CN107389813B - 基于化学分类法及UPLC-Tof-MS鉴别青皮、陈皮、枳实和枳壳的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物检测技术领域，具体涉及到一种基于化学分类法及UPLC‑Tof‑MS鉴别青皮、陈皮、枳实和枳壳的方法。与现有技术相比，本发明所述的基于化学分类法及UPLC‑Tof‑MS鉴别青皮、陈皮、枳实和枳壳的方法借助代谢组学技术高通量的样本分析能力及强大的数理统计方法，寻找不同品种及生长阶段组别内/间相互区分的化学成分标记物，以进行合理的化学分类，这有助于将抽象的功效描述通过代谢物的定性定量差异客观的表达出来，进而反推中药发挥不同功效的可能作用机理，揭示不同橘属中药的物质基础，为建立新型中药质量评价体系提供方法学参考。

Description

基于化学分类法及UPLC-Tof-MS鉴别青皮、陈皮、枳实和枳壳 的方法

技术领域

本发明属于药物检测技术领域，具体涉及到一种基于化学分类法及UPLC-Tof-MS鉴别青皮、陈皮、枳实和枳壳的方法。

背景技术

芸香科(Rutaceae)橘属(Citrus)是世界第一大果树品种，在世界百果中，其种植面积和产量均居首位，橘属植物是国内外食品学、营养学及药学领域研究的热点。在世界140多个国家和地区都有栽培，主要集中在巴西、中国、美国以及地中海沿岸的国家，我国共有20个省(市)有橘属植物栽培，其种植面积和产量均居世界第一。橘属植物的鲜果即可直接食用具有很高营养价值，其提取物又可作为化妆品工业中的香料或食品添加剂。橘属植物中含有黄酮类、香豆素类、挥发油类及生物碱类等成分，其中丰富的可食用黄酮类成分，例如黄烷酮类及多甲氧基黄酮类等为该属植物中的特征性成分，并且该类成分表现出较强的抗氧化、抗癌、抗炎、抗衰老、抗过敏或心脑血管保护作用，很多国家将该属植物作为营养品、保健品或直接作为药用。

陈皮、青皮、枳实和枳壳是来源于芸香科(Rutaceae)橘属(Citrus)植物，均为常用中药。陈皮、青皮分别为橘Citrus reticulata Blanco及栽培变种的干燥成熟果皮、干燥幼果或未成熟果实的果皮以及干燥外层果皮，枳实为酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种或甜橙Citrus sinensis Osbeck的干燥幼果，枳壳为酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种的干燥未成熟果实。陈皮和青皮、枳实和枳壳为同一植物的不同生长阶段，且这四种中药来源于不同植物。四种中药均属常用理气药，功效相近却略有不同。而在《中国药典》2015版中，枳实测定辛弗林、枳壳测定柚皮苷、新橙皮苷、陈皮和青皮均检测橙皮苷，这些成分虽为有效成分，但是并非橘属专有，且无法区分来源于同一植物不同生长阶段的亲缘中药。仅选择几个相同的指标性成分不能实现对橘属不同中药的质量控制，且无法全面、客观反映不同中药功效差异的物质基础。

而对橘属不同品种枳实成分代谢物的系统研究中发现，黄酮类及挥发油类成分在不同品种中的分布存在显著差异，并且建立了通过成分标记物进行品种鉴别的快速识别模式。有研究报，黄烷酮类及多甲氧基黄酮类成分在橘属中药不同药用部位分布存在差异，生物碱类成分在橘属中药从幼果到成熟的过程中含量降低。由于受常规分离方法所限，传统的提取分离结构鉴定方法，研究周期较长、需要大量人力物力，分离过程中具有一定的盲目性，会产生大量的重复性工作，且对于微量成分信息的获取能力有限，很难快速而全面的体现植物中整体成分的结构信息。然而，中药是一个复杂体系，化学成分和药效作用之间存在复杂的相关性，既有正相关，也有负相关，化学成分之间还存在协同和拮抗作用。尤其是亲缘或来源较近但临床应用不同的中药，其成分群及目前未知的成分或微量成分间，质与量的差异很可能就是影响功效的关键成分。因此，全面、快速、准确获取橘属中药药效物质差异，是揭示其功效差异的前提。

