CN116124937A - 障眼明片指纹图谱的构建方法与应用 - Google Patents

障眼明片指纹图谱的构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及中药成分检测分析技术领域，具体涉及一种障眼明片指纹图谱及其构建方法与质量检测方法。所述构建方法包括：将障眼明片供试品进行提取获得供试品溶液；将对照品进行溶解获得对照品溶液；采用相同的高效液相色谱方法分别对所述供试品溶液和对照品溶液进行检测获得供试品图谱和对照图谱；将所述供试品图谱进行指纹图谱相似度分析，生成标准指纹图谱，并根据所述对照图谱对所述标准图谱的色谱峰峰进行指认，获得障眼明片的指纹图谱。本实验首次建立了障眼明片的指纹图谱方法，总共筛选了18个特征共同峰，用于对障眼明片的质量控制和评估，可用于考察生产稳定性及批间一致性，该方法操作简便，重复性好，稳定性好。

Description

障眼明片指纹图谱的构建方法与应用
技术领域
本发明涉及中药成分检测分析技术领域，具体涉及一种障眼明片指纹图谱的构建方法与应用。
背景技术
障眼明片收载于中国药典2020版一部，由石菖蒲、决明子、肉苁蓉、葛根、青葙子、党参、蔓荆子、枸杞子、车前子、白芍、山茱萸、甘草、菟丝子、升麻、蕤仁(去内果皮)、菊花、密蒙花、川芎、酒黄精、熟地黄、关黄柏、黄芪等22味中药组成，具有补益肝肾，退翳明目的功效。主要用于肝肾不足所致的干涩不舒、单眼复视、腰膝痠软、或轻度视力下降。该品种中药味较多，成分复杂，因此对其进行质量研究尤为重要。
在《中国药典》中，对于障眼明片的质量标准为：对其中的多味药材如葛根、枸杞子、白芍、关黄柏进行薄层鉴别，再对葛根素进行含量测定。另外还包括通过测定其中的一两种有效成分，比如对障眼明胶囊和片剂中的葛根素和芍药苷的含量进行检测，又比如采用HPLC测定障眼明片中盐酸小檗碱的含量。上述质量鉴定方法中薄层鉴别准确度不高，其他含量检测中测定元素较为单一，无法准确全面的对障眼明片进行质量控制。
因此，有必要对障眼明片的质量评价方法进一步完善，构建一种准确、全面的质量控制标准。
发明内容
基于此，有必要提供一种障眼明片指纹图谱的构建方法。通过该方法建立的指纹图谱有18个特征峰，指认了其中9个色谱峰的化学成分，能够在短时间内检测障眼明片供试品的多个化学成分，全面地反应障眼明片的物质基础，实现障眼明片整体质量的控制和评价。
本发明提供了一种障眼明片指纹图谱的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
将障眼明片供试品进行提取获得供试品溶液；将对照品进行溶解获得对照品溶液；
采用高效液相色谱方法分别对所述供试品溶液和对照品溶液进行检测获得供试品图谱和对照图谱；
将所述供试品图谱进行指纹图谱相似度分析，生成标准指纹图谱，并根据所述对照图谱对所述标准图谱的色谱峰进行指认，获得所述障眼明片的指纹图谱；
所述对照品为葛根素、木犀草苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷、蒙花苷、3’-甲氧基葛根素、3’-羟基葛根素、葛根素芹菜糖苷、葛根素-6’-O-木糖苷中、蔓荆子黄素、盐酸小檗碱、阿魏酸、芍药苷、芍药内酯苷、梓醇、升麻素苷、马钱苷、甘草苷、金丝桃苷、绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、槲皮素、橙黄决明素、没食子酸、芦丁、紫云英苷、芒柄花苷、莫诺苷、甘草酸铵和3，5-二咖啡酰奎宁酸中的一种或多种组合。
在一个实施例中，所述将障眼明片供试品进行有效成分提取获得供试品溶液包括：将障眼明片供试品采用甲醇溶液进行超声提取，再过滤获得供试品溶液。
在一个实施例中，所述甲醇溶液为体积百分含量为10～100％的甲醇水溶液。
在一个实施例中，所述超声提取的条件包括：超声功率为200～300W，超声时间为15～60min。
在一个实施例中，所述高效液相色谱方法的检测条件包括如下技术特征：
色谱柱为C18色谱柱；检测波长为210～300nm；流速为0.8～1.0mL/min；柱温为25～45℃；
流动相A为水或甲酸水溶液，流动相B为甲醇，采用梯度洗脱进行洗脱。
在一个实施例中，所述甲酸溶液的体积百分含量为0.01～0.2％。
在一个实施例中，所述梯度洗脱的程序为：
0～12min，保持所述流动相B的体积百分比为5％；
12～25min，所述流动相B的体积百分比由5％升高至20％；
