CN110763793A - 一种丹参及产品的有效成分检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种丹参及产品的有效成分检测方法，该方法包括以下步骤：供试品溶液的制备、对照品溶液的制备和样品检测。本发明首次对丹参及其制剂中所含丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA等指标性成分同时进行检测，实现对丹参药材及其制剂质量进行更加全面的评价和控制。节约了检测时间和成本，不仅准确且简单易行。本发明稳定性好，重复性好，回收率高，具有较强的专属性。

Description

一种丹参及产品的有效成分检测方法

技术领域

本发明涉及一种有效成分检测方法，具体涉及一种丹参及产品的有效成分检测方法，属于中药材及其制剂质量检测领域。

背景技术

紫丹参为唇形科植物丹参的干燥根和根茎，主要产于云南、山西、河北、山东、陕西、江苏、江西及湖南等地。紫丹参味苦、微辛、性微寒,具有养血安神、活血祛瘀、凉血消肿等功效。不仅具有活血化淤、清热解毒、镇痛、安神之功，还可扩张血管，增加冠状动脉血流量。临床上主要用于治疗冠心病、高血压、动脉粥样硬化等心脑血管疾病，除此外也用于治疗肝纤维化、消化性溃疡、记忆缺失、艾滋病等。

紫丹参主要的脂溶性成分是丹参酮类和丹酚酸类成分。吴春艳等利用正相、反相、凝胶、制备TCL等分离技术，从紫丹参中分离鉴定了85个化合物包括 66个二萜类化合物，5个倍半萜类化合物。现有技术采用DiaionHP20大孔吸附树脂、Sephadex LH-20凝胶、ODS等柱色谱对紫丹参中酚酸类成分进行分离纯化，从紫丹参中分离并鉴定了原儿茶醛、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸C、紫草酸、紫草酸B、9′-紫草酸B甲酯等12个酚酸类化合物。朱路平等采用正相硅胶柱色谱、反相硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、MCI柱色谱、以及制备TCL等分离技术，从紫丹参中共分离得到迷失香酚等27个化合物。

三七总皂苷(Total saponins of Panax notognseng，PNS)是从五加科人参属植物三七中提取的有效成分群，是三七的主要活性成分，主要含有人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rg₁、三七皂苷R₁、人参皂苷Re和人参皂苷Rd等单体皂苷。现代药理研究表明，PNS具有抗血栓、抗心律失常、抗动脉粥样硬化、抗心脑缺血、消肿镇痛、镇静、益智、抗炎、抗氧化、抗纤维化等作用。临床上广泛用于心脑血管系统、呼吸系统、消化系统、泌尿系统疾病的治疗，如高黏血症、高脂血症、冠心病、高血压、慢性呼吸衰竭、肝纤维化、糖尿病肾病等。紫丹参中丹参素、丹酚酸B等丹参水溶性成分主要作用于血管，起效快，主要作用是扩张冠状动脉，增加冠脉血流量，立足于活血止痛。三七总皂苷类主要作用于心肌，起效相对较慢，主要作用是启动内源性保护物质的释放，加强心肌缺血预适应，保护心肌，立足于补益气血，而紫丹参脂溶性成分又能协同以上两类组分，改善心脏功能。

目前开发了很多与紫丹参相关的制剂产品。如云南楚雄天利药业有限公司生产的紫丹活血片、紫丹活血滴丸和四川泰华堂生产的紫丹活血胶囊，两者都具有活血化瘀、理气止痛的功效，主要用于气滞血瘀所致的胸痹(冠心病心绞痛)、眩晕(脑动脉硬化症)。而在目前的药品质量标准中只把药品中的三七总皂苷作为检测指标，未将紫丹参中所含有效成分作为检测指标，进行含量控制，故指标单一，不能全面的反映紫丹活血片药品等的质量。紫丹参及丹参化学成分丰富，现行的2015版《中国药典》以隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA及丹酚酸B作为检测指标，虽然两类成分都含有，但两类成分，需分开检测不能同时的检测丹参药材两类成分的含量，不利于操作。

