CN113030325A - 枳壳及麸炒枳壳的特征图谱构建方法及鉴别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种枳壳及麸炒枳壳的特征图谱构建方法及鉴别方法。所述鉴别方法包括如下步骤：待测样品溶液制备：取待测样品，加入提取溶剂进行提取，制备所述待测样品溶液；检测：以超高效液相色谱法对所述待测样品溶液进行检测，将检测所得图谱与所述构建方法构建获得的枳壳的特征图谱，或所述构建方法构建获得的麸炒枳壳的特征图谱进行比较；所述超高效液相色谱法采用的流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.03％～0.07％的磷酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱。该枳壳及麸炒枳壳的特征图谱构建方法，归属了枳壳与麸炒枳壳11个共有峰，同时指认8个化学成分(包括黄酮苷类和脂溶性成分)并进行测定，且检测效率高。

Description

枳壳及麸炒枳壳的特征图谱构建方法及鉴别方法
技术领域
本发明涉及中药检测技术领域，特别是涉及一种枳壳及麸炒枳壳的特征图谱构建方法及鉴别方法、多指标含量检测方法。
背景技术
据《中国药典》2020年版记载，枳壳为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种的干燥未成熟果实。7月果皮尚绿时采收，自中部横切为两半，晒干或低温干燥。枳壳之名始见于唐甄权《药性论》，宋《开宝本草》收载之，列于木部中品。味苦、辛、酸。性微寒。归脾、胃经。具有理气宽中，行滞消胀之功效。用于胸胁气滞，胀满疼痛，食积不化，痰饮内停，脏器下垂。枳壳是中药典型的理气药之一，广泛应用于中医临床。枳壳主要活性成分包括黄酮苷类，如芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷，以及脂溶性成分，如水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素、橘红素等。枳壳的炮制方法主要有麸炒、炒黄、炒焦、蜜制和盐制。其中加辅料制以麸炒的方法沿用时间最长，应用最多，旨在达到“去燥性而和胃”的目的。
2020年版《中华人民共和国药典》采用HPLC法，以柚皮苷和新橙皮苷作为定量指标来控制枳壳的质量，该法不能全面反映枳壳的质量。有方法以枳壳为对象，研究准确反映药材内在整体质量的分析方法，采用色谱分析法建立枳壳的化学特征(指纹)图谱，同时选择关键成分柚皮苷建立含量测定方法，从特征(指纹)图谱相似度与关键成分含量限度两方面同时入手，评价枳壳药材质量。还有方法通过采用HPLC法对枳壳黄酮苷类成分进行分离检测。另有研究认为枳壳麸炒可降低挥发油的含量，去除刺激成分、缓和燥性，但黄酮苷类成分含量变化趋势尚有争议。
但是上述方法均存在检测耗时长、黄酮苷类成分检测并不充分等缺陷，难以全面、高效地进行枳壳及麸炒枳壳的检测和鉴别。
发明内容
基于此，本发明提供一种枳壳及麸炒枳壳的特征图谱构建方法及鉴别方法、多指标含量检测方法。该枳壳及麸炒枳壳的特征图谱构建方法，归属了枳壳与麸炒枳壳11个共有峰，同时指认8个化学成分(包括黄酮苷类和脂溶性成分)并进行测定，且检测效率高。
具体技术方案如下：
本发明的一方面，一种枳壳的特征图谱构建方法，包括如下步骤：
对照品溶液和供试品溶液制备：取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素和橘红素对照品，以溶剂溶解，制备所述对照品溶液；取枳壳，加入提取溶剂进行提取，制备所述供试品溶液；
检测：以超高效液相色谱法对所述对照品溶液和供试品溶液进行检测；
所述超高效液相色谱法采用的流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.03％～0.07％的磷酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱。
在其中一个实施例中，所述梯度洗脱包括如下程序：
0min～7min，流动相A的体积分数由15％上升至25％，流动相B的体积分数由85％下降至75％；
7min～8min，流动相A的体积分数由25％上升至40％，流动相B的体积分数由75％下降至60％；
8min～10min，流动相A的体积分数由40％上升至45％，流动相B的体积分数由60％下降至55％；
10min～13min，流动相A的体积分数由45％上升至60％，流动相B的体积分数由55％下降至40％；
13min～15min，流动相A的体积分数由60％下降至15％，流动相B的体积分数由40％上升至85％。
在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱法还包括如下检测条件：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流速为0.2mL/min～0.6mL/min，柱温为25℃～40℃，检测波长为310nm～330nm。
在其中一个实施例中，所述提取溶剂为甲醇，所述提取的方法为回流提取。
本发明的另一方面，提供一种麸炒枳壳的特征图谱构建方法，包括如下步骤：
对照品溶液和供试品溶液制备：取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素和橘红素对照品，以溶剂溶解，制备所述对照品溶液；取麸炒枳壳，加入提取溶剂进行提取，制备所述供试品溶液；
