类成分，所述的入血成分原型包括黄酮类和香豆素类成分，所述的黄酮类成分包括新橙皮苷、柚皮苷、川陈皮素和柚皮素；所述的香豆素类成分包括橙皮内酯和异橙皮内酯；所述的具有健胃活性的有效成分群包括新橙皮苷、柚皮苷、川陈皮素、柚皮素、橙皮内酯和异橙皮内酯。
9.权利要求7或8所述的枳壳质量标志物在枳壳药材质量评价中的应用。
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