25～50min，所述流动相B的体积百分比由20％升高至27％；
50～57min，所述流动相B的体积百分比由27％升高至32％；
57～75min，所述流动相B的体积百分比由32％升高至33％；
75～80min，所述流动相B的体积百分比由33％升高至42％；
80～85min，所述流动相B的体积百分比由42％升高至45％；
85～100min，保持所述流动相B的体积百分比为45％；
100～105min，所述流动相B的体积百分比由45％升高至60％；
105～110min，所述流动相B的体积百分比由60％升高至80％；
110～120min，所述流动相B的体积百分比由80％升高至90％。
在一个实施例中，将所述供试品图谱进行指纹图谱相似度分析，生成标准指纹图谱包括：
将所述供试品图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行分析，生成所述标准指纹图谱。
在一个实施例中，所述指纹图谱的色谱峰包含18个特征峰，其中指认的色谱峰包括：4号峰为3’-羟基葛根素，6号峰为葛根素、7号峰为3’-甲氧基葛根素，8号峰为葛根素-6’-O-木糖苷，9号峰为葛根素芹菜糖苷，12号峰为松果菊苷，13号峰为毛蕊花糖苷，14号峰为木犀草苷，18号峰为蒙花苷。
本发明又提供了上述障眼明片指纹图谱构建方法在障眼明片质量检测中的应用。
本发明又提供了一种障眼明片的质量检测方法，所述质量检测方法包括：
将待检测障眼明片进行提取获得待测溶液，并采用高效液相色谱方法进行检测获得待测图谱；
将所述待测图谱与所述指纹图谱进行相似度比较。
有益效果：
本发明通过对障眼明片供试品和对照品采用特定的HPLC色谱条件进行检测获得色谱图，再通过指纹图谱相似度分析和色谱峰指认，获得含有多个特征峰的指纹图谱，方法简便，客观性强，且具有良好的灵敏度、重复性和稳定性。进一步完善障眼明片的质量评价方法，有利于其质量控制的准确性和全面性，通过比对指纹图谱，保证各批次药品质量的稳定、均匀、有效和可控。同时为药品标准的修订提供了科学依据。
附图说明
图1为本发明实施例提供的10个彼此的障眼明片供试品溶液的HPLC图谱；
图2为本发明实施例提供的障眼明片的标准指纹图谱；
图3为本发明实施例提供的不同浓度的提取溶剂的供试品色谱图；
图4为本发明实施例提供的不同提取时间的供试品色谱图；
图5为本发明实施例提供的不同提取料液比的供试品色谱图；
图6为本发明实施例提供的不同流动相的供试品色谱图；
图7为本发明实施例提供的不同色谱柱分离的供试品色谱图；
图8为本发明实施例提供的不同柱温的供试品色谱图；
图9为本发明实施例提供的不同检测波长的供试品色谱图；
图10为本发明实施例提供的变化波长下的供试品色谱图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供了一种障眼明片指纹图谱的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
将障眼明片供试品进行提取获得供试品溶液；将对照品进行溶解获得对照品溶液；
采用高效液相色谱方法分别对所述供试品溶液和对照品溶液进行检测获得供试品图谱和对照图谱；
将所述供试品图谱进行指纹图谱相似度分析，生成标准指纹图谱，并根据所述对照图谱对所述标准图谱的色谱峰进行指认，获得所述障眼明片的指纹图谱；
所述对照品为葛根素、木犀草苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷、蒙花苷、3’-甲氧基葛根素、3’-羟基葛根素、葛根素芹菜糖苷、葛根素-6’-O-木糖苷中、蔓荆子黄素、盐酸小檗碱、阿魏酸、芍药苷、芍药内酯苷、梓醇、升麻素苷、马钱苷、甘草苷、金丝桃苷、绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、槲皮素、橙黄决明素、没食子酸、芦丁、紫云英苷、芒柄花苷、莫诺苷、甘草酸铵和3，5-二咖啡酰奎宁酸中的一种或多种组合。
在具体示例中，对照品为葛根素、木犀草苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷、蒙花苷、3’-甲氧基葛根素、3’-羟基葛根素、葛根素芹菜糖苷、葛根素-6’-O-木糖苷中、蔓荆子黄素、盐酸小檗碱、阿魏酸、芍药苷、芍药内酯苷、梓醇、升麻素苷、马钱苷、甘草苷、金丝桃苷、绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、槲皮素、橙黄决明素、没食子酸、芦丁、紫云英苷、芒柄花苷、莫诺苷、甘草酸铵和3，5-二咖啡酰奎宁酸中的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种或者30种。
