CN102441057B - 一种养血清脑颗粒的hplc指纹图谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种养血清脑颗粒的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于，经过以下步骤：1)养血清脑颗粒供试品溶液的制备，精密称定养血清脑颗粒用3∶1甲醇-水配制成溶液，作为制剂供试品溶液；2)将步骤1得到的溶液注入高效液相色谱仪进行测定，分别得到它的色谱图。本发明根据的养血清脑颗粒自身特点，我们采用高效液相色谱法测定养血清脑颗粒的指纹图谱，找到了优化的色谱条件，使测定结果精密，重复性和稳定性良好。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种养血清脑颗粒的HPLC指纹图谱检测方法。
背景技术
养血清脑颗粒是由当归、川芎、白芍、钩藤、鸡血藤、熟地黄、决明子、夏枯草、细辛、延胡索和珍珠母11味中药，采用现代化制剂工艺技术精制而成，具有养血平肝、活血通络的作用，用于血虚肝亢所致的头痛、眩晕眼花、心烦易怒、失眠多梦等症，是受国家重点保护的中药品种。
其中当归和川芎中所共有的指标性成分阿魏酸，被研究证明具有舒张血管、升高血清白蛋白和防治脂质过氧化损伤等作用，被普遍用于防治偏头痛、冠心病和糖尿病周围神经病变等临床多发症；川芎，夏枯草和钩藤中所共有的咖啡酸被证明具有阻遏脑内MDA含量增加和SOD活性降低的功能，被用于改善学习记忆能力障碍；夏枯草中的迷迭香酸和决明子中的黄芩苷，也被分别证明具有改善肾小球高滤过状态，抑制细胞外基质增生和解除发热，抗焦虑等作用，是养血清脑颗粒中的重要有效成分。
作为多维组分复杂样品的整体性评价中药质量的有效控制手段，中药指纹图谱是目前能够为国内外广泛接受的全面评价中药质量模式的一种方法。美国FDA在植物药制品指导原则中允许申报者提供产品的色谱指纹图谱资料，德国药用植物学会、英国草药典、印度草药典以及加拿大药用及芳香植物学会也都把指纹图谱作为质量控制标准的内容之一。目前有关于养血清脑颗粒指纹图谱方面的研究在国内外尚未见报道，为了更好地控制其质量，保证临床用药的安全性和有效性，本实验采用HPLC法对其指纹图谱进行了初步研究，在方法学考察的基础上建立了养血清脑颗粒的高效液相指纹图谱，并考察制剂中共有峰在药材中的归属，为其质量控制提供了更全面的信息。
发明内容
本发明提供一种养血清脑颗粒的HPLC指纹图谱检测方法，该方法经过以下步骤：
1)养血清脑颗粒供试品溶液的制备，精密称定养血清脑颗粒用3∶1甲醇-水配制成溶液，作为制剂供试品溶液；
2)将步骤1得到的溶液注入高效液相色谱仪进行测定，分别得到它的色谱图。
本发明所述的方法，其中所用的甲醇-水的体积比为3∶1，采用超声提取。
本发明所述的方法，其中所述的检测方法中，步骤2所述的液相色谱采用Agilent Zorbax C18柱。
本发明所述的方法，其中所述的检测方法中，步骤2所述的液相色谱采用乙腈-0.5％甲酸做流动相。
本发明所述的方法，其中所述的检测方法中，步骤2所述的液相色谱条件：
色谱柱：Agilent Zorbax C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；流动相：A(0.5％甲酸)-B(乙腈)，线性梯度洗脱：0～20min，B(5％～13％)；20～49min，B(13％～30％)；49～98min，B(30％～75％)；流速为1.0mL·min-1；柱温：40℃；检测波长：0～32min为327nm，32～98min为280nm；进样量：10μL；
本发明还提供了一种养血清脑颗粒的检测方法，包括以下步骤：
(A)取合格的养血清脑颗粒产品，按照上述方法建立养血清脑颗粒标准指纹图谱；
(B)取待检养血清脑颗粒，按照上述方法得到指纹图谱；
(C)将步骤(B)得到的指纹图谱和步骤(A)得到的标准指纹图谱进行比对，符合即为合格产品，不符合即为不合格产品。
本发明优选的测定方法包括采用以下仪器和药品：Agilent1200高效液相色谱仪及Finnigan TSQ Quantum Discovery液质联用系统；Milli-Q超纯水系统(法国Millipore公司)；甲醇、乙腈均为色谱纯；对照品阿魏酸，咖啡酸，迷迭香酸和黄芩苷均购自中国药品生物制品检定所；养血清脑颗粒由天津天士力制药股份有限公司提供。
本发明的检测方法，其色谱条件经过方法学验证，结果良好。
精密度试验 取同一供试品溶液，连续进样5次，分别对各共有峰的相对保留时间及峰面积的变化情况进行考察，结果各共有峰保留时间的RSD小于0.12％，相对峰面积的RSD小于2.11％，说明仪器的精密度较好，符合指纹图谱分析的要求。
重复性试验 取同一批样品，制备5份制剂供试品溶液，分别进样，以14号峰作为参考，考察共有峰的保留时间及相对峰面积，结果各共有峰相对保留时间的RSD小于0.27％，相对峰面积的RSD小于3.89％，说明实验方法的重复性较好，符合指纹图谱分析的要求。