检测：以超高效液相色谱法对所述对照品溶液和供试品溶液进行检测；
所述超高效液相色谱法采用的流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.03％～0.07％的磷酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱。
在其中一个实施例中，所述梯度洗脱包括如下程序：
0min～7min，流动相A的体积分数由15％上升至25％，流动相B的体积分数由85％下降至75％；
7min～8min，流动相A的体积分数由25％上升至40％，流动相B的体积分数由75％下降至60％；
8min～10min，流动相A的体积分数由40％上升至45％，流动相B的体积分数由60％下降至55％；
10min～13min，流动相A的体积分数由45％上升至60％，流动相B的体积分数由55％下降至40％；
13min～15min，流动相A的体积分数由60％下降至15％，流动相B的体积分数由40％上升至85％。
在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱法还包括如下检测条件：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流速为0.2mL/min～0.6mL/min，柱温为25℃～40℃，检测波长为310nm～330nm。
在其中一个实施例中，所述提取溶剂为甲醇，所述提取的方法为回流提取。
本发明的再一方面，提供一种枳壳和麸炒枳壳的鉴别方法，包括如下步骤：
待测样品溶液制备：取待测样品，加入提取溶剂进行提取，制备所述待测样品溶液；
检测：以超高效液相色谱法对所述待测样品溶液进行检测，将检测所得图谱与所述构建方法构建获得的枳壳的特征图谱，或所述构建方法构建获得的麸炒枳壳的特征图谱进行比较；
所述超高效液相色谱法采用的流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.03％～0.07％的磷酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱。
在其中一个实施例中，所述梯度洗脱包括如下程序：
0min～7min，流动相A的体积分数由15％上升至25％，流动相B的体积分数由85％下降至75％；
7min～8min，流动相A的体积分数由25％上升至40％，流动相B的体积分数由75％下降至60％；
8min～10min，流动相A的体积分数由40％上升至45％，流动相B的体积分数由60％下降至55％；
10min～13min，流动相A的体积分数由45％上升至60％，流动相B的体积分数由55％下降至40％；
13min～15min，流动相A的体积分数由60％下降至15％，流动相B的体积分数由40％上升至85％。
在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱法还包括如下检测条件：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流速为0.2mL/min～0.6mL/min，柱温为25℃～40℃，检测波长为310nm～330nm。
在其中一个实施例中，所述提取溶剂为甲醇，所述提取的方法为回流提取。
本发明的又一方面，提供一种枳壳或麸炒枳壳的多指标含量测定，包括如下步骤：
对照品溶液和待测品溶液制备：取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素和橘红素对照品，以溶剂溶解，分别制备不同浓度的对照品溶液；取待测样品，加入提取溶剂进行提取，制备所述待测品溶液；
检测：以超高效液相色谱法对所述不同浓度的对照品溶液进行检测，并建立线性方程，以超高效液相色谱法对所述待测品溶液进行检测，并将检测结果代入所述线性方程，获取所述待测样品中的芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素和橘红素的含量；
所述超高效液相色谱法采用的流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.03％～0.07％的磷酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱。
在其中一个实施例中，所述梯度洗脱包括如下程序：
0min～7min，流动相A的体积分数由15％上升至25％，流动相B的体积分数由85％下降至75％；
7min～8min，流动相A的体积分数由25％上升至40％，流动相B的体积分数由75％下降至60％；
8min～10min，流动相A的体积分数由40％上升至45％，流动相B的体积分数由60％下降至55％；
10min～13min，流动相A的体积分数由45％上升至60％，流动相B的体积分数由55％下降至40％；
13min～15min，流动相A的体积分数由60％下降至15％，流动相B的体积分数由40％上升至85％。
在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱法还包括如下检测条件：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流速为0.2mL/min～0.6mL/min，柱温为25℃～40℃，检测波长为310nm～330nm。
