CN113533614A - 小承气汤物质基准的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小承气汤物质基准的建立方法，其包括：采用薄层色谱法对大黄、厚朴、枳实进行鉴别，构建指纹图谱对小承气汤中的成分进行鉴别；采用高效液相色谱法对小承气汤中的总蒽醌含量、游离蒽醌含量、和厚朴酚含量、厚朴酚含量、柚皮苷含量、新橙皮苷含量、辛弗林含量进行测定，并计算结合蒽醌含量；其中，结合蒽醌含量＝总蒽醌含量‑游离蒽醌含量。本发明中的方法可为小承气汤质量控制提供数据基础，有效保证小承气汤产品质量的稳定性和可控性。

Description

小承气汤物质基准的建立方法

技术领域

本发明涉及中药质量分析检测技术领域，尤其涉及一种小承气汤物质基准的建立方法。

背景技术

小承气汤来源于东汉张仲景的《伤寒论》，由大黄、厚朴、枳实三味药组成。主治阳明腑实轻症而偏于痞满者，具有攻下通腑、轻下热结之良效。方中大黄荡涤肠胃，推陈致新；枳实破气消痞；厚朴下气除满。三者合用具有泻热通便、除满消滞的作用，在临床中得到广泛应用，常用于肠梗阻、术后胃肠功能障碍、便秘、慢性胃炎等的治疗。

小承气汤组方明确，疗效确切，现已被收录于国家中医药管理局发布的《古代经典名方目录(第一批)》中。近年来，为阐明小承气汤治疗疾病的物质基准，保障临床用药的有效性和安全性，许多学者对小承气汤中的化学成分和有效组分进行药理学、药效学和药动学等方面的研究，并且不断完善其质量标准，为经典名方的开发奠定了基础。

目前，对小承气汤的研究主要集中在药理学的研究方面，对其汤剂的物质基础、提取工艺、多指标成分含量测定及指纹图谱研究较少，缺少系统性。且对于如何衡量大生产制剂与传统汤剂质量的一致性也研究较少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种小承气汤物质基准的建立方法，该方法可为小承气汤大生产质量控制提供数据基础，保证小承气汤产品质量的稳定性和可控性。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种小承气汤物质基准的建立方法，所述小承气汤由以下组分组成：大黄、厚朴和枳实；所述建立方法包括：

(1)采用薄层色谱法对大黄、厚朴、枳实进行鉴别；

(2)构建指纹图谱对小承气汤中的成分进行鉴别；

(3)采用高效液相色谱法对小承气汤中的总蒽醌含量、游离蒽醌含量、和厚朴酚含量、厚朴酚含量、柚皮苷含量、新橙皮苷含量、辛弗林含量进行测定，并计算结合蒽醌含量；其中，结合蒽醌含量＝总蒽醌含量-游离蒽醌含量。

作为上述技术方案的改进，所述大黄的薄层色谱鉴别方法为：

(1)取小承气汤制剂0.2～0.5g，加甲醇20～30mL，超声处理30～60min，滤过，取滤液5mL，蒸干，残渣加水10mL使溶解，再加盐酸1mL，加热回流30～60min，立即冷却，用乙醚分2～3次振摇提取，每次20～30mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1～2mL使溶解，作为大黄薄层供试品溶液；

(2)取大黄对照药材0.1～0.5g，加水100mL，加热煮沸45～60分钟，滤过，滤液浓缩至约10～20mL，再加盐酸1mL，加热回流30～60min，立即冷却，用乙醚分2～3次振摇提取，每次20～30mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1～2mL使溶解，作为大黄薄层对照药材溶液；

(3)取芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄素、大黄酸和大黄酚对照品，加甲醇制成每1mL含芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄素、大黄酸和大黄酚各0.1mg的溶液，作为大黄薄层对照品溶液；

(4)分别吸取大黄薄层供试品溶液、大黄薄层对照药材溶液各3～5μL、大黄薄层对照品溶液5～10μL，点样于同一硅胶G薄层板上，以体积比为8.5:1.5:0.2的石油醚、乙酸乙酯、甲酸的混合溶液为展开剂，展开，取出，晾干，在波长为365nm的紫外光下检视，供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的5个斑点；置氨蒸气中熏蒸后，斑点变为红色；

其中，所述石油醚的沸程为60～90℃。

作为上述技术方案的改进，所述厚朴的薄层色谱鉴别方法为：

(1)取小承气汤制剂，加甲醇提取后得到厚朴薄层供试品溶液；

(2)取厚朴对照药材，加甲醇提取后得到厚朴薄层对照药材溶液；

(3)取和厚朴酚、厚朴酚对照品，加甲醇溶解后得到厚朴薄层对照品溶液；

(4)分别吸取厚朴薄层供试品溶液、厚朴薄层对照药材溶液和厚朴薄层对照品溶液，点于同一硅胶G板上，以环己烷、甲酸乙酯和甲酸的混合溶液为展开剂，展开；供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

作为上述技术方案的改进，所述厚朴的薄层色谱鉴别方法为：

(1)取小承气汤制剂0.2～0.5g，加甲醇20～30mL，超声处理30～60min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1～2mL使溶解，即得厚朴薄层供试品溶液；

(2)取厚朴对照药材1～3g，加水100mL，加热煮沸45～60分钟，滤过，滤液浓缩至约10mL，拌入预设量的硅藻土，蒸干，再加甲醇20～30mL，超声处理30～60min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1～2mL使溶解，即得厚朴薄层对照药材溶液；

(3)取厚朴酚、和厚朴酚对照品，加甲醇制成每1mL含厚朴酚、和厚朴酚各0.1mg的溶液，即得厚朴薄层对照品溶液；

(4)分别吸取厚朴薄层供试品溶液5～10μL、厚朴薄层对照药材溶液3～5μL及厚朴薄层对照品溶液5～10μL，点样于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15:5:1的环己烷、甲酸乙酯和甲酸的混合溶液的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

作为上述技术方案的改进，所述枳实的薄层色谱鉴别方法为：

(1)取小承气汤制剂，加甲醇提取后得到枳实薄层供试品溶液；

(2)取枳实对照药材，加甲醇提取后得到枳实薄层对照药材溶液；

(3)取辛弗林对照品，加甲醇溶解后得到枳实薄层对照品溶液；

(4)分别吸取枳实薄层供试品溶液、枳实薄层对照药材溶液和枳实薄层对照品溶液，点于同一硅胶G板上，以三氯甲烷和甲醇的混合溶液为展开剂，展开；供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

作为上述技术方案的改进，所述枳实的薄层色谱鉴别方法为：

(1)取小承气汤制剂0.2～0.5g，加甲醇20～30mL，超声处理30～60min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1～2mL使溶解，得到枳实薄层供试品溶液；

(2)取枳实对照药材0.5～2g，加水100mL，加热煮沸45～60分钟，滤过，滤液浓缩至约10mL，拌入预设量的硅藻土，蒸干，再加甲醇20～30mL，超声处理30～60min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1～2mL使溶解，得到枳实薄层对照药材溶液；

(3)取辛弗林对照品，加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液，得到枳实薄层对照品溶液；

(4)吸取枳实薄层供试品溶液2～5μL、枳实薄层对照药材溶液2～4μL及枳实薄层对照品溶液5～10μL，点样于同一硅胶G薄层板上，以体积比为10:3的三氯甲烷和甲醇的混合溶液为展开剂，置氨蒸气饱和15～30分钟的展开缸内，展开，取出，晾干，喷以0.5％茚三酮乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视；供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

作为上述技术方案的改进，所述小承气汤指纹图谱的构建方法为：

(1)分别取芦荟大黄素对照品、大黄素对照品、大黄素甲醚对照品、大黄酸对照品、没食子酸对照品、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品、大黄酚对照品、大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品、大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷对照品、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷对照品、儿茶素对照品、川陈皮素对照品、橙皮苷对照品、新橙皮苷对照品、柚皮苷对照品、厚朴酚对照品、和厚朴酚对照品，加入溶剂溶解或提取，制得指纹图谱对照品溶液；

(2)取小承气汤制剂，加提取溶剂提取，制得指纹图谱供试品溶液；

(3)取预设量的指纹图谱对照品溶液和指纹图谱供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，构建小承气汤的指纹图谱。

作为上述技术方案的改进，所述梯度洗脱按下述程序进行：

0～5min，流动相A从3％→21％，流动相B从97％→79％；

5～20min，流动相A从21％→36％，流动相B从79％→64％；

20～32min，流动相A从36％→50％，流动相B从64％→50％；

32～42min，流动相A从50％→62％，流动相B从50％→38％；

42～50min，流动相A从62％→85％，流动相B从38％→15％；

50～60min，流动相A从85％→95％，流动相B从15％→5％。

作为上述技术方案的改进，步骤(3)中，分别吸取指纹图谱对照品溶液和供试品溶液各1～3μL，注入液相色谱仪进行检测，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，所述液相色谱仪以甲醇为流动相A，以0.1～0.2vol％的磷酸水溶液为流动相B；流速为0.18～0.22mL/min；柱温为28～32℃，检测波长为220～290nm。