化学分类法是近年来随着高效液相色谱技术发展而快速发展起来的新型分类方法，与传统的分类方法相比具有明显的优势。传统的分类方法有基于表型性状的形态学分类法和基于DNA序列的基因分类法，然而仅用这两种分类方法很难对于中药进行合理的质量控制，例如，来源于同一物种不同生长阶段的中药几乎不能通过基因分类法进行鉴别，而橘属中药青皮/陈皮，枳实/枳壳均为来源于同一基源而不同生长阶段。基于植物代谢物多样性的化学分类学分类则提供了更有效的，可以用于鉴别植物生长阶段。代谢物是对遗传和酶调节的生物合成的反应的终产物，据估计，植物中的代谢物超过200000种，每种植物都有自己的化学形态，可用于进行更精密的分类方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于化学分类法及UPLC-Tof-MS鉴别青皮、陈皮、枳实和枳壳的方法。

本发明所述的一种基于化学分类法及UPLC-Tof-MS鉴别青皮、陈皮、枳实和枳壳的方法，所述方法具体步骤包括：

1)样品的制备

非极性样品制备：取多份来自来不同产地的青皮、陈皮、枳实和枳壳药材，分别粉碎并过筛子，精密称取样品，置于具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇，称定重量，超声处理；放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

极性样品制备：精密称取上述药材，置于塞锥形瓶中，精密加入水，称定重量，超声处理；放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

2)代谢产物测定

色谱条件：

①非极性样品：ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；流动相0.1％甲酸水(记为A)-含0.1％甲酸的乙腈(记为B)，梯度洗脱(0～2min，0～20％B；2～7min，50％B；7～11min，50～100％B；11～14.01min，100～100％B)，流速0.30ml/min，柱温45℃；

②极性样品：ACQUITY UPLC BEH HILIC色谱柱；流动相0.1％甲酸水(记为A)-含0.1％甲酸的乙腈(记为B)，洗脱梯度为：0～1min，99％B；1～10min，70％B；10～15min，99％B；

质谱条件：

采用Xevo G2QTof Mass system，电子源温度为100℃，锥形气流量为25.0L/H，去溶剂化气体温度为400℃，去溶剂化气体流量为800.0L/H，毛细管电压设置为3.0kV，锥电压设置为40V；质谱数据的扫描范围为50～1200m/z，扫描时间为0.1s，在15分钟内的扫描延迟时间为0.014s；

样品测定：

取非极性样品和极性样品分别进样；对每份样品中的色谱峰，选择性进行定量及定性；定性时，通过被检测化学成分MS裂解特征，分子式信息，明确解析其结构，并以标准品进行验证；

3)结果及分析

鉴定初级代谢产物；鉴定次级代谢产物；

从UPLC-Q-TOF/MS系统得到的数据采用Progenesis QI软件进行处理，PCA、PLA-DA分析采用SIMCA-P软件进行处理，热图、ROC曲线及Pathway分析用MetaboAnalyst网站完成，显著性检验采用SPSS软件，组间差异以p＜0.05为显著性标准；

将初级代谢产物的含量设定为变量，将上述4种样品的不同批次作为观察值，得到得分散点图；根据PCA得分图，所有青皮和陈皮样品聚集在小区域中并且可以与枳实和枳壳样品分离；即初级代谢产物的HCA聚类分析图能分清C.aurantium L.和C.reticulateBlanco组；