在其中一个实施例中，所述提取溶剂为甲醇，所述提取的方法为回流提取。
与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：
本发明采用UPLC法进行枳壳、麸炒枳壳的特征图谱的构建，归属了枳壳、麸炒枳壳的11个特征峰，且该11个特征峰为枳壳和麸炒枳壳所共有，因此既能够分别用于枳壳、麸炒枳壳的特征图谱质量检测，也能够用于枳壳和麸炒枳壳的鉴别。特别地，该特征图谱的构建方法构建获得的特征图谱的检测时间较传统方法的检测时间明显缩短(缩短50％以上)，较大地提高了检测或鉴别的效率。
另外，本发明还提供一种枳壳或麸炒枳壳的多指标含量检测方法，该检测方法采用的检测条件与前述特征图谱构建的检测条件相同，且能够指认8个化学成分并进行测定，分别是芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素和橘红素，以该8个成分作为含量指标，可以对枳壳或麸炒枳壳进行多指标含量测定，以更全面地评估枳壳或麸炒枳壳的质量，同时还能够比较枳壳炮制前后产生的差异，单独或与前述特征图谱检测相协同，为枳壳及麸炒枳壳的鉴别和质量检测提供更为全面的参考。
附图说明
图1为实施例1中枳壳和麸炒枳壳特征图谱PAD-3D横截面图；
图2为实施例1中枳壳和麸炒枳壳特征图谱波长选择色谱图；
图3为实施例1中枳壳和麸炒枳壳特征图谱不同流动相色谱图；
图4为实施例1中12批枳壳特征峰叠加图；
图5为实施例1中12批麸炒枳壳特征峰叠加图；
图6为实施例1中芸香柚皮苷对照品指认图，其中，左图为芸香柚皮苷对照品，右图为枳壳样品图；
图7为实施例1中柚皮苷对照品指认图，其中，左图为柚皮苷对照品，右图为枳壳样品图；
图8为实施例1中橙皮苷对照品指认图，其中，左图为橙皮苷对照品，右图为枳壳样品图；
图9为实施例1中新橙皮苷对照品指认图，其中，左图为新橙皮苷对照品，右图为枳壳样品图；
图10为实施例1中水合橙皮内酯对照品指认图，其中，左图为水合橙皮内酯对照品，右图为枳壳样品图；
图11为实施例1中马尔敏对照品指认图，其中，左图为马尔敏对照品，右图为枳壳样品图；
图12为实施例1中川陈皮素对照品指认图，其中，左图为川陈皮素对照品，右图为枳壳样品图；
图13为实施例1中橘红素对照品指认图，其中，左图为橘红素对照品，右图为枳壳样品图；
图14为实施例2中枳壳特征图谱对照图谱；
图15为实施例2麸炒枳壳特征图谱对照图谱。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的枳壳及麸炒枳壳的特征图谱构建方法及鉴别方法、多指标含量检测方法作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明所述“相同”并非指方法参数的绝对一致，而是指采用相同的技术方案，其具体的方法参数可以在技术方案的范围内容进行任意选择。
本发明所述“鉴别”既可以指对待测样品为枳壳还是麸炒枳壳进行判别区分，也可以指对待测样品进行检测，以确认其归属和质量情况。
如无特别说明，本发明实施例中的百分比均为体积百分比。
本发明的第一方面，提供一种枳壳的特征图谱构建方法，包括如下步骤：
对照品溶液和供试品溶液制备：取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素和橘红素对照品，以溶剂溶解，制备对照品溶液；取枳壳，加入提取溶剂进行提取，制备供试品溶液；可以理解地，对照品溶液和供试品溶液的制备并无特定的顺序要求；
检测：以超高效液相色谱法对对照品溶液和供试品溶液进行检测；
其中，超高效液相色谱法采用的流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.03％～0.07％的磷酸水溶液，优选流动相B为体积浓度为0.04％～0.06％的磷酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱。
在其中一个示例中，梯度洗脱包括如下程序：
0min～7min，流动相A的体积分数由15％上升至25％，流动相B的体积分数由85％下降至75％；
7min～8min，流动相A的体积分数由25％上升至40％，流动相B的体积分数由75％下降至60％；
8min～10min，流动相A的体积分数由40％上升至45％，流动相B的体积分数由60％下降至55％；
10min～13min，流动相A的体积分数由45％上升至60％，流动相B的体积分数由55％下降至40％；
13min～15min，流动相A的体积分数由60％下降至15％，流动相B的体积分数由40％上升至85％。
在其中一个示例中，超高效液相色谱法还包括如下检测条件：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流速为0.2mL/min～0.6mL/min，柱温为25℃～40℃，检测波长为310nm～330nm。作为优选地，流速为0.35mL/min～0.45mL/min。作为优选地，柱温为29℃～31℃。作为优选地，检测波长为315nm～325nm。进一步优选地，流速为0.4mL/min；柱温为30℃；检测波长为320nm。
在其中一个示例中，提取溶剂为甲醇，提取的方法为回流提取。进一步地，回流提取的时间为1h～2h；提取溶剂的用量为每1g枳壳加入200mL～300mL。
在其中一个示例中，先将枳壳制成枳壳粉末，再进行提取。
在其中一个示例中，制备对照品溶液采用的溶剂为甲醇。