作为上述技术方案的改进，步骤(3)中，分别吸取指纹图谱对照品溶液和指纹图谱供试品溶液各1μL，注入液相色谱仪进行检测，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm；所述液相色谱仪以甲醇为流动相A，以0.1vol％的磷酸溶液为流动相B；流速为0.2mL/min；柱温为30℃，检测波长为260nm。

作为上述技术方案的改进，步骤(1)中，分别取芦荟大黄素对照品、大黄素对照品、大黄素甲醚对照品、大黄酸对照品、没食子酸对照品、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品、大黄酚对照品、大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品、大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷对照品、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷对照品、儿茶素对照品、川陈皮素对照品、橙皮苷对照品、新橙皮苷对照品、柚皮苷对照品、厚朴酚对照品、和厚朴酚对照品，加入甲醇制成每1mL含芦荟大黄素-8-0-β-D-葡萄糖苷对照品15μg、柚皮苷对照品150μg、新橙皮苷对照品200μg、大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷对照品20μg、大黄酚-8-O-葡萄糖苷对照品30μg、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品20μg、芦荟大黄素对照品10μg、川陈皮素对照品10μg、大黄酸对照品30μg、和厚朴酚对照品15μg、厚朴酚对照品15μg、大黄素对照品10μg、大黄酚对照品15μg、大黄素甲醚对照品5μg的混合溶液，得到指纹图谱对照品溶液。

作为上述技术方案的改进，步骤(2)中，所述提取溶剂为50～100％甲醇，提取时间为15～30min，提取方式为超声提取或回流提取。

作为上述技术方案的改进，步骤(2)包括：

取小承气汤制剂0.2g，置于锥形瓶中，精密加入80％甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再次称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；或取小承气汤煎液2mL，精密加入甲醇8mL，超声处理30分钟，用80％甲醇补足减失的重量，取续滤液，即得指纹图谱供试品溶液。

作为上述技术方案的改进，所述小承气汤的指纹图谱包括18个特征峰；其中，峰1为没食子酸，峰2为儿茶素，峰3为芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷，峰4为柚皮苷，峰5为橙皮苷，峰6为大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷，峰7为新橙皮苷，峰8为大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷，峰9为大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷，峰10为大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷，峰11为芦荟大黄素，峰12为川陈皮素，峰13为大黄酸，峰14为和厚朴酚，峰15为厚朴酚，峰16为大黄素，峰17为大黄酚，峰18为大黄素甲醚。

作为上述技术方案的改进，所述总蒽醌含量的测定方法为：

(1)取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚，加甲醇制成混合溶液，制得总蒽醌对照品溶液；

(2)取小承气汤制剂，加入提取溶剂提取，制得总蒽醌供试品溶液；

(3)吸取总蒽醌对照品溶液、总蒽醌供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，所述液相色谱仪以甲醇为流动相A，磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，测定得到小承气汤中总蒽醌的含量。

作为上述技术方案的改进，所述总蒽醌含量的测定方法按照以下洗脱程序进行：

0～9min，流动相A为62％，流动相B为38％；

9～12min，流动相A从62％→72％，流动相B从38％→28％；

12～21min，流动相A从72％→95％，流动相B从28％→5％；

21～30min，流动相A为95％，流动相B为5％。

作为上述技术方案的改进，所述总蒽醌含量的测定方法中，所述总蒽醌供试品溶液的制备方法为：

取小承气汤制剂0.25～0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25～50mL，密塞，称定重量，采用功率为200～300kW，频率为35～45kHz的超声波处理30～60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取续滤液10mL，置烧瓶中，挥去溶剂，加8％盐酸溶液10mL，超声处理2分钟，再加三氯甲烷10～20mL，加热回流1～2小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10～20mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

作为上述技术方案的改进，所述总蒽醌含量的测定方法中，分别吸取总蒽醌对照品溶液、总蒽醌供试品溶液各5～10μL，注入液相色谱仪进行检测，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱温为28～32℃；所述液相色谱仪以甲醇为流动相A，以0.08～0.12vol％的磷酸水溶液为流动相B，流速为0.25～0.35mL/min，检测波长为250～260nm。

作为上述技术方案的改进，所述总蒽醌的含量测定方法中，分别吸取总蒽醌对照品溶液5μL和总蒽醌供试品溶液5μL，注入液相色谱仪进行检测，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长为150mm，内径为3.0mm，粒径为2.5μm，柱温为30℃；以甲醇为流动相A，以0.1vol％的磷酸溶液为流动相B；流速为0.3mL/min，检测波长为254nm。

作为上述技术方案的改进，所述游离蒽醌、和厚朴酚、厚朴酚含量的测定方法为：

(1)取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚，加甲醇制成混合溶液，制得游离蒽醌对照品溶液；

(2)取和厚朴酚、厚朴酚，加甲醇制成混合溶液，制得厚朴酚对照品溶液；

(3)取小承气汤制剂，利用提取溶剂提取，制得游离蒽醌供试品溶液；

(3)吸取游离蒽醌对照品溶液、厚朴酚对照品溶液和游离蒽醌供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，测定得到小承气汤中游离蒽醌、和厚朴酚、厚朴酚含量。

作为上述技术方案的改进，所述游离蒽醌、和厚朴酚、厚朴酚含量的测定方法按照以下洗脱程序进行：

0～9min，流动相A为62％，流动相B为38％；

9～12min，流动相A从62％→72％，流动相B从38％→28％；

12～21min，流动相A从72％→95％，流动相B从28％→5％；

21～30min，流动相A为95％，流动相B为5％。

作为上述技术方案的改进，所述游离蒽醌供试品溶液的制备方法为：

取小承气汤制剂0.2～0.5g，置于锥形瓶中，精密加入70～80％甲醇10～20mL，密塞，称定重量，采用功率为200～300kW、频率为35～45kHz的超声波处理20～30分钟，放冷，再次称定重量，用70～80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

作为上述技术方案的改进，所述游离蒽醌、和厚朴酚、厚朴酚含量的测定方法中，分别吸取游离蒽醌对照品溶液、厚朴酚对照品溶液和游离蒽醌供试品溶液各5～10μL，注入液相色谱仪进行检测，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱温为28～32℃；所述液相色谱仪以甲醇为流动相A，以0.08～0.12vol％的磷酸水溶液为流动相B，流速为0.25～0.35mL/min，检测波长为250～300nm。

作为上述技术方案的改进，所述游离蒽醌、和厚朴酚、厚朴酚含量的测定方法中，分别吸取游离蒽醌对照品溶液、厚朴酚对照品溶液和游离蒽醌供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪进行检测，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长为150mm，内径为3mm，粒径为2.5μm，其柱温为30℃；所述液相色谱仪以甲醇为流动相A，以0.1vol％的磷酸水溶液为流动相B，流速为0.3mL/min，检测波长为254nm和294nm。

作为上述技术方案的改进，所述柚皮苷和新橙皮苷含量的测定方法为：

(1)取柚皮苷、新橙皮苷，加甲醇制成混合溶液，即得柚皮苷对照品溶液；

(2)取小承气汤制剂，加入提取溶剂提取，制得柚皮苷供试品溶液；

(3)吸取柚皮苷对照品溶液、柚皮苷供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，所述液相色谱仪以乙腈为流动相A，磷酸水溶液为流动相B进行洗脱，测定得到小承气汤中柚皮苷和新橙皮苷的含量。

作为上述技术方案的改进，所述柚皮苷供试品溶液的制备方法为：

取小承气汤制剂0.1～0.3g，置于锥形瓶中，精密加入甲醇50～100mL，密塞，称定重量，以功率为200～300kW、频率为35～45kHz的超声波处理20～60分钟，放冷，再次称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

作为上述技术方案的改进，所述柚皮苷和新橙皮苷含量的测定方法中，分别吸取柚皮苷对照品溶液和柚皮苷供试品溶液各5～10μL，注入液相色谱仪进行检测，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱温为27～33℃；所述液相色谱仪以乙腈为流动相A，以0.08～0.12vol％的磷酸溶液为流动相B；流速为0.8～1.2mL/min；检测波长为254～290nm。

作为上述技术方案的改进，所述柚皮苷和新橙皮苷含量的测定方法中，分别吸取柚皮苷对照品溶液和柚皮苷供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪进行检测，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5.0μm，柱温为30℃；所述液相色谱仪以乙腈为流动相A，以0.1vol％的磷酸溶液为流动相B，且洗脱过程中流动相A与流动相B的体积比为20:40；流速为1.0mL/min；检测波长为283nm。