稳定性试验 取同一供试品溶液，分别放置0，2，4，8，12，24h，进样测定，以14号峰作为参考，考察共有峰的相对保留时间及相对峰面积的变化情况，结果各共有峰相对保留时间的RSD小于0.16％，相对峰面积的RSD小于3.57％，表明供试品溶液在24h内稳定，符合指纹图谱分析的要求。
指纹图谱的建立
指纹图谱的绘制 精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。测定10批养血清脑颗粒样品的指纹图谱，并借助国家药典委员会《中药指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件，分析10批样品的指纹图谱并生成共有峰对照指纹图谱(图1和图2)，同时相似度评价结果显示10批样品相似度情况良好(表1)。
表1、10批养血清脑颗粒指纹图谱的相似度测定结果
共有峰的确定 测定了10批养血清脑颗粒供试品溶液，比较其色谱图，以14号峰为参比峰(S)，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积。根据结果，确定35个共有色谱峰，相对保留时间的RSD均小于0.36％，相对峰面积的RSD均小于4.97％。对供试品溶液进行质谱测定，分别得到正负总离子流图(见图3)。将LC-MS/MS测定的结果与已有文献中关于药材化学成分的报道相比对，对制剂中部分化学成分进行定性归属，结果见表2。
质谱色谱条件如下：
仪器：Finnigan TSQ Quantum Discovery液质联用系统；检测模式：全扫描和子离子扫描；离子源：ESI(+)，雾化电压：4.0kV，鞘气压力：30Arb，辅助气压力：20Arb，毛细管温度：320℃，碰撞能量：30eV，扫描质核比范围：100～1000m/z；ESI(-)，雾化电压：3.5kV，鞘气压力：35Arb，辅助气压力：20Arb，毛细管温度：350℃，碰撞能量：35eV，扫描质核比范围：100～1000m/z。
表2、特征峰的初步鉴别
制剂与药材提取物相关性取10味药材及阴性药材提取物溶液各10μL，注入液相色谱仪，分别进样，对比各吸收峰的紫外吸收光谱和相对保留时间可知，养血清脑颗粒指纹图谱中的35个特征峰均可在药材中找到归属(表3)，制剂与药材之间存在良好的相关性。
表3、制剂色谱峰在药材中的归属
特征成分含量测定
线性关系 分别精密吸取对照品储备液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ适量，定量稀释制成含阿魏酸47.58，31.72，15.86，6.344，3.172μg·mL-1，咖啡酸43.68，29.12，14.56，5.824，2.912μg·mL-1，迷迭香酸251.3，167.5，83.75，33.5，16.75μg·mL-1，黄芩苷125.5，83.68，41.84，16.74，8.368μg·mL-1的混合标准溶液。分别量取10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以质量浓度(c，μg·mL-1)为横坐标，以峰面积(A)为纵坐标进行线性回归。线性回归方程：阿魏酸，A＝51.15c-12.57，r＝0.9999；咖啡酸，A＝52.26c-9.609，r＝0.9997；迷迭香酸，A＝13.16c-15.96，r＝0.9997；黄芩苷，A＝29.61c-17.41，r＝0.9998。结果表明，阿魏酸、咖啡酸、迷迭香酸和黄芩苷在上述质量浓度范围内均有良好的线性响应。
回收率 精密称取已知阿魏酸、咖啡酸、迷迭香酸和黄芩苷含量的样品0.25g，分别加入与样品中已知量相当的对照品后制备回收率测定用样品溶液，平行6份，测定结果表明4种成分回收率良好(表4)，符合中药质量控制要求。
表4、养血清脑颗粒中4种成分的回收率测定(n＝6)
样品测定 制备养血清脑颗粒供试品溶液，以外标法计算10批养血清脑颗粒样品中4种成分的含量，结果见表5。
表5、10批养血清脑颗粒中4种成分的含量
本发明的方法是经过特别优选出来的最适合的条件：
预处理方法的选择：
供试品溶液制备方法选择 实验首先考查了水，乙醇，甲醇3种提取溶剂和超声，冷浸两种提取方式。结果表明，当以甲醇-水(3∶1)作为提取剂时出峰最多，且超声和加热回流两种提取方式得到的色谱图峰数最多且无明显区别，因此鉴于操作简便选择甲醇-水(3∶1)为提取剂的超声提取体系。其次分别考察了超声10min，20min，30min和40min对提取效果的影响，结果超声时间为20min，30min和40min时所得到的色谱图无区别，说明超声20min即能提取完全。
色谱条件的选择：