目前关于紫丹参及丹参多成分的含量测定方法已有文献报道，HPLC的检测方法做到了丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B等丹酚酸类成分的同测，也报道过二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA等丹参酮类成分的同测。但是紫丹参药材的酚酸类及丹参酮类多成分同测少见报道，因此，在已有研究基础上，建立一种快速、全面、针对性强的紫丹参药材及紫丹活血系列制剂质量检测方法具有重要的意义。

发明内容

为了全面的对紫丹参药材及紫丹活血系列制剂质量进行控制，本发明所要解决的技术问题在于现有技术中紫丹参药材及其紫丹活血系列制剂检测指标单一，不利于紫丹参药材及紫丹活血系列制剂的质量控制，进而提供一种快速、全面、针对性强的一种丹参及产品的有效成分检测方法。

本发明的技术方案具体如下：

一种丹参及产品的有效成分检测方法，有效成分包括丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的含量；该方法包括以下步骤：

步骤(1)、供试品溶液的制备：

对于粉末或固体样品，过筛后，精密称定，置容器中，精密加入甲醇，密塞，称定重量，超声或回流，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

步骤(2)、对照品溶液的制备：

精密称取待检测成分的对照品适量，加50％～100％甲醇配制成对照品溶液；步骤(3)、样品检测：

色谱条件如下：

色谱柱以碳十八烷基键合硅胶为填充剂，流速为0.5～2.0mL/min，柱温为 20℃～40℃；检测波长为260nm～320nm中的一个或两个波长；进样量5～20μl；流动相为甲醇或乙腈与甲酸或磷酸组成的混合溶剂；甲酸或磷酸水溶液含甲酸或磷酸的浓度为0.01％～1.0％；按下表进行梯度洗脱；

分别吸取混合对照品溶液与供试品溶液各5～20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

进一步地，步骤(1)中：对于粉末或固体样品，过筛，取0.05～1.5g样品，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％～100％甲醇5～100mL，密塞，称定重量，超声或回流30～60分钟，放冷，再称定重量，用50％～100％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

进一步地，步骤(2)中，每毫升对照品溶液中含丹参素钠4.12～41.2μg、迷迭香酸3.08～30.8μg、紫草酸5.68～56.8μg、丹酚酸B101～1010μg、二氢丹参酮Ⅰ1.596～11.596μg、隐丹参酮3.52～35.2μg、丹参酮Ⅰ1.64～16.664μg、丹参酮ⅡA4.2～42μg的溶液，即得。

进一步地，步骤(2)中，每毫升对照品溶液中含丹参素钠16.48μg、迷迭香酸12.32μg、紫草酸22.72μg、丹酚酸B404μg、二氢丹参酮Ⅰ6.384μg、隐丹参酮14.08μg、丹参酮Ⅰ6.656μg以及丹参酮ⅡA16.80μg。

进一步地，步骤(3)中，色谱条件：流速为1mL/min，柱温为25℃；检测波长为275nm；进样量10μl；流动相为：A-乙腈，B-0.1％磷酸水溶液；按下表进行梯度洗脱；

进一步地，供试品溶液包括紫丹参药材、丹参药材和由紫丹参为主药制备的紫丹活血系列制剂；所述制剂包括：紫丹活血片、紫丹活血胶囊、紫丹活血滴丸。

通过以下实验研究对本发明进行进一步说明。

(1)色谱柱的选择：根据本发明建立的HPLC检测方法所选的检测指标包括大极性、中等极性及小极性的成分，所以选择反相C18色谱柱。

(2)检测波长的选择：对丹参素钠等8个成分进行全波长扫描，结果丹参酸在230nm、280nm处；迷迭香酸在327nm；紫草酸在305nm、230nm处；丹酚酸B在286nm处；二氢丹参酮Ⅰ在240nm处；隐丹参酮在260nm处、丹参酮Ⅰ在245nm处、丹参酮ⅡA在270nm处有最大吸收，综合上述各成分的最大吸收波长，同时兼顾含量较低的成分，最终决定选用260～320nm中的一个或两个波长作为检测波长。

