CN104111292A - 一种复方丹参片指纹图谱的检测方法 - Google Patents
一种复方丹参片指纹图谱的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种复方丹参片指纹图谱的检测方法,所述检测方法采用高效液相色谱法进行检测,包括如下步骤:a.确定色谱条件;b.供试品溶液制备:精密称取复方丹参片,置于容量瓶中,加50%乙醇超声溶解,定容,过滤,得到滤液,即供试品溶液;c.指纹图谱建立:将b步骤制得的供试品溶液利用高效液相色谱法进行检测,得到复方丹参片指纹图谱,其中色谱条件为步骤a中所述的色谱条件。该检测方法简单快捷、易操作、精密度高、稳定性好,能够很好的为复方丹参片的生产提供质量控制的依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种含丹参药物指纹图谱的检测方法,尤其是涉及一种复方丹参片指纹图谱的检测方法。
背景技术
复方丹参片收载于《中国药典》2010版第一增补本中,由丹参、三七和冰片三味药组成,具有活血化瘀,理气止痛的作用。丹参药材主要含有丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA、丹参酮IIB、隐丹参酮等脂溶性成分和丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸A、B、C、D、E、F、G等水溶性成分;三七药材主要含有人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rg1、Re、F2和三七皂苷R1、R2、R4、R6、Fa等成分。临床上用于气滞血瘀所致的胸痹,症见胸闷、心前区刺痛,冠心病心绞痛。
复方丹参片在配方或比例存在差异的情况下,可能会导致治疗效果产生差异,因此需要寻求一种质量评价方法,对复方丹参片的质量提供依据。目前,对于这一评价方法主要有指纹图谱研究方法,如下列文献(1)王颖.复方丹参片的HPLC指纹图谱研究[J].中国药房,2010(23):2162-2163;(2)孙守国.复方丹参片的HPLC指纹图谱研究[J].中成药,2009,31(3):339-342.(3)黄琳,姚小华,林青等.复方丹参片指纹图谱研究[J].现代中药研究与实践,2012,26(4):66-69.(4)严玉平,同利琪,郭聪等.复方丹参片指纹图谱及含量检测研究[J].中成药,2012,31(8)1149-115。
但上述文献中,未有在同一条件下同时检测出复方丹参片中丹参和三七有效成分的复方丹参片指纹图谱,增大了检测时间和成本。
发明内容
为了解决现有技术的问题,本发明提供了一种精密度高、稳定性好、能够在同一流动相下同时检测出丹参和三七有效成分的指纹图谱的方法。
为解决上述问题,本发明所采用的技术方案如下:
一种复方丹参片指纹图谱的检测方法,采用高效液相色谱法进行检测,所述检测方法包括如下步骤:
a.确定色谱条件:
色谱柱:C18色谱柱;
流动相:流动相A为乙腈,流动相B为0.1%磷酸;
检测波长:210nm;
柱温:30℃;
体积流量:1ml/min;
进样量:10μl;
参照峰:丹酚酸B色谱峰;
洗脱程序:梯度洗脱,洗脱时间为90min;
为了更好使供试品溶液中组分的分离效果最好,发明人在实验中,选择乙腈-水,乙腈-0.1%磷酸(质量百分数),甲醇-水,甲醇-0.1%磷酸系统进行梯度洗脱,结果发现,乙腈-水,甲醇-水系统下,色谱峰较少,出峰时间较长,甲醇-0.1%磷酸系统下,色谱峰较多,但分离效果不是很好,选用乙腈-0.1%磷酸系统,分离效果较好,基线较平稳,故选用乙腈-0.1%磷酸作为流动相;
发明人利用二极管阵列检测器,获得复方丹参片190~400nm的3D色图谱,结果见图1(复方丹参片指纹图谱3D图)。通过全波长扫描可以看出,在210nm处,复方丹参片各类成分都有较好的吸收,且能同时检测出丹参和三七药材主要成分的吸收。在210nm以上,三七成分的吸收峰逐渐消失,在210nm以下,丹参酮IIA、隐丹参酮和丹参酮I的吸收峰逐渐消失,综合各成分吸收峰的特点,选择210nm作为复方丹参片的检测波长;
复方丹参片指纹图谱中丹酚酸B色谱峰峰形适中,对称性较好、峰面积较大,且丹酚酸B为2010版药典中丹参药材的含量控制指标之一,故选择丹酚酸B为参照峰;