作为上述技术方案的改进，所述辛弗林含量的测定方法为：

(1)取辛弗林，加甲醇制成混合溶液，即得辛弗林对照品溶液；

(2)取小承气汤制剂，加入提取溶剂提取，制得辛弗林供试品溶液；

(3)吸取辛弗林对照品溶液、辛弗林供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，所述液相色谱仪以甲醇为流动相A，磷酸和十二烷基磺酸钠混合水溶液为流动相B进行洗脱，测定得到小承气汤中辛弗林的含量。

作为上述技术方案的改进，所述辛弗林供试品溶液的制备方法为：

取小承气汤制剂0.2～0.5g，置于锥形瓶中，精密加入50～80％甲醇10～20mL，密塞，称定重量，以功率为200～300kW、频率为35～45kHz的超声波处理30～60分钟，放冷，再次称定重量，用50～80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

作为上述技术方案的改进，磷酸和十二烷基磺酸钠混合水溶液中，磷酸的浓度为0.05～0.15vol％，十二烷基磺酸钠的浓度为0.05～0.15vol％。

作为上述技术方案的改进，所述辛弗林含量的测定方法中，分别吸取辛弗林对照品溶液和辛弗林供试品溶液各5～10μL，注入液相色谱仪进行检测，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱温为28～32℃；所述液相色谱仪以甲醇为流动相A，以磷酸和十二烷基磺酸钠混合水溶液为流动相B；流速为0.9～1.1mL/min；检测波长为220～254nm。

作为上述技术方案的改进，所述辛弗林含量的测定方法中，分别吸取辛弗林对照品溶液和辛弗林供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪进行检测，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长为150mm，内径为4.6mm，粒径为5.0μm，柱温为30℃；所述液相色谱仪以甲醇为流动相A，以磷酸和十二烷基磺酸钠混合水溶液为流动相B；流速为1.0mL/min；检测波长为224nm；

其中，所述磷酸和十二烷基磺酸钠混合水溶液中，磷酸的浓度为0.1vol％，十二烷基磺酸钠的浓度为0.1vol％；洗脱过程中，流动相A与流动相B的体积比为45:55。

作为上述技术方案的改进，还包括：

(4)将小承气汤蒸干，测定其出膏率；

(5)测定小承气汤的浸出物。

作为上述技术方案的改进，所述小承气汤由以下重量份的组分组成：生大黄55.2份，姜厚朴27.6份，麸炒枳实36份。

作为上述技术方案的改进，所述小承气汤的制备方法为：取大黄、厚朴和枳实，加500～1200mL水浸泡，武火煮沸，文火沸腾至药液为200～300mL，滤过即得。

作为上述技术方案的改进，所述小承气汤的制备方法为：取生大黄55.2g、姜厚朴27.6g和麸炒枳实27.6g，加800mL水浸泡，武火煮沸，文火沸腾至药液为240mL，滤过即得。

实施本发明，具有如下有益效果：

(1)本发明在遵循古籍原方的基础上，用现代化质量控制手段，建立了与传统汤剂“等效性”的质量评价方法，为开发与传统汤剂质量相一致的小承气汤制剂提供了质量评价方法。首先通过古籍考证，确定原方的药味、炮制规格、处方量、组成比例以及制法；采集全国主产区各15批以上的原料，随机组方，制备代表性小承气汤标准汤剂样品；研究并建立了包括出膏率、浸出物、定性鉴别、全成分指纹图谱、多指标成分(总蒽醌、游离蒽醌、和厚朴酚与厚朴酚、柚皮苷与新橙皮苷、辛弗林)含量测定的小承气汤物质基准，作为小承气汤制剂的质量控制方法。

(2)本发明鉴别小承气汤样品中大黄采用的展开剂为石油醚Ⅱ(60～90℃)、乙酸乙酯和甲酸，对于展开的要求较低，重复试验多次均可得到满意的分离效果，5个斑点分离度佳，具有较好的耐用性和重复性。而《中国药典》中对大黄及含大黄的复方制剂大部分采用的展开剂均为石油醚Ⅰ(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸，因其沸点较低，极易挥发，对展开环境的温度要求较高；且甲酸乙酯作为展开剂，因易吸收了空气中的水分而使大黄发生水解，对斑点分离度产生影响。厚朴和枳实采用同一个供试品，且仅需采用适量的甲醇超声，提取方法简单便捷且节省样品。小承气汤样品中厚朴的鉴别方法可鉴别厚朴酚、和厚朴酚两个成分，与文献研究对比，增加了厚朴酚的鉴别。小承气汤样品中枳实的鉴别方法采用的展开剂为三氯甲烷、甲醇，相对比《中国药典》中采用的正丁醇、冰醋酸、水，具有展开时间较短，样品背景清晰且斑点无拖尾现象。本发明仅采用两个供试品溶液，三块薄层板完成对方中全药味和8个化学成分的鉴别，所用的样品量少，方法简便快捷，能实现对小承气汤全方的质量控制。

(3)本发明对小承气汤建立了UPLC-UV指纹图谱。采用UPLC-MS进行相关物质基础研究的确认，标定了共18个特征峰，可充分展示小承气汤的化学成分的特征，特征峰信息量丰富，该方法方法稳定，准确可靠，实现对小承气汤中多个药味的特征成分的质量监控。

(4)本发明构建了小承气汤高效液相含量测定的方法，包括总蒽醌、游离蒽醌、和厚朴酚与厚朴酚、柚皮苷与新橙皮苷、辛弗林，并计算结合蒽醌含量的多指标含量测定方法。该方法方法稳定，准确可靠，可实现对小承气汤中多个药味的特征成分的质量监控。

附图说明

图1是本发明中大黄的专属性薄层色谱图(365nm紫外光)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄薄层对照药材，5为大黄薄层对照品，6为大黄薄层阴性样品；

图2是本发明中大黄的专属性薄层色谱图(日光)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄薄层对照药材，5为大黄薄层对照品，6为大黄薄层阴性样品；

图3是不同点样量下大黄的薄层色谱图(365nm紫外光)，其中，1～3为大黄薄层供试品，点样量分别为1μL、5μL、10μL，4～6为大黄薄层对照药材，点样量分别为1μL、5μL、10μL，7～9为大黄薄层对照品，点样量分别为1μL、5μL、10μL；

图4是不同点样量下大黄的薄层色谱图(日光)，其中，1～3为大黄薄层供试品，点样量分别为1μL、5μL、10μL，4～6为大黄薄层对照药材，点样量分别为1μL、5μL、10μL，7～9为大黄薄层对照品，点样量分别为1μL、5μL、10μL；

图5是27.1℃下大黄的薄层色谱图(365nm紫外光)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄薄层对照药材，5为大黄薄层对照品；

图6是27.1℃下大黄的薄层色谱图(日光)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄薄层对照药材，5为大黄薄层对照品；

图7是6.8℃下大黄的薄层色谱图(365nm紫外光)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄薄层对照药材，5为大黄薄层对照品；

图8是6.8℃下大黄的薄层色谱图(日光)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄薄层对照药材，5为大黄薄层对照品；

图9是相对湿度为72％时大黄的薄层色谱图(365nm紫外光)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄薄层对照药材，5为大黄薄层对照品；

图10是相对湿度为72％时大黄的薄层色谱图(日光)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄薄层对照药材，5为大黄薄层对照品；

图11是相对湿度为32％时大黄的薄层色谱图(365nm紫外光)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄薄层对照药材，5为大黄薄层对照品；

图12是相对湿度为32％时大黄的薄层色谱图(日光)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄薄层对照药材，5为大黄薄层对照品；

图13是采用海洋硅胶G板时大黄的薄层色谱图(365nm紫外光)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄薄层对照药材，5为大黄薄层对照品；

图14是采用海洋硅胶G板时大黄的薄层色谱图(日光)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄薄层对照药材，5为大黄薄层对照品；

图15是采用谱科硅胶G板时大黄的薄层色谱图(365nm紫外光)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄薄层对照药材，5为大黄薄层对照品；

图16是采用谱科硅胶G板时大黄的薄层色谱图(日光)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄薄层对照药材，5为大黄薄层对照品；

图17是采用默克硅胶G板时大黄的薄层色谱图(365nm紫外光)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄薄层对照药材，5为大黄薄层对照品；

图18是采用默克硅胶G板时大黄的薄层色谱图(日光)，其中，1～3为大黄薄层供试品，4为大黄薄层对照药材，5为大黄薄层对照品；

图19是本发明中厚朴的专属性薄层色谱图，其中，1～3为厚朴薄层供试品，4为厚朴对照药材，5为厚朴薄层对照品，6为厚朴薄层阴性样品；

图20是不同点样量下厚朴的薄层色谱图，其中，1～4为厚朴薄层供试品，点样量分别为1μL、5μL、10μL、15μL，5～8为厚朴薄层对照药材，点样量分别为1μL、5μL、10μL、15μL，9～12为厚朴薄层对照品，点样量分别为1μL、5μL、10μL、15μL；