(3)流动相系统的选择：以乙腈(A)-磷酸(B)溶液、乙腈-甲酸(B) 溶液的流动相系统为因素进行考察，结果发现，使用不同流动相系统，对各有效成分的峰形及分离度影响不同，乙腈(A)-磷酸(B)溶液流动相系统下各成分分离度、拖尾因子、理论塔板数均较其它两个流动相条件要好，所以最终选用乙腈(A)-磷酸(B)溶液流动相系统。

(4)供试品的处理方式选择：由于所选检测指标大极性、中等极性、小极性的成分均有，其中还包括热不稳定性成分，综合考虑各成分的化学性质，初步选定对50％甲醇、80％甲醇、100％甲醇三种溶剂，超声和回流提取两种方式进行考察。结果发现50％～100％甲醇为溶剂，各个成分均能提取出来，故选用 80％～100％甲醇作为提取溶剂。

(5)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为2750nm；柱温25℃。理论塔板数按丹参酮ⅡA峰计算应不低于6000。

(6)专属性实验：

紫丹参药材：在相同试验条件下，采用混合对照品溶液和紫丹参供试品溶液作对照，以甲醇作阴性对照。参照(5)所述方法进行测定。结果混合对照品溶液各成分的峰出现在含有紫丹参原药材的供试品溶液中，而在阴性对照溶液中不出现，表明该实验方法应用于紫丹参药材检测具有专属性。

紫丹活血片：在相同试验条件下，采用混合对照品溶液和紫丹活血片供试品溶液作对照，以不含紫丹参成分的阴性紫丹活血片的阴性对照溶液及单纯溶剂样品作阴性对照。参照(5)所述方法进行测定。结果混合对照品溶液各成分的峰出现在含有紫丹活血片的供试品溶液中，而在阴性对照溶液中不出现，表明该实验方法用于紫丹活血片检测具有专属性。

紫丹活血滴丸：在相同试验条件下，采用混合对照品溶液和紫丹活血滴丸供试品溶液作对照，以不含紫丹参成分的阴性紫丹活血滴丸的阴性对照溶液及单纯溶剂样品作阴性对照。参照(5)所述方法进行测定。结果混合对照品溶液各成分的峰出现在含有紫丹活血滴丸的供试品溶液中，而在阴性对照溶液中不出现，表明该实验方法用于紫丹活血滴丸检测具有专属性。

紫丹活血胶囊：在相同试验条件下，采用混合对照品溶液和紫丹活血胶囊供试品溶液作对照，以不含紫丹参成分的阴性紫丹活血胶囊的阴性对照溶液及单纯溶剂样品作阴性对照。参照(5)所述方法进行测定。结果混合对照品溶液各成分的峰出现在含有紫丹活血胶囊的供试品溶液中，而在阴性对照溶液中不出现，表明该实验方法用于紫丹活血胶囊检测具有专属性。

其中，混合对照品溶液的液相色谱图如图1所示。紫丹参药材样品溶液的液相色谱图如图2所示。单纯溶剂阴性对照溶液的液相色谱图如图3所示。紫丹活血片样品溶液的液相色谱图如图4所示。