在其中一个示例中，对照品溶液中，芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素和橘红素对照品的浓度分别为15～18μg/mL、88～92μg/mL、10～12μg/mL、30～32μg/mL、3～5μg/mL、0.5～2μg/mL、1～3μg/mL和2～3μg/mL。
在其中一个示例中，对照品溶液和/或供试品溶液的进样量为1μL～3μL。
上述枳壳的特征图谱构建方法，采用UPLC法进行检测，构建了具有11个特征峰的特征图谱，能够用于枳壳的质量检测。特别地，该特征图谱的构建方法构建获得的特征图谱的检测时间较传统方法的检测时间明显缩短(缩短50％以上)，较大地提高了检测或鉴别的效率。
本发明的第二方面，提供一种麸炒枳壳的特征图谱构建方法，其技术方案同前述枳壳的特征图谱构建方法，在此不再赘述。
本发明的第三方面，提供一种枳壳和麸炒枳壳的鉴别方法，其技术方案同前述枳壳的特征图谱构建方法，在此不再赘述。
需要进一步说明的是，由于枳壳和麸炒枳壳特征图谱构建的条件相同，且归属的11个特征峰为枳壳和麸炒枳壳所共有，因此该特征图谱构建方法构建获得的特征图谱既能够分别用于枳壳、麸炒枳壳的特征图谱质量检测，也能够用于枳壳和麸炒枳壳的鉴别。
本发明的第四方面，提供一种枳壳或麸炒枳壳的多指标含量测定，其技术方案同前述枳壳的特征图谱构建方法，在此不再赘述。该多指标含量测定方法能够指认8个化学成分并进行测定，分别是芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素和橘红素，以该8个成分作为含量指标，可以对枳壳或麸炒枳壳进行多指标含量测定，以更全面地评估枳壳或麸炒枳壳的质量，同时还能够比较枳壳炮制前后产生的差异，为枳壳及麸炒枳壳的鉴别和质量检测提供更为全面的参考。
可以理解地，前述本发明的四个方面可以分别进行以实现相应的技术效果，同时，由于检测条件相同，可以根据需要同时进行，以进行更为全面的枳壳和麸炒枳壳的质量检测和鉴别评估。
以下为具体的实施例。
实施例1枳壳与麸炒枳壳的特征图谱构建
1、仪器和试药
Waters H-Class型超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Agilent SB C18柱(100mm×2.1mm，1.8μm)；ME204E型万分之一分析天平，XP26型百万分之一分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；HWS28型恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)；Milli-Q Direct超纯水系统(默克股份有限公司)。
柚皮苷对照品(批号：110722-201714，含量93.4％)、新橙皮苷对照品(批号：111857-201804，含量99.4％)、橙皮苷对照品(批号：110721-201818，含量96.20％)，由中国食品药品检定研究院提供；芸香柚皮苷对照品(批号：wkq19041908，含量98.0％)、水合橙皮内酯对照品(批号：wkq20031904，含量98.0％)、川陈皮素对照品(批号：wkq20031701，含量98.0％)、橘红素对照品(批号：wkq16011401，含量98.6％)，由四川维克奇生物科技有限公司提供；马尔敏对照品(批号：CFS201901，含量98.0％)由Chem Face生物有限公司提供。甲醇为分析纯；磷酸、乙腈为色谱纯；水为超纯水。
本实验所用枳壳经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定，为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种的干燥未成熟果实；麸炒枳壳为实验室自制，样品信息见表1。
表1样品产地信息表
Figure BDA0002971233070000081
Figure BDA0002971233070000091
2、色谱条件的确定
2.1供试品溶液的制备 取样品(枳壳)粉末(过三号筛)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，回流提取1.5h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL，置25mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，即得。
2.2检测波长的确定 色谱柱为Agilent SB C18(100mm×2.1mm，1.8μm)，流速为0.40mL/min；以乙腈为流动相A，0.05％磷酸为流动相B，梯度洗脱为0～7min，由15％A变化至25％A；7～8min，由25％A变化至40％A；8～10min，由40％A变化至45％A；10～13min，由45％A变化至60％A；13～15min，由60％A变化至15％A；检测波长为全波长扫描；柱温30℃；进样量2μL。结果表明，指标成分柚皮苷和新橙皮苷的最大吸收波长为283nm，对全波长扫描的3D图的横截面图(见图1)进行分析，可以发现枳壳中各成分的吸收波长主要集中在210nm、283nm和320nm左右，比较210nm、254nm、283nm和320nm下的紫外色谱图(见图2)，320nm下的紫外色谱图峰个数最多，峰信息最全，综合考虑，最终选择320nm作为(枳壳或麸炒枳壳)特征图谱的检测波长。