图21是26℃下厚朴的薄层色谱图，其中，1～3为厚朴薄层供试品，4为厚朴薄层对照药材，5为厚朴薄层对照品；

图22是6.8℃下厚朴的薄层色谱图，其中，1～3为厚朴薄层供试品，4为厚朴薄层对照药材，5为厚朴薄层对照品；

图23是相对湿度为75％时厚朴的薄层色谱图，其中，1～3为厚朴薄层供试品，4为厚朴薄层对照药材，5为厚朴薄层对照品；

图24是相对湿度为33％时厚朴的薄层色谱图，其中，1～3为厚朴薄层供试品，4为厚朴薄层对照药材，5为厚朴薄层对照品；

图25是采用海洋硅胶G板时厚朴的薄层色谱图，其中，1～3为厚朴薄层供试品，4为厚朴薄层对照药材，5为厚朴薄层对照品；

图26是采用谱科硅胶G板时厚朴的薄层色谱图，其中，1～3为厚朴薄层供试品，4为厚朴薄层对照药材，5为厚朴薄层对照品；

图27是采用默克硅胶G板时厚朴的薄层色谱图，其中，1～3为厚朴薄层供试品，4为厚朴薄层对照药材，5为厚朴薄层对照品；

图28是本发明中枳实的专属性薄层色谱图，其中，1～3为枳实薄层供试品，4为枳实对照药材，5为枳实薄层对照品，6为枳实薄层阴性样品；

图29是不同点样量下枳实的薄层色谱图，其中，1～4为枳实薄层供试品，点样量分别为1μL、2μL、5μL、10μL，5～8为枳实薄层对照药材，点样量分别为1μL、2μL、5μL、10μL，9～12为枳实薄层对照品，点样量分别为1μL、2μL、5μL、10μL；

图30是26℃下枳实的薄层色谱图，其中，1～3为枳实薄层供试品，4为枳实薄层对照药材，5为枳实薄层对照品；

图31是6.4℃下枳实的薄层色谱图，其中，1～3为枳实薄层供试品，4为枳实薄层对照药材，5为枳实薄层对照品；

图32是相对湿度为73％时枳实的薄层色谱图，其中，1～3为枳实薄层供试品，4为枳实薄层对照药材，5为枳实薄层对照品；

图33是相对湿度为34％时枳实的薄层色谱图，其中，1～3为枳实薄层供试品，4为枳实薄层对照药材，5为枳实薄层对照品；

图34是采用海洋硅胶G板时枳实的薄层色谱图，其中，1～3为枳实薄层供试品，4为枳实薄层对照药材，5为枳实薄层对照品；

图35是采用谱科硅胶G板时枳实的薄层色谱图，其中，1～3为枳实薄层供试品，4为枳实薄层对照药材，5为枳实薄层对照品；

图36是采用银龙硅胶G板时枳实的薄层色谱图，其中，1～3为枳实薄层供试品，4为枳实薄层对照药材，5为枳实薄层对照品；

图37是本发明小承气汤采用不同色谱柱测定时的指纹图谱；

图38是本发明小承气汤采用不同波长测定时的指纹图谱；

图39是本发明小承气汤采用不同流动相测定时的指纹图谱；

图40是本发明小承气汤采用不同浓度磷酸的流动相测定时的指纹图谱；

图41是本发明小承气汤采用洗脱梯度1测定时的指纹图谱；

图42是本发明小承气汤采用洗脱梯度2测定时的指纹图谱；

图43是本发明小承气汤采用洗脱梯度3测定时的指纹图谱；

图44是本发明小承气汤采用洗脱梯度4测定时的指纹图谱；

图45是本发明小承气汤采用不同流速测定时的指纹图谱；

图46是本发明小承气汤采用不同柱温测定时的指纹图谱；

图47是本发明小承气汤指纹图谱专属性考察中小承气汤、大黄对照药材、缺大黄阴性样品的指纹图谱；其中，峰1为没食子酸，峰2为儿茶素，峰3为芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷，峰4为柚皮苷，峰5为橙皮苷，峰6为大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷，峰7为新橙皮苷，峰8为大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷，峰9为大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷，峰10为大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷，峰11为芦荟大黄素，峰12为川陈皮素，峰13为大黄酸，峰14为和厚朴酚，峰15为厚朴酚，峰16为大黄素，峰17为大黄酚，峰18为大黄素甲醚；

图48是本发明小承气汤指纹图谱专属性考察中小承气汤、厚朴对照药材、缺厚朴阴性样品的指纹图谱；其中，峰1为没食子酸，峰2为儿茶素，峰3为芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷，峰4为柚皮苷，峰5为橙皮苷，峰6为大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷，峰7为新橙皮苷，峰8为大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷，峰9为大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷，峰10为大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷，峰11为芦荟大黄素，峰12为川陈皮素，峰13为大黄酸，峰14为和厚朴酚，峰15为厚朴酚，峰16为大黄素，峰17为大黄酚，峰18为大黄素甲醚；

图49是本发明小承气汤指纹图谱专属性考察中小承气汤、枳实对照药材、缺枳实阴性样品的指纹图谱；其中，峰1为没食子酸，峰2为儿茶素，峰3为芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷，峰4为柚皮苷，峰5为橙皮苷，峰6为大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷，峰7为新橙皮苷，峰8为大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷，峰9为大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷，峰10为大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷，峰11为芦荟大黄素，峰12为川陈皮素，峰13为大黄酸，峰14为和厚朴酚，峰15为厚朴酚，峰16为大黄素，峰17为大黄酚，峰18为大黄素甲醚；

图50是本发明小承气汤对照指纹图谱；其中，峰1为没食子酸，峰2为儿茶素，峰3为芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷，峰4为柚皮苷，峰5为橙皮苷，峰6为大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷，峰7为新橙皮苷，峰8为大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷，峰9为大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷，峰10为大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷，峰11为芦荟大黄素，峰12为川陈皮素，峰13为大黄酸，峰14为和厚朴酚，峰15为厚朴酚，峰16为大黄素，峰17为大黄酚，峰18为大黄素甲醚；

图51是15批次小承气汤样品的指纹图谱叠加图；其中，峰1为没食子酸，峰2为儿茶素，峰3为芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷，峰4为柚皮苷，峰5为橙皮苷，峰6为大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷，峰7为新橙皮苷，峰8为大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷，峰9为大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷，峰10为大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷，峰11为芦荟大黄素，峰12为川陈皮素，峰13为大黄酸，峰14为和厚朴酚，峰15为厚朴酚，峰16为大黄素，峰17为大黄酚，峰18为大黄素甲醚；

图52是总蒽醌对照品的HPLC图，其中，峰1为芦荟大黄素，峰2为大黄酸，峰3为大黄素，峰4为大黄酚，峰5为大黄素甲醚；

图53是总蒽醌大黄阴性样品的HPLC图；

图54是总蒽醌供试品的HPLC图，其中，峰1为芦荟大黄素，峰2为大黄酸，峰3为大黄素，峰4为大黄酚，峰5为大黄素甲醚；

图55是厚朴酚对照品的HPLC图，其中，峰1为和厚朴酚，峰2为厚朴酚；

图56是游离蒽醌大黄阴性样品的HPLC图；

图57是游离蒽醌厚朴阴性样品的HPLC图；

图58是游离蒽醌供试品的HPLC图；

图59是柚皮苷对照品的HPLC图，其中，峰1为柚皮苷，峰2为新橙皮苷；

图60是柚皮苷枳实阴性样品的HPLC图；

图61是柚皮苷供试品的HPLC图，其中，峰1为柚皮苷，峰2为新橙皮苷；

图62是辛弗林对照品的HPLC图；其中，峰1为辛弗林；

图63是辛弗林枳实阴性样品的HPLC图；

图64是辛弗林供试品的HPLC图；其中，峰1为辛弗林。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施方式对本发明作进一步地详细描述。

本发明的小承气汤出自伤寒论，现有记载中一般认为其由大黄(酒洗)、厚朴(去皮，炙)、枳实(炙)组成。基于古籍文献进行多方面循古考证，所确定的小承气汤方剂如下：生大黄55.2g，姜厚朴27.6g，麸炒枳实36.0g。其中，各药材经鉴定符合2020年版《中国药典》一部相关项下规定。需要说明的是，张仲景对《伤寒论》中药物下方标注的炙，与现代药典中的清炒法最为接近，古代不加辅料炒制分为炒黄和炒炭两种方法，结合2020年版《中国药典》并参照了其他地方的炮制规范，确定了枳实是麸炒枳实、厚朴是姜厚朴。药物大黄结合临床药效及应用，采用生大黄。

进一步的，基于古籍文献考证确定小承气汤传统汤剂的制法为：取生大黄55.2g，姜厚朴27.6g，麸炒枳实36.0g，加水800mL，浸泡，武火(500W)煮沸，文火(300W)保持沸腾至药液约240mL，筛网(350目)滤过，得小承气汤汤剂；