b.供试品溶液制备:精密称取复方丹参片,置于容量瓶中,加50%乙醇(质量百分数)超声溶解,定容,过滤,得到滤液,即供试品溶液;
复方丹参片所含成分主要有水溶性和脂溶性成分,发明人分别以50%乙醇(质量百分数)、75%乙醇(质量百分数)、50%甲醇(质量百分数)和75%甲醇(质量百分数)为提取溶剂制备供试品,按液相色谱条件进样,结果发现,50%乙醇提取包含的色谱法最多,总峰面积较大,故选择50%乙醇作为提取溶剂;
c.指纹图谱建立:将b步骤制得的供试品溶液利用高效液相色谱法进行检测,得到复方丹参片指纹图谱,其中色谱条件为步骤a中所述的色谱条件。
本发明中,优选的方案为所述b步骤具体为:取复方丹参片,研细,精密称取0.5g,置于25ml容量瓶中,加50%乙醇超声溶解,定容,过滤,得到滤液,即供试品溶液;所述超声处理的功率为300w,频率为50kHz,处理时间为30min;其中过滤采用的滤膜为孔径0.45μm的微孔滤膜。
本发明中,优选的方案为所述a步骤中的洗脱程序具体为:
0-5min时,流动相A为6-20%的乙腈,流动相B为80-94的0.1%的磷酸溶液;
5-30min时,流动相A为20-25%的乙腈,流动相B为75-80的0.1%的磷酸溶液;
30-45min时,流动相A为25-32%的乙腈,流动相B为68-75的0.1%的磷酸溶液;
45-70min时,流动相A为32-70%的乙腈,流动相B为30-68的0.1%的磷酸溶液;
70-90min时,流动相A为70-90%的乙腈,流动相B为10-30的0.1%的磷酸溶液。
本发明中,优选的方案为利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004》对经过c步骤得到的复方丹参片指纹图谱进行评价,得到复方丹参片的对照指纹图谱。
与现有技术相比,本发明的优点是:选用乙腈-0.1%磷酸作为流动相系统,分离效果较好,基线较平稳;检测波长为210nm,复方丹参片各类成分都有较好的吸收,且能同时检测出丹参和三七药材主要成分的吸收;丹酚酸B色谱峰峰形适中,对称性较好、峰面积较大,能够起到很好的参照作用;50%乙醇作为提取溶剂,提取包含的色谱法最多,总峰面积较大;此外该检测方法简单快捷、易操作、精密度高、稳定性好,能够很好的为复方丹参片的生产提供质量控制的依据。
下面结合附图及具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为复方丹参片指纹图谱3D图;
图2为复方丹参片和对照品色谱图;
图3为12批复方丹参片指纹图谱;
图4为复方丹参片对照指纹图谱;
图2中:S1:丹参素钠对照品;S2:原儿茶醛对照品;S3:迷迭香酸对照品;S4:紫草酸对照品;S5:人参皂苷Rg1对照品;S6:丹酚酸B对照品;S7:人参皂苷Rb1对照品;S8:隐丹参酮对照品;S9:丹参酮I对照品;S10:丹参酮IIA对照品;S11:丹参阴性对照品;S12:三七阴性对照品;S13:复方丹参片供试品。
图3中:S1:复方丹参片L3A082批;S2:复方丹参片D3A008批;S3:复方丹参片E3A023批;S4:复方丹参片F3A016批;S5:复方丹参片G3A026批;S6:复方丹参片I3A094批;S7:复方丹参片J3A001批;S8:复方丹参片J3A002批;S9:复方丹参片J3A003批;S10:复方丹参片J3A006批;S11:复方丹参片L3A080批;S12:复方丹参片L3A081批。
具体实施方式
实施例1
一种复方丹参片指纹图谱的检测方法,其特征在于采用高效液相色谱法进行检测,所述检测方法包括如下步骤:
a.确定色谱条件:
色谱柱:C18色谱柱;
流动相:流动相A为乙腈,流动相B为0.1%磷酸;
检测波长:210nm;
柱温:30℃;
体积流量:1ml/min;
进样量:10μl;
参照峰:丹酚酸B色谱峰;
洗脱程序:梯度洗脱,洗脱时间为90min;0-5min时,流动相A为6-20%的乙腈,流动相B为80-94的0.1%的磷酸溶液;5-30min时,流动相A为20-25%的乙腈,流动相B为75-80的0.1%的磷酸溶液;30-45min时,流动相A为25-32%的乙腈,流动相B为68-75的0.1%的磷酸溶液;45-70min时,流动相A为32-70%的乙腈,流动相B为30-68的0.1%的磷酸溶液;70-90min时,流动相A为70-90%的乙腈,流动相B为10-30的0.1%的磷酸溶液;