2.3流动相优化 采用Agilent SB(100×2.1mm，1.8μm)色谱柱，分别考察流动相乙腈(A)-水(B)、乙腈(A)-0.05％磷酸水(B)、乙腈(A)-0.05％甲酸水(B)和乙腈(A)-0.05％乙酸水(B)为洗脱系统，色谱条件同2.2项，进样分析，结果表明(见图3)，流动相系统中添加酸，各峰的分离度优于不加酸，而添加不同的酸对各峰的分离度及峰型影响不大，但添加0.05％的磷酸峰型更优。最终选择乙腈-0.05％磷酸水溶液为洗脱溶剂。
3、方法与结果
3.1炮制方法 取枳壳片200g，按2015年版《中华人民共和国药典》麸炒枳壳下项规定进行炮制，具体步骤如下：取枳壳片，照麸炒法(通则0213)炒至色变深。形如枳壳片，色较深，偶有焦斑。符合2015年版《中华人民共和国药典》麸炒枳壳的性状特征。
3.2色谱条件 色谱柱为Agilent SB C18(100mm×2.1mm，1.8μm)，流速为0.40mL/min；以乙腈为流动相A，0.05％磷酸为流动相B，梯度洗脱为0～7min，由15％A变化至25％A；7～8min，由25％A变化至40％A；8～10min，由40％A变化至45％A；10～13min，由45％A变化至60％A；13～15min，由60％A变化至15％A；检测波长为320nm；柱温30℃；进样量2μL。
3.3对照品溶液的配制 取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素和橘红素对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为16.930μg/mL、90.094μg/mL、11.0803μg/mL、31.729μg/mL、3.459μg/mL、1.127μg/mL、2.197μg/mL、2.564μg/mL的混合对照品溶液。
3.4供试品溶液的制备 取样品(枳壳或麸炒枳壳)粉末(过三号筛)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，回流提取1.5h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL，置25mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，即得。
3.5.共有峰归属 按照“3.4”项下制备供试品溶液，按“3.2”项下色谱条件进行测定分析。
采用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.0版本)”分别对Z1-Z12批枳壳样品、F1-F12麸炒枳壳样品的UPLC特征图谱进行数据处理，分别以Z1、F1为参照，采用平均数，多点校正，时间窗口为1，枳壳(Z1-Z12)与麸炒枳壳(F1-F12)均确定11个共有峰，结果详见图4和图5。经采用紫外光谱PDA检测器进行对照品指认，最终确定峰1为芸香柚皮苷，峰2为柚皮苷，峰3为橙皮苷，峰4为新橙皮苷，均为黄酮苷类成分；峰5为水合橙皮内酯，峰9为马尔敏，峰10为川陈皮素，峰11为橘红素，均为脂溶性成分(对照品指认图详见图6～图13)。
3.6精密度试验 按照“3.4”项下制备供试品溶液，按“3.2”项下的色谱条件连续进样6次，以新橙皮苷色谱峰为参照峰S，计算峰1～峰11的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值。结果如下表2～3：
表2精密度考察结果(相对保留时间)
Figure BDA0002971233070000101
Figure BDA0002971233070000111
表3精密度考察结果(相对峰面积)
Figure BDA0002971233070000112
结果显示，供试品溶液在连续进样6次的精密度考察中11个色谱峰相对保留时间的RSD范围在0.04％～0.12％，相对峰面积的RSD范围在0.29％～2.44％，表明该特征图谱方法精密度良好。
3.7稳定性考察 按照“3.4”项下制备供试品溶液，按“3.2”项下的色谱条件，分别在0，2，4，8，12，16，24小时进样测定；以新橙皮苷色谱峰为参照峰S，计算峰1～峰11的相对保留时间以及相对峰面积，并计算RSD值。结果如下表4～5：
表4稳定性考察结果(相对保留时间)
Figure BDA0002971233070000113
表5稳定性考察结果(相对峰面积)
Figure BDA0002971233070000114
结果显示，供试品溶液在24小时内11个色谱峰相对保留时间的RSD范围在0.75％～2.09％，相对峰面积的RSD范围在0.85％～2.94％，表明该方法下供试品溶液在24小时内稳定。
3.8重复性考察 按照“3.4”项下制备供试品溶液，平行6份，按“3.2”项下的色谱条件，进样测定，以新橙皮苷色谱峰为参照峰S，计算峰1～峰11的相对保留时间以及相对峰面积，并计算RSD值。结果如下表6～7：
表6重复性考察结果(相对保留时间)
Figure BDA0002971233070000121
表7重复性考察结果(相对峰面积)
Figure BDA0002971233070000122
实验结果显示，在平行6份供试品溶液中11个色谱峰相对保留时间的RSD范围在0.03％～1.13％，相对峰面积的RSD范围在0.29％～2.44％，表明该特征图谱方法重复性良好。