紫丹活血片阴性样品溶液的液相色谱图如图5所示。紫丹活血滴丸样品溶液的液相色谱图如图6所示。

紫丹活血滴丸阴性样品溶液的液相色谱图如图7所示。

紫丹活血胶囊样品溶液的液相色谱图如图8所示。紫丹活血胶囊阴性样品溶液的液相色谱图如图9所示。

对于单纯溶剂样品：取适量50％～100％甲醇，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

(7)线性关系：取各对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇溶解，配制成每1mL含丹参素钠42μg、迷迭香酸30.8μg、紫草酸56.8μg、丹酚酸 B1010μg、二氢丹参酮Ⅰ159.6μg、隐丹参酮35.2μg、丹参酮Ⅰ16.8μg以及丹参酮ⅡA42μg的溶液，作为对照品储备液。分别精密吸取0mL、1.0mL、2.0mL、 4.0mL、6.0mL、8.0mL、10mL混合对照品储备液置10mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得。分别精密吸取各混合对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，参照(5)所述方法测定，结果丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸 B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA分别在4.12～41.2μg/mL、 3.08～30.8μg/mL、5.68～56.8μg/mL、101～1010μg/mL、1.596～11.596μg/mL、 3.52～35.2μg/mL、1.64～16.664μg/mL、4.2～42μg/mL范围内具有良好的线性关系；结果见表1。

表1线性关系考察结果

(8)精密度考察：精密量取专属性考察项下混合对照品溶液10μl，参照(5) 所述方法注入液相色谱仪，连续进样6次测定。结果表明各成分的RSD％在 0.27～0.69之间。表明仪器精密度好，结果见表2。

表2精密度实验结果表

成分	RSD％
		丹参素钠	0.69
迷迭香酸	0.48
		紫草酸	0.36
丹酚酸B	0.31
		二氢丹参酮Ⅰ	0.31
隐丹参酮	0.33
		丹参酮Ⅰ	0.27
丹参酮ⅡA	0.34

(9)重复性考察：将紫丹参药材及其相关制剂各制备6份平行供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，参照(5)所述方法测定。结果表明：各成分RSD％在0.29～3.97之间，重复性好。结果见表3。

表3紫丹参药材及相关制剂重复性实验结果表

(10)稳定性考察：制备紫丹参药材及其相关制剂供试品溶液，分别于0h， 2h，4h，6h，8h，10h，12h，24h精密吸取上述溶液10μl，注入液相色谱仪。按 (5)所述方法测定，结果表明供试品溶液在室温放置24h内稳定，RSD％在 0.19～3.38之间。结果见表4。

表4紫丹参药材及其相关制剂稳定性实验结果表

(11)加样回收率试验：

紫丹参药材：精密称取紫丹参药材粉末(过三号筛)(丹参素钠含量0.083％、迷迭香酸含量0.215％、紫草酸含量0.244％、丹酚酸B含量4.908％、二氢丹参酮Ⅰ含量0.133％、隐丹参酮0.264％、丹参酮Ⅰ含量0.064％、丹参酮ⅡA含量 0.293％)6份，每份约0.25g，精密称定，加入混合对照品储备液4mL(4mL 含丹参素钠0.2112mg、迷迭香酸0.5392mg、紫草酸0.5952mg、丹酚酸B12.32mg、二氢丹参酮Ⅰ0.3292mg、隐丹参酮0.6576mg、丹参酮Ⅰ0.1632mg、丹参酮ⅡA 0.7424 mg)，置250mL具塞锥形瓶中，加甲醇50mL，称定重量，密塞，超声30min，放冷，再次称定重量，甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液滤过，取续滤液，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。取6份供试品溶液，根据(5)所述条件测定丹参素钠等8个成分的峰面积，计算各成分的含量、回收率。结果各成分平均回收率在97.79％～102.33％，RSD％在0.64～2.25之间。表明加入的对照品能准确、重现地回收，测定方法准确可靠。试验结果见表5。