b.供试品溶液制备:取复方丹参片,研细,精密称取0.5g,置于25ml容量瓶中,加50%乙醇超声溶解,定容,过滤,得到滤液,即供试品溶液;所述超声处理的功率为300w,频率为50kHz,处理时间为30min;其中过滤采用的滤膜为孔径0.45μm的微孔滤膜;
c.指纹图谱建立:将b步骤制得的供试品溶液利用高效液相色谱法进行检测,得到复方丹参片指纹图谱,其中色谱条件为步骤a中所述的色谱条件。
对广州白云山和记黄埔有限公司的复方丹参片进行指纹图片检测:
仪器:Waters2695液相色谱仪(美国waters);AG245型电子分析天平(瑞士METTLED TOLEDO);KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);405-D-1型超纯水机(广州东锐科技有限公司)。
试剂:复方丹参片12批(广州白云山和记黄埔有限公司提供,批号为:L3A080,L3A081,L3A082,D3A008,E3A023,F3A016,G3A026,I3A094,J3A001,J3A002,J3A003,J3A006);
丹酚酸B对照品(批号:Y0001559-01,EDQM);
丹参酮IIA对照品(批号:Y0001560-01,EDQM);
迷迭香酸对照品(批号:Y0000786-01,EDQM);
紫草酸对照品(批号:must-13082702);
丹参素钠对照品(批号:110855-201311,中国食品药品检定研究院);
原儿茶醛对照品(批号:110810-201007,中国食品药品检定研究院);
人参皂苷Rg1对照品(批号:110703-201128,中国食品药品检定研究院);
人参皂苷Rb1对照品(批号:110704-201223,中国食品药品检定研究院);
隐丹参酮对照品(批号:110852-200806,中国食品药品检定研究院);
丹参酮I对照品(批号:110867-200406,中国食品药品检定研究院);
甲酸(分析纯,广州化学试剂厂);
甲醇(分析纯,天津市化学试剂一厂);
磷酸(色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司);
乙腈(色谱纯,TEDIA);
甲醇(色谱纯,TEDIA);
高纯水。
对照品溶液制备:分别取丹酚酸B、丹参素钠、原儿茶醛、紫草酸、迷迭香酸、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA对照品适量,置量瓶中,各加75%甲醇配成一定浓度的对照品溶液。
丹参阴性对照品制备:按中国药典复方丹参片处方比例,称取除丹参的其余饮片,按药典工艺制成颗粒,按本实施例中b步骤的方法制成丹参阴性供试品溶液。
三七阴性对照品制备:按中国药典复方丹参片处方比例,称取除三七的其余饮片,按药典工艺制成颗粒,按本实施例中b步骤的方法制成三七阴性供试品溶液。
对本实施例的检测方法进行考察,主要对本方法的专属性、精密度、重复性、稳定性进行评价。
专属性试验:取丹酚酸B、丹参素钠、原儿茶醛、紫草酸、迷迭香酸、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA对照品溶液、供试品溶液、丹参和三七阴性对照品溶液根据本实施例a步骤中的色谱条件分别进样,记录HPLC色谱图,结果见图2(复方丹参片和对照品色谱图)。复方丹参片共检测出23个共有峰,其中5、6、10、11、12、13、18、20、21、22号色谱峰为丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、人参皂苷Rg1、丹酚酸B、人参皂苷Rb1、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA色谱峰,见图3。其中1、2号色谱峰为丹参和三七共有的色谱峰,3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、16、17、19、20、21、22、23号色谱峰为丹参的归属色谱峰,12、18号色谱峰为三七的归属色谱峰。
精密度试验:分别精密吸取同一供试品溶液,连续进样6次,每次10μL,按上述方法色谱条件检测,记录HPLC色谱图,以丹酚酸B色谱峰作为参照峰,计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD,结果显示所有色谱峰相对保留时间的RSD为0.05%~0.29%,相对峰面积的RSD为0.44%~3.38%,相似度为1.000,见表1,表明仪器的精密度好。