在具体示例中，所述将障眼明片供试品进行有效成分提取获得供试品溶液包括：将障眼明片供试品采用甲醇溶液进行超声提取，再过滤获得供试品溶液。
在具体示例中，所述甲醇溶液为体积百分含量为10～100％的甲醇水溶液；所述甲醇水溶液的体积百分含量选自：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。优选地，所述甲醇溶液的体积百分含量为75％，以获得更高的提取效率。
在一个实施例中，所述超声提取的条件包括：超声功率为200～300W，可选自：200W、220W、240W、260W、280W、300W，超声时间为15～60min，可选自：15min、30min、45min、60min。
在具体示例中，所述高效液相色谱方法的检测条件包括如下技术特征：
色谱柱为C18色谱柱；可选用的色谱柱包括但不限于Waters XBridge C18(250mm×4.6mm,5μm)、ThermoFisher Acclaim 120 C18(250mm×4.6mm,5μm)和依利特HypersilODS2(250mm×4.6mm,5μm)。优选地，本发明选用C18色谱柱，例如依利特Hypersil ODS2(250mm×4.6mm,5μm)，其对障眼明片中的特征峰的选择性更强，分离度和峰形更好。
检测波长为210～300nm；更为具体地，所述波长包括但不限于：210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、254nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm。
流速为0.8～1.0mL/min；更为具体地，所述流速包括但不限于：0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min。
柱温为25～45℃；更为具体地，所述柱温包括但不限于：25℃、30℃、35℃、40℃、45℃。
进样量为5～10μl；更为具体地，所述进样量包括但不限于：5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl。
流动相A为水或甲酸水溶液，流动相B为甲醇，采用梯度洗脱进行洗脱。
在一个实施例中，所述甲酸水溶液的体积百分含量为0.01～0.2％。更为具体地，选自：0.05％、0.1％、0.15％、0.2％。
在一个实施例中，所述梯度洗脱的程序为：
0～12min，保持所述流动相B的体积百分比为5％；
12～25min，所述流动相B的体积百分比由5％升高至20％；
25～50min，所述流动相B的体积百分比由20％升高至27％；
50～57min，所述流动相B的体积百分比由27％升高至32％；
57～75min，所述流动相B的体积百分比由32％升高至33％；
75～80min，所述流动相B的体积百分比由33％升高至42％；
80～85min，所述流动相B的体积百分比由42％升高至45％；
85～100min，保持所述流动相B的体积百分比为45％；
100～105min，所述流动相B的体积百分比由45％升高至60％；
105～110min，所述流动相B的体积百分比由60％升高至80％；
110～120min，所述流动相B的体积百分比由80％升高至90％。
优选的，在检测过程中不同的洗脱程序中采用变化波长：0～16min，280nm；16～46min，254nm；46～75min，220nm；75～120min，254nm。
在具体示例中，将所述供试品图谱进行指纹图谱相似度分析，生成标准指纹图谱包括：
将所述供试品图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行分析，生成标准指纹图谱。
在具体示例中，所述指纹图谱的色谱峰包含18个特征峰，其中指认的色谱峰包括：4号峰为3’-羟基葛根素，6号峰为葛根素、7号峰为3’-甲氧基葛根素，8号峰为葛根素-6’-O-木糖苷，9号峰为葛根素芹菜糖苷，12号峰为松果菊苷，13号峰为毛蕊花糖苷，14号峰为木犀草苷，18号峰为蒙花苷。
本发明又提供了上述障眼明片指纹图谱构建方法在障眼明片质量检测中的应用。
本发明又提供了一种障眼明片的质量检测方法，所述质量检测方法包括：