表5紫丹参药材-加样回收结果表

紫丹活血片：取已知含量(丹参素钠0.156％、迷迭香酸0.173％、紫草酸 0.218％、丹酚酸B 3.788％、二氢丹参酮Ⅰ0.069％、隐丹参酮0.144％、丹参酮Ⅰ0.110％、丹参酮ⅡA0.180％)的紫丹活血片样品粉末0.05g，精密称定，加入混合对照品储备液1mL(1mL含丹参素钠0.0750mg、迷迭香酸0.0810、紫草酸 0.1090mg、丹酚酸B1.9000mg、二氢丹参酮Ⅰ0.0352mg、隐丹参酮0.0700mg、丹参酮Ⅰ0.0560mg、丹参酮ⅡA0.0880mg)对照品适量，平行制备6份，置10mL 容量瓶中，精密加入甲醇至刻度，密塞，超声处理(功率140W，频率42kHz) 20分钟，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，既得。取6份供试品溶液，根据(5)所述条件测定丹参素钠等8个成分的峰面积，计算各成分的含量、回收率。结果各成分平均回收率在96.92％～102.07％，RSD％在0.69～2.86％之间。表明加入的对照品能准确、重现地回收，测定方法准确可靠。试验结果见表6。

表6紫丹活血片-加样回收结果表

紫丹活血滴丸：取已知含量(丹参素钠0.117％、迷迭香酸0.111％、紫草酸0.147％、丹酚酸B 2.646％、二氢丹参酮Ⅰ0.036％、隐丹参酮0.087％、丹参酮Ⅰ、 0.059％、丹参酮ⅡA 0.109％)的紫丹活血滴丸粉末0.1g，精密称定，精密加入丹参素钠、迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA对照品1mL(1mL含丹参素钠0.1168mg、迷迭香酸0.1112、紫草酸0.1464mg、丹酚酸B2.6500mg、二氢丹参酮Ⅰ0.0376mg、隐丹参酮0.0872mg、丹参酮Ⅰ0.0592mg、丹参酮ⅡA0.1088mg)，置具塞10mL容量瓶中，精密加入甲醇至刻度，密塞，超声处理(功率140W，频率42kHz)30分钟，摇匀，用0.45μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，既得。平行制备6份，根据(5)所述条件测定丹参素钠等8个成分的峰面积，计算各成分的含量、回收率。结果各成分平均回收率在97.31％～102.96％之间，RSD％在1.26～3.06％之间。表明加入的对照品能准确、重现地回收，测定方法准确可靠。试验结果见表7。

表7紫丹活血滴丸-加样回收结果表

紫丹活血胶囊：取已知含量(丹参素钠0.1570％、迷迭香酸0.1710％、紫草酸0.2200％、丹酚酸B 3.7860％、二氢丹参酮Ⅰ0.0688％、隐丹参酮0.1442％、丹参酮Ⅰ0.1105％、丹参酮ⅡA 0.1802％)的紫丹活血胶囊样品粉末0.05g，精密称定，加入混合对照品储备液1mL(1mL含丹参素钠0.0750mg、迷迭香酸0.0810、紫草酸0.1100mg、丹酚酸B1.9000mg、二氢丹参酮Ⅰ0.0352mg、隐丹参酮 0.0700mg、丹参酮Ⅰ0.0560mg、丹参酮ⅡA0.0880mg)对照品适量，平行制备6 份，置10mL容量瓶中，精密加入甲醇至刻度，密塞，超声处理(功率140W，频率42kHz)20分钟，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，既得。取6 份供试品溶液，根据(5)所述条件测定丹参素钠等8个成分的峰面积，计算各成分的含量、回收率。结果各成分平均回收率在98.38％～102.21％，RSD％在 0.82～3.99％之间。表明加入的对照品能准确、重现地回收，测定方法准确可靠。试验结果见表8。

表8紫丹活血滴丸-加样回收结果表

(12)耐用性实验：制备供试品溶液3份，精密吸取供试品溶液10μl，分别在不同变动因素：设备、色谱柱、柱温下分别进样，记录丹参素钠等8个成分的峰面积，计算含量，考察色谱条件的耐用性。结果各条件下，各成分含量的RSD％值均小于5％，表明该色谱条件耐用性良好。结果见表9～12。