次级代谢产物对于植物的生长阶段很敏感，可用PCA图、PLS-DA图及S-plot图用来寻找可靠的可用于鉴别不同品种及不同生长阶段的橘属植物的次级代谢产物，使用次级代谢产物对橘属植物进行化学分类学分组时，可以很清楚的分成青皮、陈皮、枳实、枳壳4个分支。

本发明所述的一种基于化学分类法及UPLC-Tof-MS鉴别青皮、陈皮、枳实和枳壳的方法，所述方法具体步骤包括：

1)样品的制备

非极性样品制备：取多份来自来不同产地的青皮、陈皮、枳实和枳壳药材，分别粉碎并过60孔的筛子，精密称取样品1.0克，置于具塞锥形瓶中，精密加入10mL 50％甲醇，称定重量，超声处理10min；放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

极性样品制备：精密称取上述药材1.0克，置于塞锥形瓶中，精密加入10mL水，称定重量，超声处理10min；放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

2)代谢产物测定

色谱条件：

①非极性样品：ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；流动相0.1％甲酸水(记为A)-含0.1％甲酸的乙腈(记为B)，梯度洗脱(0～2min，0～20％B；2～7min，50％B；7～11min，50～100％B；11～14.01min，100～100％B)，流速0.30ml/min，柱温45℃；

②极性样品：ACQUITY UPLC BEH HILIC色谱柱；流动相0.1％甲酸水(记为A)-含0.1％甲酸的乙腈(记为B)，洗脱梯度为：0～1min，99％B；1～10min，70％B；10～15min，99％B；

质谱条件：

采用Xevo G2 QTof Mass system，电子源温度为100℃，锥形气流量为25.0L/H，去溶剂化气体温度为400℃，去溶剂化气体流量为800.0L/H，毛细管电压设置为3.0kV，锥电压设置为40V；质谱数据的扫描范围为50～1200m/z，扫描时间为0.1s，在15分钟内的扫描延迟时间为0.014s；

样品测定：

取非极性样品和极性样品分别进样；对每份样品中的色谱峰，选择性进行定量及定性；定性时，通过被检测化学成分MS裂解特征，分子式信息，明确解析其结构，并以标准品进行验证；

3)结果及分析

共鉴定88个初级代谢产物，具体信息见表：

共鉴定79种次级代谢产物，具体见表：

脚注：*被标准品确认^a青皮/陈皮组比较^b枳实/枳壳组比较^cCitrus reticulateBlanco.及Citrus aurantium L.组比较

从UPLC-Q-TOF/MS系统得到的数据采用Progenesis QI软件进行处理，PCA、PLA-DA分析采用SIMCA-P 13.0软件进行处理，热图、ROC曲线及Pathway分析用MetaboAnalyst 3.0网站完成，显著性检验采用SPSS 22.0软件，组间差异以p＜0.05为显著性标准；

将88种初级代谢产物的含量设定为变量，将上述4种样品的不同批次作为观察值，得到得分散点图；根据PCA得分图，所有青皮和陈皮样品聚集在小区域中并且可以与枳实和枳壳样品分离；即初级代谢产物的HCA聚类分析图能分清C.aurantium L.和C.reticulateBlanco组；

次级代谢产物对于植物的生长阶段很敏感，可用PCA图、PLS-DA图及S-plot图用来寻找可靠的可用于鉴别不同品种及不同生长阶段的橘属植物的次级代谢产物，使用79个次级代谢产物对37个橘属植物进行化学分类学分组时，可以很清楚的分成青皮、陈皮、枳实、枳壳4个分支。

与现有技术相比，本发明所述的基于化学分类法及UPLC-Tof-MS鉴别青皮、陈皮、枳实和枳壳的方法借助代谢组学技术高通量的样本分析能力及强大的数理统计方法，寻找不同品种及生长阶段组别内/间相互区分的化学成分标记物，以进行合理的化学分类，这有助于将抽象的功效描述通过代谢物的定性定量差异客观的表达出来，进而反推中药发挥不同功效的可能作用机理，揭示不同橘属中药的物质基础，为建立新型中药质量评价体系提供方法学参考。