本发明中所采用的小承气汤样品均为小承气汤冻干粉，具体的，汤剂减压低温浓缩至约120mL的浸膏，搅匀分装棕色西林瓶中，转移至真空循环泵真空冷冻干燥机中冷冻干燥，取出，得冻干粉，即得小承气汤冻干粉。此外，为了全面地反映小承气汤的质量信息，发明人针对各药材收集了不少于3产地15个批次，并制备样品进行研究。

进一步的，在制备过程中，对出膏率进行了研究，其具体包括：取小承气汤标准汤剂25mL，精密称定，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30分钟，迅速精密称定重量，根据所用药材的重量计算出膏率。出膏率平均值为14.1％，范围应在11.7％～17.3％。

此外，还对小承气汤的浸出物进行了研究。具体的，取小承气汤样品约2g，精密称定，精密加入无水乙醇100mL，密塞，称定重量，静置1小时后，加热回流至沸腾，并保持微沸1小时后。取下锥形瓶，密塞，放冷，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取滤液25mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30分钟，迅速精密称定重量。除另有规定外，以干燥品计算供试品中浸出物的含量(％)；浸出物平均值为56.7％，范围应在46.3％～63.4％。

为了全面地反映小承气汤的质量信息，实现全面、有效地控制小承气汤产品质量，本发明提供了一种小承气汤物质基准的建立方法，以下对其进行详细说明：

一、仪器与试药

本发明所用到的仪器、试剂、试药以及组方所采用药物的信息如表1～表7所示：

表1仪器信息汇总表

表2试剂信息汇总表

表3对照品信息

表4大黄药材信息表

表5厚朴药材信息表

表6枳实药材信息表

表7小承气汤组方表

二、小承气汤中大黄的薄层色谱鉴别方法

2.1鉴别方法

(1)供试品溶液制备：取小承气汤冻干粉0.2g，加甲醇20mL，超声处理30min，滤过，取滤液5mL，蒸干，残渣加水10mL使溶解，再加盐酸1mL，加热回流30min，立即冷却，用乙醚分2次振摇提取，每次20mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1mL使溶解，作为大黄薄层供试品溶液。

(2)对照药材溶液制备：取大黄对照药材0.1g，加水100mL，加热煮沸45分钟，滤过，滤液浓缩至约10mL，再加盐酸1mL，加热回流30min，立即冷却，用乙醚分2次振摇提取，每次20mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1mL使溶解，作为大黄薄层对照药材溶液；

(3)对照品溶液制备：取芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄素、大黄酸和大黄酚对照品，加甲醇制成每1mL含芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄素、大黄酸和大黄酚各0.1mg的溶液，作为大黄薄层对照品溶液。

(4)分别吸取大黄薄层供试品溶液5μL、大黄薄层对照药材溶液5μL及大黄薄层对照品溶液10μL点样于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲酸(8.5:1.5:0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，应呈现5个橙红色的主斑点。置氨蒸气中熏蒸后，斑点变为红色。

2.2方法学验证

2.2.1专属性

取大黄阴性样品按照供试品溶液制备方法制备大黄薄层阴性样品溶液，分别吸取大黄薄层供试品(批号：S8、S13、S14)溶液5μL、大黄薄层对照药材溶液5μL、大黄薄层对照品溶液10μL及大黄薄层阴性样品溶液5μL点样于同一硅胶G薄层板(谱科硅胶G板)上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲酸(8.5:1.5:0.2)为展开剂，展开(27.1℃、57％)，取出，晾干，在紫外光(365nm)下检视。实验结果见图1。置氨蒸气中熏蒸后，斑点变为红色，实验结果见图2。

由图1和图2可见，供试品色谱与对照药材色谱、对照品色谱的相应位置上显相同颜色的斑点，且阴性样品无干扰。说明该薄层方法专属性良好。

2.2.2耐用性

(1)不同点样量考察

分别吸取大黄薄层供试品(批号：S8)溶液、大黄薄层对照药材溶液及大黄薄层对照品溶液点样于同一硅胶G薄层板(谱科硅胶G板)上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲酸(8.5:1.5:0.2)为展开剂，展开(27.1℃、57％)，取出，晾干，在紫外光(365nm)下检视。实验结果见图3。置氨蒸气中熏蒸后，斑点变为红色，实验结果见图4。

由图3和图4可见，当大黄薄层供试品溶液、大黄薄层对照药材溶液点样量为5μL、大黄薄层对照品溶液点样量为10μL时，供试品色谱、对照药材与对照品色谱的斑点显色清晰，分离度较好，无拖尾现象，背景无干扰，供试品色谱与对照药材色谱、对照品色谱的斑点能够一一对应，因此选择大黄薄层供试品溶液和大黄薄层对照药材溶液点样量为5μL、大黄薄层对照品溶液点样量为10μL。

(2)不同温度考察

分别吸取大黄薄层供试品(批号：S8、S13、S14)溶液5μL、大黄薄层对照药材溶液5μL及大黄薄层对照品溶液10μL点样于同一硅胶G薄层板(谱科硅胶G板)上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲酸(8.5:1.5:0.2)为展开剂，分别在常温(27.1℃，57％)和低温(6.8℃，66％)条件下展开，取出，晾干，在紫外光(365nm)下检视。实验结果见图5、图7。置氨蒸气中熏蒸后，斑点变为红色，实验结果见图6、图8。

由图5-8可见，常温和低温条件下，供试品色谱与对照药材色谱、对照品色谱的斑点均显色清晰，分离度较好，无拖尾现象，背景无干扰，供试品色谱、对照药材色谱与对照品色谱的斑点能够一一对应，表明温度的降低对小承气汤中大黄的薄层鉴别无明显影响，说明该薄层鉴别方法对常温和低温的条件耐用性良好。

(3)不同湿度考察

分别吸取大黄薄层供试品(批号：S8、S13、S14)溶液、大黄薄层对照药材溶液及大黄薄层对照品溶液点样于同一硅胶G薄层板(谱科硅胶G板)上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲酸(8.5:1.5:0.2)为展开剂，分别在高湿(27.96℃，RH：72％)和低湿(27.7℃，RH：32％)条件下展开，取出，晾干，在紫外光(365nm)下检视。实验结果见图9、图11。置氨蒸气中熏蒸后，斑点变为红色，实验结果见图10、图12。

由图9-12可见，高湿和低湿条件下，供试品色谱与对照药材色谱、对照品色谱的斑点均显色清晰，分离度较好，无拖尾现象，背景无干扰，供试品色谱、对照药材色谱与对照品色谱的斑点能够一一对应。实验结果表明，湿度对小承气汤中大黄的薄层鉴别无影响，说明该薄层鉴别方法对不同湿度耐用性好。

(5)不同厂家薄层板考察

分别吸取大黄薄层供试品(批号：S8、S13、S14)溶液5μL、大黄薄层对照药材溶液5μL及大黄薄层对照品溶液10μL点样于不同厂家硅胶G薄层板(海洋硅胶G板、谱科硅胶G板、默克硅胶G板)上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲酸(8.5:1.5:0.2)为展开剂，分别在同一温湿度(27.1℃，57％)条件下展开，取出，晾干，在紫外光(365nm)下检视。实验结果见图13、图15、图17；置氨蒸气中熏蒸后，斑点变为红色，实验结果见图14、图16、图18。

由图13-18可见，采用不同厂家的硅胶G薄层板(海洋硅胶G板、谱科硅胶G板、默克硅胶G板)对小承气汤冻干粉中各成分的保留行为无差异。供试品色谱与对照药材色谱、对照品色谱的斑点均显色清晰，分离度较好，且供试品色谱、对照药材色谱与对照品色谱的斑点能够一一对应，说明该薄层鉴别方法对不同厂家薄层板的耐用性良好。

三、小承气汤中厚朴的薄层色谱鉴别方法

3.1鉴别方法

(1)供试品溶液制备：取小承气汤冻干粉0.2g，加甲醇20mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为厚朴薄层供试品溶液。

(2)对照药材溶液制备：取厚朴对照药材1g，加水100mL，加热煮沸45分钟，滤过，滤液浓缩至约10mL，拌入适量硅藻土，蒸干，加甲醇20mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为厚朴薄层对照药材溶液。

(3)对照品溶液制备：取厚朴酚、和厚朴酚对照品，加甲醇制成每1mL含厚朴酚、和厚朴酚各0.1mg的溶液，作为厚朴薄层对照品溶液。

(4)分别吸取厚朴薄层供试品溶液10μL、厚朴薄层对照药材溶液5μL、厚朴薄层对照品溶液10μL点样于同一硅胶G薄层板(105℃活化30分钟后使用)上，以环己烷-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，应相同颜色的斑点。

3.2方法学验证

3.2.1专属性

取厚朴阴性样品按照供试品溶液制备方法制备厚朴薄层阴性样品溶液，分别吸取厚朴薄层供试品(批号：S8、S13、S14)溶液10μL、厚朴薄层对照药材溶液5μL、厚朴薄层对照品溶液10μL及厚朴薄层阴性样品溶液10μL点样于同一硅胶G薄层板(谱科硅胶G板)上，以环己烷-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)上层溶液为展开剂，展开(26℃、62％)，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。实验结果见图19。