3.9中间精密度考察 由其他分析人员在不同日期，按照“3.4”项下制备供试品溶液，平行6份，并在不同色谱仪下操作，按“3.2”项下的色谱条件，进样测定，以新橙皮苷色谱峰为参照峰S，计算峰1～峰11的相对保留时间以及相对峰面积，并与重复性考察数据比较，计算RSD值。结果如下表8～9：
表8中间精密度考察结果(相对保留时间)
Figure BDA0002971233070000123
Figure BDA0002971233070000131
表9中间精密度考察结果(相对峰面积)
Figure BDA0002971233070000132
实验结果显示，在中间精密度考察中11个色谱峰相对保留时间RSD在0.09％～1.00％范围内，相对峰面积RSD在0.26％～2.47％范围内，表明中间精密度良好。
3.10耐用性考察
3.10.1不同色谱柱考察 比较了3种色谱柱，分别是：Agilent SB-C18柱(100mm×2.1mm，1.8μm)三根相同型号不同批次的色谱柱对枳壳特征图谱耐用性的影响。按照“3.4”项下制备供试品溶液，按“3.2”项下的色谱条件，进样测定，以新橙皮苷色谱峰为参照峰S，计算峰1～峰11的相对保留时间以及相对峰面积，计算RSD值。实验结果如下表10～11：
表10耐用性考察-不同色谱柱(相对保留时间)
Figure BDA0002971233070000133
表11耐用性考察-不同色谱柱(相对峰面积)
Figure BDA0002971233070000134
实验结果显示，三根相同型号的色谱柱对枳壳的分离效果基本一致，以新橙皮苷为参比峰的11个色谱峰相对保留时间RSD范围在0.03％～1.06％，相对峰面积的RSD范围在0.23％～2.43％，相同型号的Agilent SB-C18柱(100mm×2.1mm，1.8μm)色谱柱适用性良好。
3.10.2不同流速考察 比较不同流速，分别是：0.38mL/min、0.40mL/min、0.42mL/min对枳壳特征图谱耐用性影响。按照“3.4”项下制备供试品溶液，按“3.2”项下的色谱条件，进样测定，以新橙皮苷色谱峰为参照峰S，计算峰1～峰11的相对保留时间以及相对峰面积，计算RSD值。实验结果如下表12～13：
表12耐用性考察-不同流速考察结果(相对保留时间)
Figure BDA0002971233070000141
表13耐用性考察-不同流速考察结果(相对峰面积)
Figure BDA0002971233070000142
结果显示，在不同流速对11个色谱峰的分离度和峰型没有影响，11个色谱峰相对保留时间RSD范围在0.01％～0.90％，相对峰面积的RSD范围在0.24％～2.44％，说明该方法能适应流速小幅度变动。
3.10.3不同柱温考察 比较不同柱温，分别是：25℃、30℃、35℃、40℃对枳壳特征图谱耐用性影响。按照“3.4”项下制备供试品溶液，按“3.2”项下的色谱条件，进样测定，以新橙皮苷色谱峰为参照峰S，计算峰1～峰11的相对保留时间以及相对峰面积，计算RSD值。实验结果如下表14～15：
表14耐用性考察-不同柱温考察结果(相对保留时间)
Figure BDA0002971233070000143
表15耐用性考察-不同柱温考察结果(相对峰面积)
Figure BDA0002971233070000144
结果显示，在不同柱温对11个特征峰的分离度和峰型没有影响，11个色谱峰相对保留时间的RSD范围在0.14％～1.12％，相对峰面积的RSD范围在0.20％～3.44％。表明当柱温±5℃时对各色谱峰相对峰面积与相对保留时间影响较小，说明该法能适应柱温微小的变动。
实施例2枳壳与麸炒枳壳的鉴别
精密称取24批样品，按实施例1“3.4”项下方法制备供试品溶液，按实施例1“3.2”项下色谱条件进样测定。测定结果显示，枳壳与麸炒枳壳共有峰基本一致，化学成分基本组成相同，仅从特征图谱无法直观鉴别两者区别，但炮制前后同一保留时间色谱峰之间响应存在一定差异，结果见表16～表17。采用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.0版本)”分别对Z1-Z12批枳壳样品、F1-F12麸炒枳壳样品的UPLC特征图谱进行数据处理，分别以Z1、F1为参照，采用平均数，多点校正，时间窗口为1，建立枳壳与麸炒枳壳特征图谱对照图谱，结果详见图14和图15。
表16 24批样品特征图谱(相对保留时间)
Figure BDA0002971233070000151
表17 24批样品特征图谱(相对峰面积)
Figure BDA0002971233070000152
Figure BDA0002971233070000161
实施例3枳壳与麸炒枳壳的多指标含量测定
枳壳具有理气宽中，行滞消胀等功效，可用于胸胁气滞，胀满疼痛，食枳不化，痰饮内停，脏器下垂。研究表明，枳壳中的主要有效成分如黄酮类、生物碱类、挥发油类等均具有明显的药理作用。目前部分研究对枳壳炮制后黄酮苷类成分含量增加或减少有所争议，且该类成分的转化与降解的原理尚不明确，推断与黄酮苷类降解成苷元的条件如麸炒温度、炮制时长、麦麸质量等有关，有待进一步的考察；马尔敏为脂溶性成分，与文献认为枳壳经麸炒后可降其挥发油的含有量，减少刺激性成分，以达到“去燥性而和胃”的推论有一定关联。
为了进一步评价枳壳及麸炒枳壳的质量，本研究对实施例1已进行归属的8个化学成分进行含量测定，探究枳壳麸炒前后的含量差异。