将待检测障眼明片进行提取获得待测溶液，并采用高效液相色谱方法进行检测获得待测图谱；其中的高效液相色谱法与障眼明片指纹图谱构建方法中的高效液相色谱法相同。
将所述待测图谱与所述指纹图谱进行相似度比较。
以下以具体实施例进行进一步说明，如无特别说明，实施例中采用的原料均为市售获得。
实施例1
障眼明片供试品为广州白云山中一药业有限公司提供，详见表1。
表1障眼明片供试品
Figure BDA0004045643790000071
Figure BDA0004045643790000081
供试品溶液的制备：取上述障眼明片粉末2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入75％甲醇20ml，密塞，称定质量，超声处理(功率300W，频率40kHz)30min，冷却至常温，再称定重量，用75％甲醇补足减失重量，摇匀，静置，过滤，取续滤液，即得。
对照品为：葛根素、木犀草苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷、蒙花苷、蔓荆子黄素、盐酸小檗碱、阿魏酸、芍药苷、芍药内酯苷、梓醇、升麻素苷、马钱苷、甘草苷、金丝桃苷、绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、槲皮素、橙黄决明素、没食子酸、芦丁、紫云英苷、芒柄花苷、莫诺苷、甘草酸铵、3，5-二咖啡酰奎宁酸，上述对照品均购自于中国食品药品检定研究院；3’-甲氧基葛根素、3’-羟基葛根素、葛根素芹菜糖苷，上述对照品均购自于成都克洛玛生物科技有限公司；葛根素-6’-O-木糖苷，购自上海源叶生物科技有限公司。
对照品溶液制备：取葛根素、木犀草苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷、蒙花苷、3’-甲氧基葛根素、3’-羟基葛根素、葛根素芹菜糖苷、葛根素-6’-O-木糖苷、蔓荆子黄素、盐酸小檗碱、阿魏酸、芍药苷、芍药内酯苷、梓醇、升麻素苷、马钱苷、甘草苷、金丝桃苷、绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、槲皮素、橙黄决明素、没食子酸、芦丁、紫云英苷、芒柄花苷、莫诺苷、甘草酸铵、3，5-二咖啡酰奎宁酸各约10mg，精密称定，分别置10ml容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品高浓度储备液(1mg/ml)。各取对照品储备液1ml，分别置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配置成每1ml含100μg的对照品溶液，并置于4℃的冰箱中保存备用。
将上述供试品溶液和对照品溶液采用高效液相色谱进行检测获得供试品图谱和对照图谱。具体地色谱条件为：
色谱柱为依利特Hypersil ODS2(250mm×4.6mm,5μm)。流动相A为水，B为甲醇，梯度洗脱：0-12min，5％-5％ B；12-25min，5％-20％ B；25-50min，20％-27％ B；50-57min，27％-32％ B；57-75min，32％-33％ B；75-80min，33％-42％B；80-85min，42％-45％ B；85-100min，45％-45％ B；100-105min，45％-60％ B；105-110min，60％-80％ B；110-120min，80％-90％ B。流速：1.0ml/min；柱温：35℃；进样量：10μl。二极管阵列检测器(DAD)检测条件，检测波长：0-16min，280nm；16-46min，254nm；46-75min，220nm；75-120min，254nm。
将上述获得的供试品图谱和对照图谱又Empower色谱管理软件处理并导出；所得导出后样品图谱以“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”(国家药典委员会)进行指纹图谱分析，计算样品相似度。
指纹图谱的检测：根据上述10各批次的障眼明片供试品的按照上述方法进行指纹图谱测定方法进行分析，获得指纹图谱，结果如图1所示。