由图19可见，供试品色谱中，在与对照药材色谱、混合对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性样品无干扰。说明该薄层方法专属性良好。

3.2.2耐用性

(1)不同点样量

分别吸取厚朴薄层供试品(批号：S8)溶液、厚朴薄层对照药材溶液及厚朴薄层对照品溶液点样于同一硅胶G薄层板(谱科硅胶G板)上，以环己烷-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)上层溶液为展开剂，展开(27℃、60％)，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。实验结果见图20。

由图20可见，当厚朴薄层供试品溶液点样量为10μL、厚朴薄层对照药材溶液点样量为5μL及厚朴薄层对照品溶液点样量为10μL时，供试品色谱与对照药材色谱、对照品色谱的斑点显色清晰，分离度较好，无拖尾现象，背景无干扰，供试品色谱与对照药材色谱、对照品色谱的斑点能够一一对应，因此选择厚朴薄层供试品溶液点样量为10μL、厚朴薄层对照药材溶液点样量为5μL、厚朴薄层对照品溶液点样量为10μL。

(2)不同温度

分别吸取厚朴薄层供试品(批号：S8、S13、S14)溶液10μL、厚朴薄层对照药材溶液5μL及厚朴薄层对照品溶液10μL点样于同一硅胶G薄层板(谱科硅胶G板)上，以环己烷-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)上层溶液为展开剂，在常温(26℃，62％)及低温(6.8℃，61％)条件下展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。实验结果见图21、图22。

由图21和图22可见，常温和低温条件下，供试品色谱与对照药材色谱、对照品色谱的斑点均显色清晰，分离度较好，无拖尾现象，背景无干扰，供试品色谱与对照药材色谱、对照品色谱的斑点能够一一对应，表明温度的降低对小承气汤中厚朴的薄层鉴别无明显影响，说明该薄层鉴别方法对常温和低温的条件耐用性良好。

(3)不同湿度

分别吸取厚朴薄层供试品(批号：S8、S13、S14)溶液10μL、厚朴薄层对照药材溶液5μL及厚朴薄层对照品溶液10μL点样于同一硅胶G薄层板(谱科硅胶G板)上，以环己烷-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)上层溶液为展开剂，在高湿(25.6℃，74％)及低湿(25.6℃，33％)条件下展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。实验结果见图23、图24。

由图23和图24可见，高湿和低湿条件下，供试品色谱与对照药材色谱、对照品色谱的斑点均显色清晰，分离度较好，无拖尾现象，背景无干扰，供试品色谱与对照药材色谱、对照品色谱的斑点能够一一对应。实验结果表明，湿度对小承气汤中厚朴的薄层鉴别无影响，说明该薄层鉴别方法对不同湿度耐用性好。

(4)不同厂家薄层板

分别吸取厚朴薄层供试品(批号：S8、S13、S14)溶液10μL、厚朴薄层对照药材溶液5μL及厚朴薄层对照品溶液10μL点样于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)上层溶液为展开剂，在特定条件(26℃、62％)下展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。实验结果见图25～图27。

由图25～图27可见，采用不同厂家的硅胶G薄层板(海洋硅胶G板、谱科硅胶G板、默克硅胶G板)对小承气汤中各成分的保留行为无差异，且供试品色谱与对照药材色谱、对照品色谱的斑点均显色清晰，分离度较好，供试品色谱与对照药材色谱、对照品色谱的斑点能够一一对应，说明该薄层鉴别方法对不同厂家的耐用性良好。

四、小承气汤中枳实的薄层色谱鉴别方法

4.1鉴别方法

(1)供试品溶液制备：取小承气汤冻干粉0.2g，加甲醇20mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为枳实薄层供试品溶液。

(2)对照药材溶液制备：取枳实(酸橙)对照药材0.5g，加甲醇20mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为枳实薄层对照药材溶液。

(3)对照品溶液制备：取辛弗林对照品，加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液，作为枳实薄层对照品溶液。

(4)分别吸取枳实薄层供试品溶液5μL、枳实薄层对照药材溶液2μL及枳实薄层对照品溶液10μL点样于同一硅胶G薄层板(105℃活化30分钟后干燥备用)上，以三氯甲烷-甲醇(10:3)为展开剂，置氨蒸气饱和15分钟的展开缸内，展开，取出，晾干，喷以0.5％茚三酮乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视，供试品色谱与对照药材色谱、对照品色谱的相应位置上显相同颜色的斑点。

4.2方法学验证

4.2.1专属性

取枳实阴性样品按照上述供试品溶液制备方法制备枳实薄层阴性样品溶液；分别吸取枳实薄层供试品溶液5μL、枳实薄层对照药材溶液2μL、枳实薄层对照品溶液10μL及枳实阴性样品溶液5μL点样于同一硅胶G薄层板(谱科硅胶G板)上，以三氯甲烷-甲醇(10:3)为展开剂，置氨蒸气饱和15分钟的展开缸内，展开(26℃、61％)，取出，晾干，喷以0.5％茚三酮乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。实验结果见图28。

由图28可见，供试品色谱与对照药材色谱、对照品色谱的相应位置上显相同颜色的斑点，且阴性样品无干扰。说明该薄层方法专属性良好。

4.2.2耐用性

(1)不同点样量

分别吸取枳实薄层供试品(批号：S8)溶液、枳实薄层对照药材溶液及枳实薄层对照品溶液点样于同一硅胶G薄层板(谱科硅胶G板)上，以三氯甲烷-甲醇(10:3)为展开剂，置氨蒸气饱和15分钟的展开缸内，展开(26℃、61％)，取出，晾干，喷以0.5％茚三酮乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。实验结果见图29。

由图29可见，当枳实薄层供试品溶液点样量为5μL、枳实薄层对照药材溶液点样量为2μL、枳实薄层对照品溶液点样量为10μL时，供试品色谱与对照药材色谱、对照品色谱的斑点显色清晰，分离度较好，无拖尾现象，背景无干扰，供试品色谱与对照药材色谱、对照品色谱的斑点能够一一对应，因此选择枳实薄层供试品溶液点样量为5μL、枳实薄层对照药材溶液点样量为2μL、枳实薄层对照品溶液点样量为10μL。

(2)不同温度

分别吸取枳实薄层供试品(批号：S8、S13、S14)溶液5μL、枳实薄层对照药材溶液2μL及枳实薄层对照品溶液10μL点样于同一硅胶G薄层板(谱科硅胶G板)上，以三氯甲烷-甲醇(10:3)为展开剂，置氨蒸气饱和15分钟的展开缸内，分别在常温(26℃、61％)和低温(6.4℃、54％)条件下展开，取出，晾干，喷以0.5％茚三酮乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。实验结果见图30、图31。

由图30和图31可见，常温和低温条件下，供试品色谱与对照药材色谱、对照品色谱的斑点均显色清晰，分离度较好，无拖尾现象，背景无干扰，供试品色谱与对照药材色谱、对照品色谱的斑点能够一一对应，表明温度的降低对小承气汤中枳实的薄层鉴别无明显影响，说明该薄层鉴别方法对常温和低温的条件耐用性良好。

(3)不同湿度

分别吸取枳实薄层供试品(批号：S8、S13、S14)溶液5μL、枳实薄层对照药材溶液2μL及枳实薄层对照品溶液10μL点样于同一硅胶G薄层板(谱科硅胶G板)上，以三氯甲烷-甲醇(10:3)为展开剂，置氨蒸气饱和15分钟的展开缸内，分别在高湿(25.4℃、73％)和低湿(25.2℃、34％)条件下展开，取出，晾干，喷以0.5％茚三酮乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。实验结果见图32、图33。

由图32和图33可见，高湿和低湿条件下，供试品色谱与对照药材色谱、对照品色谱的斑点均显色清晰，分离度较好，无拖尾现象，背景无干扰，供试品色谱与对照药材色谱、对照品色谱的斑点能够一一对应，表明湿度的降低对小承气汤中枳实的薄层鉴别无明显影响，说明该薄层鉴别方法对高湿和低湿的条件耐用性良好。

(4)不同薄层板

分别吸取枳实薄层供试品(批号：S8、S13、S14)溶液5μL、枳实薄层对照药材溶液2μL及枳实薄层对照品溶液10μL点样于不同厂家的硅胶G薄层板(海洋硅胶G板、谱科硅胶G板、银龙硅胶G板)上，以三氯甲烷-甲醇(10:3)为展开剂，置氨蒸气饱和15分钟的展开缸内，展开(26℃、61％)，取出，晾干，喷以0.5％茚三酮乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。实验结果见图34～图36。

由图34～图36可见，采用不同厂家的硅胶G薄层板(海洋硅胶G板、谱科硅胶G板、银龙硅胶G板)对小承气汤中各成分的保留行为无差异，且供试品色谱与对照药材色谱、对照品色谱的斑点均显色清晰，分离度较好，供试品色谱与对照药材色谱、对照品色谱的斑点能够一一对应，说明该薄层鉴别方法的耐用性良好。