附图说明

图1：陈皮、青皮、枳实和枳壳的代谢轮廓图；1A-枳实、1B-枳壳、1C-青皮、1D-陈皮。图2：初级代谢产物的PCA得分图。图3：次级代谢产物的多变量统计分析图；3A-PCA图、3B-PLS-DA、3C-S-plot图、3D-交叉验证分析图。图4：次级代谢产物的热图。图5：橘属植物的HCA图；5A-初级代谢产物的HCA聚类分析图、5B-橘属植物分支图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明所述的基于化学分类法及UPLC-Tof-MS鉴别青皮、陈皮、枳实和枳壳的方法做进一步说明，但是本发明的保护范围并不限于此。

实施例1

1实验方法

1.1橘属植物样品前期准备

1.1.1橘属植物样品准备

根据2015版中国药典收载的四种橘属中药品种来源描述，参考市场流通情况收集道地产地样品，进行原植物品种基源鉴定，并分类整理留样(见表1)。

表1 37个橘属植物样品信息表

1.1.2橘属植物标准品准备

实验共使用标准品35个，具体情况见表2。

表2标准品信息表

1.1.3样品的制备

非极性样品制备：粉碎并过60孔的筛子，精密称取样品1.0克，置于具塞锥形瓶中，精密加入10mL 50％甲醇，称定重量，超声处理10min，共3次。放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。样品均平行制备3次。

极性样品制备：精密称取上述样品1.0克，置于塞锥形瓶中，精密加入10mL水，称定重量，超声处理10min，共3次。放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。样品均平行制备3次。

1.2建立基于UPLC-Tof-MS的四种橘属植物代谢组学研究方法

1.2.1仪器

使用Waters公司的ACQUITY UPLC系统(Waters Corp.Milford,USA)，TCQ-250型超声波清洗器(北京医疗设备二厂)，陈皮225D型电子天平(德国赛多利斯公司)。

1.2.2色谱条件与质谱条件

色谱条件：

(1)非极性样品：ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；流动相0.1％甲酸水(A)-乙腈(含0.1％甲酸)(B)梯度洗脱(0～2min，0～20％B；2～7min，50％B；7～11min，50～100％B；11～14.01min，100～100％B)流速0.30ml/min，柱温45℃。

(2)极性样品：ACQUITY UPLC BEH HILIC色谱柱；流动相同非极性样品条件，洗脱梯度为：0～1min，99％B；1～10min，70％B；10～15min，99％B。

质谱条件：

采用Xevo G2 QTof Mass system，电子源温度为100℃，锥形气流量为25.0L/H，去溶剂化气体温度为400℃，去溶剂化气体流量为800.0L/H，毛细管电压设置为3.0kV，锥电压设置为40V。质谱数据的扫描范围为50～1200m/z，扫描时间为0.1s，在15分钟内的扫描延迟时间为0.014s。

1.2.3对照品溶液的制备

精密称取各对照品适量，加甲醇制成相应浓度的对照品储备液，分别取各对照品储备液适量，混合，加甲醇制成相应的混合对照品溶液。

1.2.4数据处理

从UPLC-Q-TOF/MS系统得到的数据采用Progenesis QI软件进行处理，PCA、PLA-DA分析采用SIMCA-P 13.0软件进行处理，热图、ROC曲线及Pathway分析用MetaboAnalyst 3.0网站完成，显著性检验采用SPSS 22.0软件，组间差异以p＜0.05为显著性标准。

1.2.5方法学考察

精密度考察：精密吸取低、中、高浓度的混标溶液，在同一日内连续进样6次，并在连续3日内进样3次，测得各成分峰面积积分值的RSD值，结果见表3和表4。

重现性考察：取样品粉末约0.50g，5份，精密称定，按2.1.3项下方法制备成供试品溶液，分别进行测定，计算含量，结果见表3和表4。

稳定性考察：取样品粉末约0.50g，5份，精密称定，按2.1.3项下方法制备成供试品溶液，在制备后0，2，4，6，8，10，12，24h进样，测得各成分的RSD值见表3和表4，符合要求，表明供试品溶液在24h内稳定。