色谱条件的选择 本实验选用了5根不同厂家的色谱柱：Agilent Zorbax C18(4.6mm×250mm，5μm)；Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)；Phenomenex Luna C18(4.6mm×250mm，5μm)；Agela Venusil XBP C18(4.6mm×250mm，5μm)；Dikma Diamond C18(4.6mm×250mm，5μm)进行实验筛选，比较分离度、峰型和柱效，结果表明Agilent Zorbax C18(4.6mm×250mm，5μm)较为合适。考察了不同溶剂系统作为流动相进行试验，如乙腈-水和甲醇-水等溶剂系统，结果表明乙腈-0.5％甲酸做流动相时基线平稳且样品分离效果最好。在实验过程中，利用DAD检测器中3D PLOT功能可以得出供试品溶液在280nm处存在的吸收峰最多，同时在327nm和254nm波长处也存在一定吸收。对3个波长下的色谱图进行比对，发现在32min前后分别是327nm波长下和280nm波长下的色谱峰数量最多，峰强度最大，且在前32min出峰的指标性成分阿魏酸在327nm下也有最大吸收，因此选择在色谱过程中变换波长的检测模式，从而提供更为全面的指纹信息。
药材及其阴性考察 由表3可以看出，10味中药材对养血清脑颗粒HPLC指纹图谱的出峰均有所贡献，且多个色谱峰同时归属于不同的药材，说明了中药化学成分的复杂性。而多数的色谱峰主要来源于当归，川芎和决明子，说明了这3味药材对于全方成分的重要性。
本发明的优点：根据的养血清脑颗粒自身特点，我们采用高效液相色谱法测定养血清脑颗粒的指纹图谱，找到了优化的色谱条件，使测定结果精密，重复性和稳定性良好。
附图说明
图1 10批养血清脑颗粒HPLC图谱
图2生成的对照指纹图谱
图3养血清脑颗粒一级质谱全扫描的正离子流图(A)和负离子流图(B)
具体实施方式
实施例1、检测方法
1 仪器与试药
Agilent1200高效液相色谱仪及Finnigan TSQ Quantum Discovery液质联用系统；Milli-Q超纯水系统(法国Millipore公司)；甲醇、乙腈均为色谱纯；对照品阿魏酸，咖啡酸，迷迭香酸和黄芩苷均购自中国药品生物制品检定所；养血清脑颗粒由天津天士力制药股份有限公司提供。
2 溶液的制备
标准供试品溶液 质量合格的10批养学清脑颗粒作为标准品，精密称定0.5g于10mL容量瓶中，加75％甲醇定容至刻度，超声20min后放至室温，用75％甲醇补足至刻度，0.45μm微孔滤膜过滤，作为制剂供试品溶液。
待测产品供试品溶液 精密称定待测养血清脑颗粒0.5g于10mL容量瓶中，加75％甲醇定容至刻度，超声20min后放至室温，用75％甲醇补足至刻度，0.45μm微孔滤膜过滤，作为制剂供试品溶液。
3 色谱条件
3.1液相色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；流动相：A(0.5％甲酸)-B(乙腈)，线性梯度洗脱：0～20min，B(5％～13％)；20～49min，B(13％～30％)；49～98min，B(30％～75％)；流速为1.0mL·min-1；柱温：40℃；检测波长：0～32min为327nm，32～98min为280nm；进样量：10μL。
4)将标准供试溶液和待测产品供试溶液分别注入高效液相色谱仪进行测定，分别得到它们的色谱图。
5)借助国家药典委员会《中药指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件，比较得到的标准指纹图谱和待测指纹图谱，相似度为0.98，合格。
Claims (2)
1.一种养血清脑颗粒的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于，经过以下步骤：
1)养血清脑颗粒供试品溶液的制备，精密称定养血清脑颗粒，用甲醇-水配制成溶液，作为制剂供试品溶液；
2)将步骤1）得到的溶液注入高效液相色谱仪进行测定，得到它的色谱图；
其中，步骤1）所用的甲醇-水的体积比为3：1，采用超声提取或加热回流提取；
其中，步骤2）所述的液相色谱条件：
色谱柱：型号Agilent Zorbax C18 ,4.6mm×250mm，5μm；流动相：A为0.5%甲酸，B为乙腈，线性梯度洗脱：0～20min，用5%～13%的B洗脱；20～49min，用13%～30%的B洗脱；49～98min，用30%～75%的B洗脱；流速为1.0mL·min-1；柱温：40℃；检测波长：0～32min为327nm，32～98min为280nm：进样量：10μL。
2.一种养血清脑颗粒的检测方法，包括以下步骤：
(A)取合格的养血清脑颗粒产品，按照权利要求1的方法建立养血清脑颗粒标准指纹图谱；
(B)取待检养血清脑颗粒，按照权利要求1的方法得到指纹图谱；
(C)将步骤(B)得到的指纹图谱和步骤(A)得到的标准指纹图谱进行比对，符合即为合格产品，不符合即为不合格产品。
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