五、小承气汤的指纹图谱构建方法

5.1色谱条件与参照物溶液、供试品溶液的制备

5.1.1色谱条件

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm，色谱柱：Waters CORTECS T3柱)；以甲醇为流动相A，以0.1vol％磷酸水溶液为流动相B，按表8中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃，流速为每分钟0.2mL，检测波长为260nm。理论板数按儿茶素峰计算应不低于10000。

表8小承气汤指纹图谱用梯度洗脱表

5.1.2对照品溶液的制备

取芦荟大黄素对照品、大黄素对照品、大黄素甲醚对照品、大黄酸对照品、没食子酸对照品、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品、大黄酚对照品、大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品、大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷对照品、大黄酚8-O-葡萄糖苷对照品、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷对照品、儿茶素对照品、川陈皮素对照品、橙皮苷对照品、新橙皮苷对照品、柚皮苷对照品、橙皮内酯水合物对照品、厚朴酚对照品、和厚朴酚对照品，精密称定，分别加甲醇制成每1mL含芦荟大黄素-8-0-β-D-葡萄糖苷对照品15μg、柚皮苷对照品150μg、新橙皮苷对照品200μg、大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷对照品20μg、大黄酚-8-O-葡萄糖苷对照品30μg、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品20μg、芦荟大黄素对照品10μg、川陈皮素对照品10μg、大黄酸对照品30μg、和厚朴酚对照品15μg、厚朴酚对照品15μg、大黄素对照品10μg、大黄酚对照品15μg、大黄素甲醚对照品5μg的混合溶液，得到指纹图谱对照品溶液。

5.1.3供试品溶液的制备

取小承气汤冻干粉0.2g，置于锥形瓶中，精密加入80％甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再次称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；或取小承气汤煎液2mL，精密加入甲醇8mL，超声处理30分钟，用80％甲醇补足减失的重量，取续滤液，即得指纹图谱供试品溶液。

5.1.4测定法

分别精密吸取指纹图谱对照品溶液与指纹图谱供试品溶液各1μL，注入液相色谱仪，测定，即得指纹图谱。供试品指纹图谱中应分别呈现与参照物色谱峰保留时间相对应的色谱峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90。

5.2色谱条件的确定

5.2.1色谱柱

分别比较了Waters CORTECS T3柱(1.6μm，150mm×2.1mm)、Waters BEH C18柱(1.7μm，150mm×2.1mm)、Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(1.8μm，150mm×2.1mm)三根色谱柱对小承气汤指纹图谱色谱行为的影响。除色谱柱外，其他测试条件如5.1.1小节。结果见图37。

实验结果表明，不同色谱柱对小承气汤指纹图谱色谱峰峰数、峰形、峰分离度存在较大影响，以Waters CORTECS T3柱(1.6μm，150mm×2.1mm)为色谱柱，色谱峰峰数稍多，且峰形较好，基线较平稳，故选择Waters CORTECS T3柱为小承气汤指纹图谱研究色谱柱。

5.2.2最佳吸收波长

对不同吸收波长进行考察；吸收波长分别为220nm、260nm、280nm、290nm。采用Waters CORTECS T3柱(1.6μm，150mm×2.1mm)为色谱柱；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按表8中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.2mL；进样量为1μL；结果见图38。

通过对比220nm、260nm、280nm、290nm的图谱可知，当检测波长为260nm时，图谱中主要色谱峰峰面积较大，峰数目较多，满足信息量最大的原则。因此，将小承气汤指纹图谱的检测波长确定为260nm。

5.2.3流动相

对流动相类型进行考察，分别选用乙腈-磷酸、甲醇-水、甲醇-0.1vol％磷酸、甲醇-0.2vol％磷酸水溶液作为流动相，并采用如表8的梯度洗脱程序进行考察。采用WatersCORTECS T3柱(1.6μm，150mm×2.1mm)为色谱柱；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按表8中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.2mL，进样量为1μL；结果见图39、图40。

结果显示，若以乙腈-磷酸为流动相，供试品色谱较多成分出峰较早，色谱峰分离差；若以甲醇-水为流动相，色谱峰较少，且分离度较差；若以甲醇-磷酸作为流动相，色谱图信息较为丰富，色谱峰分离度较好，基线较平稳，出峰时间适宜。流动相以浓度为0.1％磷酸为佳，若采用0.2％磷酸，个别色谱峰分离度稍差。最终确定以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B，按表8的程序进行梯度洗脱。

5.2.4不同梯度的考察

梯度1：以Waters CORTECS T3 C18柱(1.6μm，150mm×2.1mm)为色谱柱，以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按表9中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3mL；进样量为1μL；结果见图41。

表9洗脱梯度1

梯度2：以Waters CORTECS T3 C18柱(2.1mm×150mm，1.6μm)为色谱柱；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按照表10进行梯度洗脱；检测波长为260nm，柱温为30℃，流速为每分钟0.3mL，进样量为1μL，结果见图42。

表10洗脱梯度2

梯度3：以Waters CORTECS T3 C18柱(2.1mm×150mm，1.6μm)为色谱柱；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按照表11进行梯度洗脱；检测波长为260nm，柱温为30℃，流速为每分钟0.2mL，进样量为1μL，结果见图43。

表11洗脱梯度3

梯度4：以Waters CORTECS T3 C18柱(2.1mm×150mm，1.6μm)为色谱柱；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按照表8进行梯度洗脱；检测波长为260nm，柱温为30℃，流速为每分钟0.2mL，进样量为1μL，结果见图44。

对比梯度1和梯度2，梯度1各色谱峰出峰位置均靠后，且各色谱峰分离较差，梯度2所得指纹图谱的后半部分色谱峰分离仍不佳；对比梯度2与梯度3，梯度3的色谱峰分离效果大大提高，但仍有个别峰分离较差；而梯度4所得的指纹图谱中的各色谱峰均达到了较好的分离效果，因此选择梯度4为洗脱梯度。

5.2.5流速的考察

分别考察了流速为每分钟0.18mL、每分钟0.2mL、每分钟0.22mL对小承气汤指纹图谱色谱行为的影响。除流速外，其他测试条件如5.1.1小节。结果如图45所示。

结果显示，不同流速对小承气汤指纹图谱色谱行为存在一定的影响，综合考虑色谱峰分离度、柱压等情况，研究确定小承气汤指纹图谱流动相流速为每分钟0.2mL。

5.2.6柱温的考察

分别考察了柱温为28℃、30℃、32℃对小承气汤指纹图谱色谱行为的影响。除柱温外，其他测试条件如5.1.1小节。结果如图46所示。

实验结果表明，不同色谱柱温度对小承气汤指纹图谱的无明显影响，表明该方法能适应一定的柱温变动，但综合考虑色谱峰峰形、峰分离度、基线等情况，本实验优选小承气汤指纹图谱研究的色谱柱温为30℃。

5.2.7色谱条件的确定

根据以上实验，确定色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm，色谱柱：Waters CORTECS T3柱)；以甲醇为流动相A，以0.1vol％磷酸水溶液为流动相B，按表8中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃，流速为每分钟0.2mL，检测波长为260nm。

5.3供试品溶液制备方法考察

5.3.1提取溶剂考察

分别考察了不同提取溶剂对小承气汤指纹图谱的影响，选取50％甲醇、80％甲醇、100％甲醇、稀乙醇(参中国药典第三部通则和指导原则试液部分)、100％乙醇作为提取溶剂，并比较不同提取溶剂指纹图谱结果。

其中，供试品溶液制备方法为：取小承气汤冻干粉0.2g，置于锥形瓶中，精密加入上述提取溶剂10mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再次称定重量，用相应的提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

按照5.1.1小节的条件进行测试，测试结果如表12所示。

表12小承气汤指纹图谱提取溶剂考察结果表

实验结果显示，不同提取溶剂的图谱中色谱峰的数目差异并不显著，以80％甲醇的“总峰面积/称样量”值最大，因此，选择以80％甲醇作为提取溶剂。

5.3.2提取方式考察

取小承气汤冻干粉0.2g，置于锥形瓶中，精密加入80％甲醇10mL，密塞，称定重量，分别超声处理、加热回流30min，放冷，再次称定重量，用相应浓度的80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

按照5.1.1小节的条件进行测试，测试结果如表13所示。

表13小承气汤指纹图谱提取方式考察结果表

实验结果显示，不同提取方式对小承气汤指纹图谱的“总峰面积/称样量”的值影响并不显著，因此，选择操作简便的超声作为提取方式。

5.3.3提取时间考察

考察不同提取时间对小承气汤指纹图谱的影响，选取考察15分钟、30分钟、45分钟三个不同提取时间。

其中，供试品溶液制备方法为：取小承气汤冻干粉0.2g，置于锥形瓶中，精密加入80％甲醇10mL，密塞，称定重量，各超声处理15min、30min、45min，放冷，再次称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