对照图谱和共有峰标定：将指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相识度评价系统2004A》进行数据处理，以中位数法，时间窗0.1，建立共有模式指纹图谱，即障眼明片标准指纹图谱，见图2。根据10批供试品的测定结果确定18个共有峰。选择7号峰(3’-甲氧基葛根素)为参照峰，将其保留时间和峰面积均设为1.0，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积分别列于表2和表3。
表2 10批次障眼明片指纹图谱共有峰的相对保留时间
共 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
1 0.1809 0.1776 0.1760 0.1760 0.1765 0.1766 0.1769 0.1766 0.1762 0.1759
2 0.2553 0.2502 0.2475 0.2476 0.2486 0.2491 0.2498 0.2496 0.2483 0.2477
3 0.738 0.7392 0.7391 0.7382 0.7378 0.7376 0.7380 0.7375 0.7384 0.7386
4 0.7857 0.7865 0.7863 0.7857 0.7854 0.7852 0.7854 0.7849 0.7855 0.7857
5 0.8196 0.8201 0.8203 0.8198 0.8195 0.8194 0.8199 0.8196 0.8199 0.8197
6 0.9357 0.9360 0.9360 0.9355 0.9354 0.9356 0.9357 0.9359 0.9342 0.9338
7 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000
8 1.0687 1.0689 1.0691 1.0696 1.0700 1.0700 1.0702 1.0703 1.0707 1.0707
9 1.1002 1.1006 1.1008 1.1013 1.1018 1.1019 1.1020 1.1019 1.1019 1.1018
10 1.1245 1.1247 1.1248 1.1252 1.1253 1.1253 1.1256 1.1251 1.1258 1.1256
11 1.2080 1.2082 1.2086 1.2091 1.2092 1.2095 1.2099 1.2092 1.2097 1.2098
12 1.2397 1.2397 1.2405 1.2414 1.2413 1.2416 1.2419 1.2414 1.2404 1.2400
13 1.4840 1.4840 1.4852 1.4850 1.4842 1.4834 1.4832 1.4825 1.4827 1.4825
14 1.5573 1.5573 1.5582 1.5575 1.5564 1.5553 1.5548 1.5540 1.5516 1.5515
15 1.6488 1.6493 1.6513 1.6511 1.6511 1.6505 1.6504 1.6496 1.6490 1.6502
16 1.7555 1.7563 1.7579 1.7583 1.7583 1.7579 1.7578 1.7570 1.7557 1.7571
17 1.9578 1.9598 1.9617 1.9631 1.9636 1.9637 1.9646 1.9640 1.9620 1.9642
18 2.2907 2.2906 2.2929 2.2910 2.2881 2.2854 2.2851 2.2835 2.2857 2.2859
表3 10批次障眼明片指纹图谱共有峰的相对保留峰面积
共 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
1 4.7378 4.2045 4.0414 3.4185 3.2839 4.1160 2.3959 2.5413 0.9292 0.7068
2 8.4083 7.4506 6.7386 5.3647 4.8839 6.4302 2.3691 2.9095 0.5963 0.9111
3 0.2440 0.2031 0.1940 0.1987 0.2105 0.2268 0.1968 0.1823 0.1844 0.1941
4 0.7127 0.7351 0.7912 0.7668 0.7737 0.7729 0.7364 0.7298 0.8326 0.8128
5 0.1898 0.1697 0.1802 0.1645 0.1694 0.1574 0.1457 0.1393 0.2161 0.1604