1、线性关系考察 精密称定芸香柚皮苷对照品3.403mg、柚皮苷对照品2.756mg、橙皮苷对照品2.306mg、新橙皮苷对照品1.064mg、水合橙皮内酯对照品0.706mg、马尔敏对照品2.299mg、川陈皮素对照品2.242mg、橘红素对照品2.600mg，加甲醇制成浓度分别为336.6325μg/mL、257.4104μg/mL、221.6066μg/mL、105.7616μg/mL、69.1880μg/mL、225.302μg/mL、219.7160μg/mL、256.4380μg/mL的混合对照品溶液。分别加甲醇稀释制得7个不同质量浓度的对照品溶液，按实施例1"2.2"项色谱条件测定，以质量浓度(μg/mL)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，得到各个对照品的线性关系良好，结果见表18。
表18回归方程及线性范围
Figure BDA0002971233070000162
Figure BDA0002971233070000171
2、加样回收率考察 取已知含量的枳壳饮片(Z4)0.1g，平行6份，精密称定，加入与样品中含量等量的对照品，按实施例1“3.4”项下方法制备供试品溶液，按实施例1“3.2”项下色谱条件进行测定，计算加样回收率及RSD，测得8个成分平均加样回收率均在95.16％～102.11％，RSD<3％，结果见表19。
表19加样回收率考察结果
Figure BDA0002971233070000172
Figure BDA0002971233070000181
3、含量测定结果 精密称取24批样品，按实施例1“3.4”项下方法制备供试品溶液，按实施例1“3.2”项下色谱条件进样测定。测定结果显示，黄酮苷类成分(芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷)含量经炮制后整体呈增加趋势，脂溶性成分(水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素、橘红素)的含量炮制后则整体呈减少趋势，进一步说明生品与炮制品之间成分存在差异。结果见表20。
表20含量测定结果(单位：mg/g)
Figure BDA0002971233070000182
Figure BDA0002971233070000191
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (16)

1.一种枳壳的特征图谱构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
对照品溶液和供试品溶液制备：取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素和橘红素对照品，以溶剂溶解，制备所述对照品溶液；取枳壳，加入提取溶剂进行提取，制备所述供试品溶液；
检测：以超高效液相色谱法对所述对照品溶液和供试品溶液进行检测；
所述超高效液相色谱法采用的流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.03％～0.07％的磷酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的枳壳的特征图谱构建方法，其特征在于，所述梯度洗脱包括如下程序：
0min～7min，流动相A的体积分数由15％上升至25％，流动相B的体积分数由85％下降至75％；
7min～8min，流动相A的体积分数由25％上升至40％，流动相B的体积分数由75％下降至60％；
8min～10min，流动相A的体积分数由40％上升至45％，流动相B的体积分数由60％下降至55％；
10min～13min，流动相A的体积分数由45％上升至60％，流动相B的体积分数由55％下降至40％；
13min～15min，流动相A的体积分数由60％下降至15％，流动相B的体积分数由40％上升至85％。
3.根据权利要求1所述的枳壳的特征图谱构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱法还包括如下检测条件：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流速为0.2mL/min～0.6mL/min，柱温为25℃～40℃，检测波长为310nm～330nm。
4.根据权利要求1～3任一项所述的枳壳的特征图谱构建方法，其特征在于，所述提取溶剂为甲醇，所述提取的方法为回流提取。
5.一种麸炒枳壳的特征图谱构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
对照品溶液和供试品溶液制备：取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素和橘红素对照品，以溶剂溶解，制备所述对照品溶液；取麸炒枳壳，加入提取溶剂进行提取，制备所述供试品溶液；
检测：以超高效液相色谱法对所述对照品溶液和供试品溶液进行检测；
所述超高效液相色谱法采用的流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.03％～0.07％的磷酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱。
6.根据权利要求5所述的麸炒枳壳的特征图谱构建方法，其特征在于，所述梯度洗脱包括如下程序：
0min～7min，流动相A的体积分数由15％上升至25％，流动相B的体积分数由85％下降至75％；