表1精密度相似度计算结果
重复性试验:取同一批复方丹参片,根据本实施例b步骤的方法制备供试品溶液6份,分别进样,每次10μL,按本实施例a步骤的色谱条件检测。记录HPLC色谱图,以丹酚酸B色谱峰作为参照峰,计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果显示所有色谱峰相对保留时间的RSD为0.03%~0.38%,相对峰面积的RSD为0.67%~2.60%,相似度大于0.998,见表2,表明供试品溶液重复性好。
表2重复性性相似度计算结果
稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液,分别在0、2、4、6、8、12h时进样,每次10μL,按本实施例a步骤的色谱条件。记录HPLC色谱图,以丹酚酸B色谱峰作为参照峰,计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果发现所有色谱峰相对保留时间的RSD为0.04%~0.55%,相对峰面积的RSD为0.23%~2.96%,相似度大于0.998,见表3,结果表明供试品溶液在24h内基本稳定。
表3稳定性性相似度计算结果
取广州白云山和记黄埔有限公司提供的12批复方丹参片,根据本实施例的方法检测指纹图谱,检测结果见图3(12批复方丹参片指纹图谱)。
通过中国药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004》对12批复方丹参片成品进行相似度评价,获得了复方丹参片的对照指纹图谱,见图4(复方丹参片对照指纹图谱)。12批成品相似系数均大于0.999(见表4),证明复方丹参片的生产工艺稳定,产品的均一性较好。
表412批复方丹参片成品进行相似度评价表
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式,不能以此来限定本发明保护的范围,本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (4)
1.一种复方丹参片指纹图谱的检测方法,其特征在于采用高效液相色谱法进行检测,所述检测方法包括如下步骤:
a.确定色谱条件:
色谱柱:C18色谱柱;
流动相:流动相A为乙腈,流动相B为0.1%磷酸;
检测波长:210nm;
柱温:30℃;
体积流量:1ml/min;
进样量:10μl;
参照峰:丹酚酸B色谱峰;
洗脱程序:梯度洗脱,洗脱时间为90min;
b.供试品溶液制备:精密称取复方丹参片,置于容量瓶中,加50%乙醇超声溶解,定容,过滤,得到滤液,即供试品溶液;
c.指纹图谱建立:将b步骤制得的供试品溶液利用高效液相色谱法进行检测,得到复方丹参片指纹图谱,其中色谱条件为步骤a中所述的色谱条件。
2.根据权利要求1所述的复方丹参片指纹图谱的检测方法,其特征在于所述b步骤具体为:取复方丹参片,研细,精密称取0.5g,置于25ml容量瓶中,加50%乙醇超声溶解,定容,过滤,得到滤液,即供试品溶液;所述超声处理的功率为300w,频率为50kHz,处理时间为30min;其中过滤采用的滤膜为孔径0.45μm的微孔滤膜。
3.根据权利要求1或2所述的复方丹参片指纹图谱的检测方法,其特征在于所述a步骤中的洗脱程序具体为:
0-5min时,流动相A为6-20%的乙腈,流动相B为80-94的0.1%的磷酸溶液;
5-30min时,流动相A为20-25%的乙腈,流动相B为75-80的0.1%的磷酸溶液;
30-45min时,流动相A为25-32%的乙腈,流动相B为68-75的0.1%的磷酸溶液;
45-70min时,流动相A为32-70%的乙腈,流动相B为30-68的0.1%的磷酸溶液;
70-90min时,流动相A为70-90%的乙腈,流动相B为10-30的0.1%的磷酸溶液。
4.根据权利要求1或2所述的复方丹参片指纹图谱的检测方法,其特征在于:利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004》对经过c步骤得到的复方丹参片指纹图谱进行评价,得到复方丹参片的对照指纹图谱。
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