6 5.9972 5.9595 6.0919 5.9858 5.9988 6.0470 4.5863 4.6174 4.4391 4.8878
7 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000
8 0.2310 0.2013 0.2159 0.2142 0.2407 0.2305 0.1661 0.1595 0.1831 0.1996
9 0.7222 0.7006 0.7245 0.7792 0.7891 0.7603 0.6593 0.6501 0.7175 0.7244
10 1.0859 1.0802 1.1181 1.1875 1.1872 1.1704 0.7884 0.8309 0.7697 0.7430
11 0.1543 0.1482 0.1677 0.1679 0.1698 0.1652 0.1361 0.1231 0.1353 0.1310
12 0.7379 0.6296 0.6750 0.6993 0.7023 0.6850 0.5795 0.5252 0.4782 0.5485
13 0.1347 0.1261 0.1265 0.1745 0.1822 0.1799 0.3775 0.3185 0.2173 0.2272
14 0.4617 0.3213 0.3546 0.4548 0.4673 0.4716 0.3534 0.3310 0.1499 0.1518
15 0.1504 0.1386 0.1474 0.1184 0.1374 0.1293 0.2284 0.1892 0.1099 0.0890
16 0.2435 0.1950 0.2301 0.3275 0.3294 0.3243 0.2002 0.1870 0.0780 0.0529
17 0.6291 0.5887 0.5898 0.5156 0.4957 0.5404 0.4227 0.4288 0.3519 0.5108
18 0.2250 0.1804 0.2082 0.3091 0.3130 0.3028 0.2650 0.2148 0.0954 0.0851
相似度评价：将10批样品的HPLC指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相识度评价系统2004A版》，生成障眼明片对照指纹图谱，在分析检验模式下，计算10批样品指纹图谱的相似度，结果见表4，所有代表性样品与标准指纹图谱的相似度均在0.90以上。
表4指纹图谱相似性
编号 批号 相似度 编号 批号 相似度
S1 C02001 0.924 S6 C04003M 0.994
S2 C02002 0.942 S7 Z04003 0.996
S3 C04002 0.959 S8 Z02011 0.919
S4 C04001M 0.982 S9 Y04004 0.925
S5 C04002M 0.963 S10 YN001 0.992
色谱峰指认：指纹图谱共有模式生成了18个共有峰，经过与对照品进行比对，指认出其中9个色谱峰，依次为3’-羟基葛根素(4号峰)、葛根素(6号峰)、3’-甲氧基葛根素(7号峰)、葛根素-6’-O-木糖苷(8号峰)、、葛根素芹菜糖苷(9号峰)、松果菊苷(12号峰)、毛蕊花糖苷(13号峰)、木犀草苷(14号峰)、蒙花苷(18号峰)。
对于上述方法进行方法学考察：
1、精密度
按供试品制备方法制备批次Z02011供试品溶液，连续进样6次，进行HPLC分析，结果表明，各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD值分别小于3.11％和0.30％，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱要求。
2、稳定性
按供试品制备方法制备批次Z02011供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、18、24h时进行HPLC分析，结果表明，各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD值分别小于4.83％和0.26％，表明样品溶液在24h内稳定性良好。
3、重复性