表9紫丹参药材-耐用性实验结果表

表10紫丹活血片-耐用性实验结果表

表11紫丹活血滴丸-耐用性实验结果表

表12紫丹活血胶囊-耐用性实验结果表

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)本发明选择的检测指标丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA，它们既是紫丹参药材中丹酚酸类和丹参酮类的代表性化学成分，更是主要的药理活性成分。本发明通过高效液相色谱法对丹参8个成分进行检测，全面的涵盖了紫丹参的主要药效成分，节约了检测时间和成本，不仅准确且简单易行。实现了对紫丹参药材及紫丹活血系列制剂质量的全面评价和控制，从而紫为丹参药材及紫丹活血系列制剂临床用药的有效性、安全性提供了保障。本发明稳定性好，重复性好，回收率高，具有较强的专属性。

(2)本发明建立的紫丹参药材的HPLC含量测定方法，不仅能对药材进行质量控制，采用此色谱条件也能对相关制剂进行检测，更加突出的是能全面对紫丹参及其制剂中中丹参酮类、丹酚酸类的指标性成分进行同时检测，实现对丹参药材及其制剂质量进行更加全面的评价和控制。本发明操作简便，适用性好，能稳定的用于丹参药材及其制剂的含量测定。且本发明选择的检测指标均为丹参药材中含量较高，且具有药理活性的成分。能够为丹参药材及紫丹活血系列制剂临床应用的安全性及有效性提供依据。

附图说明

图1为本发明的混合对照品溶液的液相色谱图；

图2为本发明的紫丹参药材样品溶液的液相色谱图；

图3为本发明的单纯溶剂阴性对照溶液的液相色谱图；

图4为本发明的紫丹活血片样品溶液的液相色谱图；

图5为本发明的紫丹活血片阴性样品溶液的液相色谱图；

图6为本发明的紫丹活血滴丸样品溶液的液相色谱图；

图7为本发明的紫丹活血滴丸阴性样品溶液的液相色谱图；

图8为本发明的紫丹活血胶囊样品溶液的液相色谱图；

图9为本发明的紫丹活血胶囊阴性样品溶液的液相色谱图。

具体实施方式

为了使本发明的技术方案易于了解，下面结合具体实例做进一步说明，但不限于本发明。在不脱离本发明原理前提下，做出的修饰和改进，这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例针对云南楚雄产紫丹参药材的有效成分的检测方法。

本实施例基于HPLC测定云南楚雄产紫丹参药材中的丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA含量，包括如下步骤：

步骤(1)、对照品溶液的制备：

精密称取丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA对照品适量，加甲醇配制成每1mL含丹参素钠16.48μg、迷迭香酸12.32μg、紫草酸22.72μg、丹酚酸B404μg、二氢丹参酮Ⅰ6.384μg、隐丹参酮14.08μg、丹参酮Ⅰ6.656μg以及丹参酮ⅡA16.80μg的对照品溶液。即得。

步骤(2)、供试品溶液的制备：

取不同产地试验样品，取本品粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液滤过，取续滤液，即得。

步骤(3)、色谱条件：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为275nm；柱温25℃。理论塔板数按丹参酮ⅡA峰计算应不低于6000。

分别吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

紫丹参样品产地及含量测定结果见表13。

表13紫丹参样品含量测定结果

根据含量检测结果来看，该法可稳定用于紫丹参药材含量检测。

实施例2

本实施例针对野生紫丹参药材的有效成分的检测方法。

本实施例基于HPLC测定野生紫丹参药材中的丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA含量，包括如下步骤：

步骤(1)、对照品溶液的制备：

精密称取丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA对照品适量，加甲醇配制成每1mL含丹参素钠4.120μg、迷迭香酸3.080μg、紫草酸5.680μg、丹酚酸B101μg、二氢丹参酮Ⅰ1.596μg、隐丹参酮3.520μg、丹参酮Ⅰ1.640μg以及丹参酮ⅡA4.200μg的对照品溶液。即得。

步骤(2)、供试品溶液的制备：

取不同产地试验样品，取本品粉末(过三号筛)，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇20mL，密塞，称定重量，水浴回流处理40 分钟，放冷，再称定重量，用90％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液滤过，取续滤液，即得。