表3 UPLC-Q-tof系统及ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱方法学考察

表4 UPLC-Q-tof系统及ACQUITY UPLC BEH HILIC色谱柱方法学考察

1.2.6建立四种橘属植物的成分代谢轮廓图

分别取不同批次的四种橘属植物(青皮、陈皮、枳实和枳壳)，按照2.1.3项下制备供试品，可得到其成分的代谢轮廓图，见图1.

2结果与讨论

通过被检测化学成分质谱裂解特征，分子式信息，必要时辅以NMR测定，明确解析其结构，并以标准品进行验证。

2.1初级代谢产物的鉴别

在本实验中，共鉴定88个初级代谢产物，包括13个甘油磷脂酸(GPA)，13个MG，6个甘油磷脂酰乙醇胺(GPEtn)，3个甘油磷脂酰肌醇(GPIns)，3个甘油磷脂酰丝氨酸(GPSer)，1个磷脂酰甘油(GPGro)，8个甘油二酯(DG)，非双层脂单半乳糖甘油二脂(MGDG)，二半乳糖二甘油酯(DGDG)和硫代异鼠李糖甘油二酯(SQDG)，10磷脂酰乙醇胺(PE)，5个氨基酸，3个酚酸，2个核苷，2个有机酸和一些其他初级代谢产物，所有初级代谢产物的鉴别是通过其保留时间，精确分子量和二级质谱在HMDB数据库(http://www.hmdb.ca/)和LMSD(http://www.lipidmaps.org/)代谢组学数据库中查找得到的，具体数据见表5和表6。

主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)，是考察多个变量间相关性一种多元统计方法，研究如何通过少数几个主成分来揭示多个变量间的内部结构，即从原始变量中导出少数几个主成分，使它们尽可能多地保留原始变量的信息，且彼此间互不相关。通常数学上的处理就是将原来的多个指标作线性组合，作为新的综合指标。将这88种初级代谢产物的含量设定为变量，将37个样品批次作为观察值。得分散点图如图2所示，前两个主成分占方差的75.2％。根据PCA得分图，所有青皮和陈皮样品聚集在小区域中并且可以与枳实和枳壳样品分离，而来自相同物种的青皮和陈皮以及枳实和枳壳样品不能进一步分开。从这个结果，初级代谢产物可以很容易地聚类不同种类的橘属药材。

表5初级代谢产物列表(对于Citrus reticulate Blanco.及Citrus aurantiumL.对比中药时曲线下面积(AUC)值大于0.85)

表6余下的初级代谢产物

2.2次级代谢产物的鉴别

次级代谢产物主要采用PCA、PLS-DA及S-plot图和VIP值等方法寻找，偏最小二乘法判别分析(Partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)是一种用于判别分析的多变量统计分析方法。判别分析是一种根据观察或测量到的若干变量值，来判断研究对象如何分类的常用统计分析方法。其原理是对不同处理样本(如观测样本、对照样本)的特性分别进行训练，产生训练集，并检验训练集的可信度。变量重要性投影(Variableinfluence on projection,VIP)用来测度每一个自变量在系统分析中的作用，即每一个自变量对解释因变量的作用重要性。在本实验中，PCA图(图3A)、PLS-DA图(图3B)及S-plot图(图3C)用来寻找可靠的可用于鉴别不同品种及不同生长阶段的橘属植物的次级代谢产物。同时，交叉验证分析显示，R²和Q²截距分别为0.487和0.894，从而证明PLS-DA模型是可靠的(图3D)。根据保留时间，精确质量，二级质谱和代谢组学数据库进行推测后，共有79种次级代谢产物被确定，其中35种已经被标准品确认，具体可见表7。