取批次Z02011的障眼明片样品6份，按样品制备方法制备供试品溶液，进行HPLC分析，结果表明，各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD值分别小于4.57％和0.17％，表明该方法重复性较好。
实施例2
本实施例对障眼明片指纹图谱的构建方法进行条件考察。
1、供试品溶液制备工艺中提取溶剂考察
参考实施例1中的构建方法，保持其他条件不变，以体积分数为50％、75％和100％甲醇的3中溶剂进行超声提取，经HPLC检测获得供试品色谱图如图3所示。可知：三种溶剂提取所得的障眼明片供试品溶液的HPLC色谱图基线平稳，峰形和分离度较好。其中100％甲醇和50％甲醇的响应值较75％甲醇低，75％甲醇所得色谱图的峰面积更大，提取更加完全。故本实验选择75％甲醇作为障眼明片指纹图谱研究的提取溶剂。
2、供试品溶液制备工艺中提取时间的选择
参考实施例1中的构建方法，保持其他条件不变，以超声提取时间为15min、30min、45min、60min进行处理，经HPLC检测获得供试品色谱图如图4所示。可知：随着提取时间的增加，各色谱峰响应强度也逐步增强，当提取时间为30min时，色谱峰强度达到最高，并且提取时间为60min和90min时，色谱峰强度无明显提高，因此以提取效率高同时节约时间为原则，优选30min作为障眼明片指纹图谱研究的提取时间。
3、供试品溶液制备工艺中料液比的选择
参考实施例1中的构建方法，保持其他条件不变，选定75％甲醇的提取溶剂以及30min的提取时间后，以料液比为1:10(20ml)、1:15(30ml)、1:20(40ml)、1:25(50ml)进行处理，经HPLC检测获得供试品色谱图如图5所示。可知：随着提取溶剂量的增加，各色谱峰响应强度也逐步减弱，出于环保考虑同时节约试剂，本实验优选1:10(20ml)作为障眼明片指纹图谱研究的提取料液比。
4、色谱条件中流动相的选择
以甲醇-水、甲醇-0.1％磷酸水、甲醇-0.1％甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1％磷酸水作为流动相进行洗脱(洗脱条件为0-60min，5％～95％B，其中A为水/0.1％磷酸水/0.1％甲酸水，B为甲醇/乙腈)。将障眼明片供试品溶液采用上述流动相进行高效液相检测，检测波长为280nm，其他色谱条件与实施例1相同，获得供试品色谱图如图6所示。可知：可见甲醇-(酸)水系统进行梯度洗脱时，化合物的分离效果以及峰形较乙腈-(酸)水系统更好，其中甲醇-水系统与甲醇-0.1％磷酸/甲酸水系统比较，分离效果无明显差异，但洗脱时基线更为平稳，故选择甲醇-水系统作为障眼明片指纹图谱研究的流动相。
5、色谱条件中色谱柱的选择
参考实施例1中的构建方法，保持其他条件不变，考察3中色谱柱Waters XBridgeC18(250mm×4.6mm,5μm)、ThermoFisher Acclaim 120 C18(250mm×4.6mm,5μm)和依利特Hypersil ODS2(250mm×4.6mm,5μm)，获得的供试品色谱图如图7所示。可知采用依利特Hypersil ODS2色谱柱时选择性更强，分离度和峰形更好，出峰时间适中，因此选择依利特Hypersil ODS2色谱柱进行后续指纹图谱研究。
6、色谱条件中柱温的选择
参考实施例1中的构建方法，保持其他条件不变，在色谱柱温度为30℃、35℃、40℃条件下进行供试品溶液图谱检测，其他条件与实施例1同，获得的供试品色谱图如图8所示。可知：在色谱柱温度为30℃、35℃、40℃时，随着温度的升高，各峰的出峰时间缩短，各色谱峰分离效果类似，且均能得到较好的峰形。当柱温为35℃时，各色谱峰出峰时间较为适中，且鉴于色谱柱寿命及实验的可重复性，因此本实验选择色谱柱温度为35℃。
7、色谱条件中检测波长的选择
参考实施例1中的构建方法，保持其他条件不变，比较DAD检测器设定不同波长对检测结果的影响，包括330nm、280nm、254nm、220nm，结果如图9所示。可知：由于各化合物的吸收波长有所不同，本次实验中我们结合各化合物的相对较大吸收波长，采用变化波长(0～16min，280nm；16～46min，254nm；46～75min，220nm；75～120min，254nm)的模式进行测定，结果如图10所示。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种障眼明片指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