步骤(3)、色谱条件：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.01％甲酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为260nm；柱温30℃。理论塔板数按丹参酮ⅡA峰计算应不低于6000。

分别吸取混合对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

紫丹参样品产地及含量测定结果见表14。

表14紫丹参样品含量测定结果表

根据含量检测结果来看，该法可稳定用于丹紫参药材含量检测。

实施例3

本实施例针对丹参药材中的有效成分的检测方法。

本实施例基于HPLC测定各省份丹参药材中的丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA含量，包括如下步骤：

步骤(1)、对照品溶液的制备：

精密称取丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA对照品适量，加甲醇配制成每1mL含丹参素钠41.20 μg、迷迭香酸30.80μg、紫草酸56.80μg、丹酚酸B1010μg、二氢丹参酮Ⅰ15.96 μg、隐丹参酮35.20μg、丹参酮Ⅰ16.40μg、丹参酮ⅡA42.00μg的溶液，即得。

步骤(2)、供试品溶液的制备：

取不同产地试验样品，取本品粉末(过三号筛)，取约1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇100mL，密塞，称定重量，加热回流50分钟，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液滤过，取续滤液，即得。

步骤(3)、色谱条件：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以1.0％磷酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为260nm及310nm；柱温40℃。理论塔板数按丹参酮ⅡA峰计算应不低于6000。

分别吸取混合对照品溶液与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

丹参样品产地及含量测定结果见表15。

表15丹参样品含量测定结果

根据含量检测结果来看，该法可稳定用于丹参药材含量检测。

实施例4

本实施例针对紫丹活血片中的有效成分的检测方法。

本实施例基于HPLC测定紫丹活血片中的丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA含量，包括如下步骤：

步骤(1)、对照品溶液的制备：

精密称取丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA对照品适量，加甲醇配制成每1mL含丹参素钠16.48μg、迷迭香酸12.32μg、紫草酸22.72μg、丹酚酸B404μg、二氢丹参酮Ⅰ6.384μg、隐丹参酮14.08μg、丹参酮Ⅰ6.656μg以及丹参酮ⅡA16.80μg的对照品溶液，即得。

步骤(2)供试品溶液的制备：

取不同批次紫丹活血片(研细，过三号筛)样品0.05g，精密称定，置10mL 容量瓶中，精密加入甲醇至刻度，密塞，超声处理30分钟，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，既得。

步骤(3)色谱条件：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为275nm；柱温25℃。理论塔板数按丹参酮ⅡA峰计算应不低于6000。

分别吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

紫丹活血片含量测定结果见表16。

表16紫丹活血片样品含量测定结果

实施例5

本实施例针对紫丹活血滴丸中的有效成分的检测方法。

本实施例基于HPLC测定紫丹活血滴丸中的丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA含量

步骤(1)、对照品溶液的制备：

精密称取丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA对照品适量，加甲醇配制成每1mL含丹参素钠16.48μg、迷迭香酸12.32μg、紫草酸22.72μg、丹酚酸B404μg、二氢丹参酮Ⅰ6.384μg、隐丹参酮14.08μg、丹参酮Ⅰ6.656μg以及丹参酮ⅡA16.80μg的对照品溶液，即得。

步骤(2)、供试品溶液的制备：

取紫丹活血滴丸粉末(过三号筛)样品0.1g，精密称定，置10mL容量瓶中，精密加入80％甲醇10mL，密塞，超声处理30分钟，取出，摇匀，用0.45μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，既得。

步骤(3)色谱条件：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为280nm；柱温20℃。理论塔板数按丹参酮ⅡA峰计算应不低于6000。

分别吸取混合对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

紫丹活血滴丸含量测定结果见表17。

表17紫丹活血滴丸样品含量测定结果

实施例6

本实施例针对紫丹活血胶囊中的有效成分的检测方法。

本实施例基于HPLC测定紫丹活血胶囊中的丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA含量，包括如下步骤：