本实验还采用热图以显示橘属样品中差异代谢物的变化，热图是通过使用不同的标志将图或页面上的区域按照受关注程度的不同加以标注并呈现的一种分析手段，标注的手段一般采用颜色的深浅、点的疏密以及呈现比重的形式，使数据更加清晰的表现出来。红色框表示代谢物大于样品中的平均水平，而蓝色框则表示代谢物处于较低水平。

表7次级代谢产物列表

脚注：*被标准品确认^a青皮/陈皮组比较^b枳实/枳壳组比较^cCitrus reticulateBlanco.及Citrus aurantium L.组比较

2.3构建橘属植物的化学分类法方法

本实验采用层序聚类分析(Hierarchical Cluster Analysis,HCA)探究橘属植物的化学分类方法。聚类分析指将物理或抽象对象的集合分组为由类似的对象组成的多个类的分析过程，在相似的基础上收集数据来分类。从结果来看，初级代谢产物的HCA聚类分析图(图5A)可以很清晰的分离开C.aurantium L.和C.reticulate Blanco组，然而，并不能清晰的分离青皮陈皮这种因为生长阶段不同而区别的药材，由此可知，初级代谢产物的分组主要是植物的基因型分组而不是其生长阶段的分组。

如前面的研究所示，次级代谢产物对于植物的生长阶段很敏感。因此，使用79个次级代谢产物对37个橘属植物进行化学分类学分组时，可以很清楚的分成4个分支(青皮、陈皮、枳实、枳壳)(图5B)，与初级代谢物相比，次级代谢物的HCA结果显示了基于化学型分类方法的不同结果，反映了次级代谢物如何在橘属植物不同生长阶段的化学分类学分类中起重要作用。

Claims (2)

1.一种基于化学分类法及UPLC-Tof-MS鉴别青皮、陈皮、枳实和枳壳的方法，其特征在于，所述方法具体步骤包括：

1样品的制备

非极性样品制备：取多份来自来不同产地的青皮、陈皮、枳实和枳壳药材，分别粉碎并过筛子，精密称取样品，置于具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇，称定重量，超声处理；放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

极性样品制备：精密称取上述药材，置于塞锥形瓶中，精密加入水，称定重量，超声处理；放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

2代谢产物测定

色谱条件：

1)非极性样品：ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；流动相为记为A的0.1％甲酸水-记为B的含0.1％甲酸的乙腈，梯度洗脱为：0～2min，0～20％B；2～7min，50％B；7～11min，50～100％B；11～14.01min，100～100％B，流速0.30ml/min，柱温45℃；

2)极性样品：ACQUITY UPLC BEH HILIC色谱柱；流动相为记为A的0.1％甲酸水-记为B的含0.1％甲酸的乙腈，洗脱梯度为：0～1min，99％B；1～10min，70％B；10～15min，99％B；

质谱条件：

采用Xevo G2 QTof Mass system，电子源温度为100℃，锥形气流量为25.0L/H，去溶剂化气体温度为400℃，去溶剂化气体流量为800.0L/H，毛细管电压设置为3.0kV，锥电压设置为40V；质谱数据的扫描范围为50～1200m/z，扫描时间为0.1s，在15分钟内的扫描延迟时间为0.014s；

样品测定：

取非极性样品和极性样品分别进样；对每份样品中的色谱峰，选择性进行定量及定性；定性时，通过被检测化学成分MS裂解特征，分子式信息，明确解析其结构，并以标准品进行验证；

3结果及分析

鉴定初级代谢产物；鉴定次级代谢产物；

从UPLC-Q-TOF/MS系统得到的数据采用Progenesis QI软件进行处理，PCA、PLA-DA分析采用SIMCA-P软件进行处理，热图、ROC曲线及Pathway分析用MetaboAnalyst网站完成，显著性检验采用SPSS软件，组间差异以p＜0.05为显著性标准；