将障眼明片供试品进行提取获得供试品溶液；将对照品进行溶解获得对照品溶液；
采用高效液相色谱方法分别对所述供试品溶液和对照品溶液进行检测获得供试品图谱和对照图谱；
将所述供试品图谱进行指纹图谱相似度分析，生成标准指纹图谱，并根据所述对照图谱对所述标准图谱的色谱峰进行指认，获得所述障眼明片的指纹图谱；
所述对照品为葛根素、木犀草苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷、蒙花苷、3’-甲氧基葛根素、3’-羟基葛根素、葛根素芹菜糖苷、葛根素-6’-O-木糖苷中、蔓荆子黄素、盐酸小檗碱、阿魏酸、芍药苷、芍药内酯苷、梓醇、升麻素苷、马钱苷、甘草苷、金丝桃苷、绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、槲皮素、橙黄决明素、没食子酸、芦丁、紫云英苷、芒柄花苷、莫诺苷、甘草酸铵和3，5-二咖啡酰奎宁酸中的一种或多种组合。
2.根据权利要求1所述的障眼明片指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述将障眼明片供试品进行有效成分提取获得供试品溶液的步骤包括：
将障眼明片供试品采用甲醇溶液进行超声提取，过滤获得供试品溶液。
3.根据权利要求2所述的障眼明片指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述甲醇溶液为体积百分含量为10～100％的甲醇水溶液；
所述超声提取的条件包括：超声功率为200～300W，超声时间为15～60min。
4.根据权利要求1所述的障眼明片指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱方法的检测条件包括：
色谱柱为C18色谱柱；检测波长为210～300nm；流速为0.8～1.0mL/min；柱温为25～45℃；
流动相A为水或甲酸水溶液，流动相B为甲醇，采用梯度洗脱进行洗脱。
5.根据权利要求4所述的障眼明片指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述甲酸水溶液的体积百分含量为0.01～0.2％。
6.根据权利要求4所述的障眼明片指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序包括：
0～12min，保持所述流动相B的体积百分比为5％；
12～25min，所述流动相B的体积百分比由5％升高至20％；
25～50min，所述流动相B的体积百分比由20％升高至27％；
50～57min，所述流动相B的体积百分比由27％升高至32％；
57～75min，所述流动相B的体积百分比由32％升高至33％；
75～80min，所述流动相B的体积百分比由33％升高至42％；
80～85min，所述流动相B的体积百分比由42％升高至45％；
85～100min，保持所述流动相B的体积百分比为45％；
100～105min，所述流动相B的体积百分比由45％升高至60％；
105～110min，所述流动相B的体积百分比由60％升高至80％；
110～120min，所述流动相B的体积百分比由80％升高至90％。
7.根据权利要求1所述的障眼明片指纹图谱的构建方法，其特征在于，将所述供试品图谱进行指纹图谱相似度分析，生成标准指纹图谱包括：
将所述供试品图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行分析，生成所述标准指纹图谱。
8.根据权利要求1所述的障眼明片指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述指纹图谱的色谱峰包含18个特征峰，其中指认的色谱峰包括：4号峰为3’-羟基葛根素，6号峰为葛根素、7号峰为3’-甲氧基葛根素，8号峰为葛根素-6’-O-木糖苷，9号峰为葛根素芹菜糖苷，12号峰为松果菊苷，13号峰为毛蕊花糖苷，14号峰为木犀草苷，18号峰为蒙花苷。
9.权利要求1-8任一项所述的障眼明片指纹图谱的构建方法在障眼明片质量检测中的应用。
10.一种障眼明片的质量检测方法，其特征在于，所述质量检测方法包括：
将待检测障眼明片进行提取获得待测溶液，并采用高效液相色谱方法进行检测获得待测图谱；
将所述待测图谱与指纹图谱进行相似度比较。
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