7min～8min，流动相A的体积分数由25％上升至40％，流动相B的体积分数由75％下降至60％；
8min～10min，流动相A的体积分数由40％上升至45％，流动相B的体积分数由60％下降至55％；
10min～13min，流动相A的体积分数由45％上升至60％，流动相B的体积分数由55％下降至40％；
13min～15min，流动相A的体积分数由60％下降至15％，流动相B的体积分数由40％上升至85％。
7.根据权利要求5所述的麸炒枳壳的特征图谱构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱法还包括如下检测条件：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流速为0.2mL/min～0.6mL/min，柱温为25℃～40℃，检测波长为310nm～330nm。
8.根据权利要求5～7任一项所述的麸炒枳壳的特征图谱构建方法，其特征在于，所述提取溶剂为甲醇，所述提取的方法为回流提取。
9.一种枳壳和麸炒枳壳的鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
待测样品溶液制备：取待测样品，加入提取溶剂进行提取，制备所述待测样品溶液；
检测：以超高效液相色谱法对所述待测样品溶液进行检测，将检测所得图谱与权利要求1～4任一项所述构建方法构建获得的枳壳的特征图谱，或权利要求5～8任一项所述构建方法构建获得的麸炒枳壳的特征图谱进行比较；
所述超高效液相色谱法采用的流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.03％～0.07％的磷酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱。
10.根据权利要求9所述的枳壳和麸炒枳壳的鉴别方法，其特征在于，所述梯度洗脱包括如下程序：
0min～7min，流动相A的体积分数由15％上升至25％，流动相B的体积分数由85％下降至75％；
7min～8min，流动相A的体积分数由25％上升至40％，流动相B的体积分数由75％下降至60％；
8min～10min，流动相A的体积分数由40％上升至45％，流动相B的体积分数由60％下降至55％；
10min～13min，流动相A的体积分数由45％上升至60％，流动相B的体积分数由55％下降至40％；
13min～15min，流动相A的体积分数由60％下降至15％，流动相B的体积分数由40％上升至85％。
11.根据权利要求9所述的枳壳和麸炒枳壳的鉴别方法，其特征在于，所述超高效液相色谱法还包括如下检测条件：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流速为0.2mL/min～0.6mL/min，柱温为25℃～40℃，检测波长为310nm～330nm。
12.根据权利要求9～11任一项所述的枳壳和麸炒枳壳的鉴别方法，其特征在于，所述提取溶剂为甲醇，所述提取的方法为回流提取。
13.一种枳壳或麸炒枳壳的多指标含量测定，其特征在于，包括如下步骤：
对照品溶液和待测品溶液制备：取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素和橘红素对照品，以溶剂溶解，分别制备不同浓度的对照品溶液；取待测样品，加入提取溶剂进行提取，制备所述待测品溶液；
检测：以超高效液相色谱法对所述不同浓度的对照品溶液进行检测，并建立线性方程，以超高效液相色谱法对所述待测品溶液进行检测，并将检测结果代入所述线性方程，获取所述待测样品中的芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮内酯、马尔敏、川陈皮素和橘红素的含量；
所述超高效液相色谱法采用的流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.03％～0.07％的磷酸水溶液，洗脱方式为梯度洗脱。
14.根据权利要求13所述的枳壳或麸炒枳壳的多指标含量测定，其特征在于，所述梯度洗脱包括如下程序：
0min～7min，流动相A的体积分数由15％上升至25％，流动相B的体积分数由85％下降至75％；
7min～8min，流动相A的体积分数由25％上升至40％，流动相B的体积分数由75％下降至60％；
8min～10min，流动相A的体积分数由40％上升至45％，流动相B的体积分数由60％下降至55％；
10min～13min，流动相A的体积分数由45％上升至60％，流动相B的体积分数由55％下降至40％；
13min～15min，流动相A的体积分数由60％下降至15％，流动相B的体积分数由40％上升至85％。
15.根据权利要求13所述的枳壳或麸炒枳壳的多指标含量测定，其特征在于，所述超高效液相色谱法还包括如下检测条件：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流速为0.2mL/min～0.6mL/min，柱温为25℃～40℃，检测波长为310nm～330nm。
16.根据权利要求13～15任一项所述的枳壳或麸炒枳壳的多指标含量测定，其特征在于，所述提取溶剂为甲醇，所述提取的方法为回流提取。
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