将初级代谢产物的含量设定为变量，将上述4种样品的不同批次作为观察值，得到得分散点图；根据PCA得分图，所有青皮和陈皮样品聚集在小区域中并且可以与枳实和枳壳样品分离；即初级代谢产物的HCA聚类分析图能分清C.aurantium L.和C.reticulate Blanco组；

次级代谢产物对于植物的生长阶段很敏感，可用PCA图、PLS-DA图及S-plot图用来寻找可靠的可用于鉴别不同品种及不同生长阶段的橘属植物的次级代谢产物，使用次级代谢产物对橘属植物进行化学分类学分组时，可以很清楚的分成青皮、陈皮、枳实、枳壳4个分支。

2.根据权利要求1所述的基于化学分类法及UPLC-Tof-MS鉴别青皮、陈皮、枳实和枳壳的方法，其特征在于，所述方法具体步骤包括：

1样品的制备

非极性样品制备：取多份来自来不同产地的青皮、陈皮、枳实和枳壳药材，分别粉碎并过60孔的筛子，精密称取样品1.0克，置于具塞锥形瓶中，精密加入10mL 50％甲醇，称定重量，超声处理10min；放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

极性样品制备：精密称取上述药材1.0克，置于塞锥形瓶中，精密加入10mL水，称定重量，超声处理10min；放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

2代谢产物测定

色谱条件：

1)非极性样品：ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；流动相为记为A的0.1％甲酸水-记为B的含0.1％甲酸的乙腈，梯度洗脱为：0～2min，0～20％B；2～7min，50％B；7～11min，50～100％B；11～14.01min，100～100％B，流速0.30ml/min，柱温45℃；

2)极性样品：ACQUITY UPLC BEH HILIC色谱柱；流动相为记为A的0.1％甲酸水-记为B的含0.1％甲酸的乙腈，洗脱梯度为：0～1min，99％B；1～10min，70％B；10～15min，99％B；

质谱条件：

采用Xevo G2 QTof Mass system，电子源温度为100℃，锥形气流量为25.0L/H，去溶剂化气体温度为400℃，去溶剂化气体流量为800.0L/H，毛细管电压设置为3.0kV，锥电压设置为40V；质谱数据的扫描范围为50～1200m/z，扫描时间为0.1s，在15分钟内的扫描延迟时间为0.014s；

样品测定：

取非极性样品和极性样品分别进样；对每份样品中的色谱峰，选择性进行定量及定性；定性时，通过被检测化学成分MS裂解特征，分子式信息，明确解析其结构，并以标准品进行验证；

3结果及分析

共鉴定88个初级代谢产物，具体信息见表：

共鉴定79种次级代谢产物，具体见表：

脚注：*被标准品确认^a青皮/陈皮组比较^b枳实/枳壳组比较^c Citrus reticulateBlanco.及Citrus aurantium L.组比较

从UPLC-Q-TOF/MS系统得到的数据采用Progenesis QI软件进行处理，PCA、PLA-DA分析采用SIMCA-P13.0软件进行处理，热图、ROC曲线及Pathway分析用MetaboAnalyst3.0网站完成，显著性检验采用SPSS22.0软件，组间差异以p＜0.05为显著性标准；

将88种初级代谢产物的含量设定为变量，将上述4种样品的不同批次作为观察值，得到得分散点图；根据PCA得分图，所有青皮和陈皮样品聚集在小区域中并且可以与枳实和枳壳样品分离；即初级代谢产物的HCA聚类分析图能分清C.aurantium L.和C.reticulateBlanco组；

次级代谢产物对于植物的生长阶段很敏感，可用PCA图、PLS-DA图及S-plot图用来寻找可靠的可用于鉴别不同品种及不同生长阶段的橘属植物的次级代谢产物，使用79个次级代谢产物对37个橘属植物进行化学分类学分组时，可以很清楚的分成青皮、陈皮、枳实、枳壳4个分支。