步骤(1)、对照品溶液的制备：

精密称取丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA对照品适量，加甲醇配制成每1mL含丹参素钠16.48μg、迷迭香酸12.32μg、紫草酸22.72μg、丹酚酸B404μg、二氢丹参酮Ⅰ6.384μg、隐丹参酮14.08μg、丹参酮Ⅰ6.656μg以及丹参酮ⅡA16.80μg的对照品溶液，即得。

步骤(2)供试品溶液的制备：

取紫丹活血胶囊，去除外壳，研细过三号筛，取紫丹活血胶囊粉末0.15g，精密称定，置250mL锥形瓶中，加90％甲醇30mL，称定重量，水浴回流处理 30min，放冷，称定重量，用90％甲醇补足重量，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，即得。

步骤(3)色谱条件：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为270nm；柱温30℃。理论塔板数按丹参酮ⅡA峰计算应不低于6000。

分别吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

紫丹活血胶囊含量测定结果见表18。

表18紫丹活血胶囊样品含量测定结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种丹参及产品的有效成分检测方法，其特征在于：有效成分包括丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的含量；该方法包括以下步骤：

步骤（1）、供试品溶液的制备：

对于粉末或固体样品，过筛后，精密称定，置容器中，精密加入甲醇，密塞，称定重量，超声或回流，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

步骤（2）、对照品溶液的制备：

精密称取待检测成分的对照品适量，加50%~100%甲醇配制成对照品溶液；

步骤（3）、样品检测：

色谱条件如下：

色谱柱以碳十八烷基键合硅胶为填充剂，流速为0.5~2.0mL/min，柱温为20℃~40℃；检测波长为260nm~320nm中的一个或两个波长；进样量5~20μl；流动相为甲醇或乙腈与甲酸或磷酸组成的混合溶剂；甲酸或磷酸水溶液含甲酸或磷酸的浓度为0.01%~1.0%；按下表进行梯度洗脱；

分别吸取混合对照品溶液与供试品溶液各5~20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.根据权利要求1所述的丹参及产品的有效成分检测方法，其特征在于：步骤（1）中：对于粉末或固体样品，过筛，取0.05~1.5 g样品，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%~100%甲醇5~100 mL，密塞，称定重量，超声或回流30~60分钟，放冷，再称定重量，用50%~100%甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

3.根据权利要求1所述的丹参及产品的有效成分检测方法，其特征在于：步骤（2）中，每毫升对照品溶液中含丹参素钠4.12~41.2μg、迷迭香酸3.08~30.8μg、紫草酸5.68~56.8μg、丹酚酸B 101~1010μg、二氢丹参酮Ⅰ1.596~11.596μg、隐丹参酮3.52~35.2μg、丹参酮Ⅰ1.64~16.664μg、丹参酮ⅡA4.2~42μg的溶液，即得。

4.根据权利要求1所述的丹参及产品的有效成分检测方法，其特征在于：步骤（2）中，每毫升对照品溶液中含丹参素钠16.48μg、迷迭香酸12.32μg、紫草酸22.72μg、丹酚酸B404μg、二氢丹参酮Ⅰ 6.384μg、 隐丹参酮14.08μg、丹参酮Ⅰ 6.656μg以及丹参酮ⅡA16.80μg。

5.根据权利要求1所述的丹参及产品的有效成分检测方法，其特征在于：步骤（3）中，色谱条件：流速为1mL/min，柱温为25℃；检测波长为275nm；进样量10μl；流动相为：A-乙腈，B-0.1%磷酸水溶液；按下表进行梯度洗脱；

。

6.根据权利要求1所述的丹参及产品的有效成分检测方法，其特征在于：供试品溶液包括紫丹参药材、丹参药材和由紫丹参为主药制备的紫丹活血系列制剂；所述制剂包括：紫丹活血片、紫丹活血胶囊、紫丹活血滴丸。

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