按照5.1.1小节的条件进行测试，测试结果如表14所示。

表14小承气汤指纹图谱提取时间考察结果表

实验结果显示，不同提取时间的“总峰面积/称样量”值不存在明显的差异，为保证提取完全，选择30min作为提取时间。

5.3.4提取溶剂用量考察

考察不同提取溶剂用量对小承气汤指纹图谱的影响，选取10mL、25mL两个不同提取溶剂用量。

其中，供试品溶液制备方法为：取小承气汤冻干粉0.2g，置于锥形瓶中，精密加入80％甲醇10mL、25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再次称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

按照5.1.1小节的条件进行测试，测试结果如表15所示。

表15小承气汤指纹图谱提取时间考察结果表

实验结果显示，增加溶剂用量，指纹图谱的“总峰面积×稀释倍数/称样量”值并无显著增大，表明10mL溶剂可以完全提取小承气汤中的化学成分，因此，为节省溶剂，选择10mL作为提取溶剂用量。

5.3.5供试品溶液制备方法的确定

根据上述实验结果，小承气汤指纹图谱样品前处理方法确定为：

取小承气汤冻干粉0.2g，置于锥形瓶中，精密加入80％甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再次称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

5.4方法学验证

5.4.1专属性考察

分别取缺每味药物的小承气汤，按照供试品溶液的制备方法制备，得到缺每味药材的阴性样品溶液。

分别取大黄、姜厚朴、麸炒枳实饮片，按照小承气汤冻干粉样品的制备方法制备每味药材的冻干粉，再按照供试品溶液的制备方法制备每味药材的指纹图谱对照药材溶液。

取芦荟大黄素-8-0-β-D-葡萄糖苷对照品、柚皮苷对照品、新橙皮苷对照品、大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷对照品、大黄酚-8-O-葡萄糖苷对照品、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品、芦荟大黄素对照品、川陈皮素对照品、大黄酸对照品、和厚朴酚对照品、厚朴酚对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含芦荟大黄素-8-0-β-D-葡萄糖苷对照品15μg、柚皮苷对照品150μg、新橙皮苷对照品200μg、大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷对照品20μg、大黄酚-8-O-葡萄糖苷对照品30μg、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品20μg、芦荟大黄素对照品10μg、川陈皮素对照品10μg、大黄酸对照品30μg、和厚朴酚对照品15μg、厚朴酚对照品15μg、大黄素对照品10μg、大黄酚对照品15μg、大黄素甲醚对照品5μg的溶液，即得每种对照品的指纹图谱对照品溶液。

将指纹图谱供试品溶液、缺每味药材的阴性样品溶液、每味药材的指纹图谱对照药材溶液、每种对照品的指纹图谱对照品溶液各1μL注入液相色谱仪，按5.1.1小节的色谱条件进样分析，结果如图47～图49所示。

由图47～图49可知：检测出小承气汤冻干粉指纹图谱18个共有色谱峰，其中13个峰(1、2、3、6、8、9、10、11、13、16、17、18号峰)来源于大黄，2个峰(14、15号峰)来源于姜厚朴，4个峰(4、5、7、12号峰)来源于麸炒枳实(参表16)；建立的指纹图谱能反映来源于处方中所有药味成分。

供试品色谱在与对照品色谱相应保留时间处有相同的色谱峰，阴性无干扰，综上所述，说明该方法专属性良好。

表16小气汤指纹图谱峰归属

5.4.2精密度考察

取同一批小承气汤冻干粉0.2g，按5.1.3小节的方法制备指纹图谱供试品溶液，按5.1.1小节的色谱条件重复进样6次，计算指纹图谱的相对保留时间、相对峰面积与相似度。结果显示：保留时间RSD在0.02％～0.08％范围内，相对峰面积在0.03％～1.63％范围内，RSD值均＜3％，相似度均为1.0000；表明该方法精密度良好。

5.4.3重复性考察

取同一批小承气汤冻干粉0.2g，平行6份，按5.1.3小节的方法制备指纹图谱供试品溶液，按5.1.1小节的色谱条件进样测定，并将指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012年版)计算相似度、相对保留时间与相对峰面积。结果显示：保留时间RSD在0.02％～0.06％范围内，相对峰面积在0.02％～1.91％范围内，RSD值均＜3％，相似度均为1.0000；表明该方法重复性良好。

5.4.4稳定性考察

取同一批小承气汤冻干粉0.2g，平行6份，按5.1.3小节的方法制备指纹图谱供试品溶液，按5.1.1小节的色谱条件，分别在0，3，6，9，12，18，24h进样测定，计算指纹图谱的相对保留时间、相对峰面积与相似度。结果显示：保留时间RSD在0.02％～0.10％范围内，相对峰面积在0.08％～2.41％范围内，RSD值均＜3％，相似度均为1.0000；表明该方法稳定性良好。

5.4.5中间精密度考察

由另外一名分析人员在不同日期取同一批小承气汤冻干粉，按5.1.3小节的方法制备指纹图谱供试品溶液，按5.1.1小节的色谱条件，使用不同的仪器进行测定，计算指纹图谱的相对保留时间、相对峰面积与相似度。结果显示：指纹图谱相对保留时间RSD在0.19％～0.82％范围内，相对峰面积在0.26％～8.30％范围内，相似度均为1.0000；表明该方法中间精密度良好。

5.5不同批次样品的测定及共有峰的确定

取15批次小承气汤对应实物，按确定的供试品溶液制备方法(5.1.3小节)制得指纹图谱供试品溶液，再按确定的色谱条件(5.1.1小节)，分别进样1μL，测定。以儿茶素为参照峰，计算各共有特征峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值，同时采用中药色谱指纹图谱相似度(2012年版)评价软件计算各个指纹图谱的相似度。结果见表17，色谱图见图50、图51。

结果表明，按平均数法生成小承气汤冻干粉对照指纹图谱，得到各批次小承气汤指纹图谱相似度，15批小承气汤指纹图谱相似度均大于0.90，相似度较高。

表17 15批次小承气汤冻干粉制剂指纹图谱相似度表

5.6指纹图谱的化学成分试验研究

根据小承气汤方中各药味所含化学成分，采用高分辨质谱，对小承气汤所含化学成分进行指认。

质谱条件：Thermo Vanquish型超高效液相色谱仪；UPLC-Q-Exactive Focus-MS/MS型高分辨质谱仪；Waters CORTECS T3(柱长150mm，内径2.1mm，粒径1.6μm)色谱柱。离子源HESI，正负离子模式分别检测，鞘气流速35μL/min，辅助气流速10μL/min，喷雾电压分别为3.8kV、3.2kV，毛细管温度350℃，离子源温度350℃，S-Lens RF Level 50；扫描模式为Full MS/dd-MS²，扫描范围m/z 100～1000。碰撞能量20、40eV。

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm，色谱柱：Waters CORTECS T3柱)；以甲醇为流动相A，以0.1％甲酸水溶液为流动相B，按表8的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟0.2mL；检测波长为260nm。

鉴定结果详见表18。

表18小承气汤指纹图谱成分指认结果

六、小承气汤中总蒽醌含量的测定方法

6.1测定方法

6.1.1色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长150mm，内径为3mm，粒径为2.5μm)；以甲醇为流动相A，以0.1vol％磷酸水溶液为流动相B，按表19中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟0.3mL；检测波长为254nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于3000。

表19小承气汤中总蒽醌含量测定用梯度洗脱表

6.1.2对照品溶液的制备

精密称取芦荟大黄素对照品0.829mg、大黄酸对照品0.809mg、大黄素对照品0.835mg、大黄酚对照品0.888mg、大黄素甲醚0.414mg，加甲醇制成每1mL含芦荟大黄素16.298μg、大黄酸16.067μg、大黄素16.032μg、大黄酚17.653μg、大黄素甲醚8.214μg的混合对照品溶液，即得总蒽醌对照品溶液。

6.1.3供试品溶液的制备

取小承气汤冻干粉0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10mL，置烧瓶中，挥去溶剂，加8％盐酸溶液10mL，超声处理2分钟，再加三氯甲烷10mL，加热回流1小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得总蒽醌供试品溶液。

6.1.4测定法

分别精密吸取总蒽醌对照品溶液与总蒽醌供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

6.2方法学验证

6.2.1专属性考察

取大黄阴性样品按6.1.3小节的供试品制备方法制备总蒽醌大黄阴性样品溶液，精密吸取总蒽醌阴性样品溶液、总蒽醌供试品溶液、总蒽醌对照品溶液各5μL注入液相色谱仪，按6.1.1小节的色谱条件测定，记录色谱图。结果见图52～54。结果显示，阴性样品色谱在对照品色谱和供试品溶液色谱相应位置上无对应色谱峰出现，说明该方法专属性较好。

6.2.2线性关系考察

精密称取芦荟大黄素对照品3.058mg于20mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，制得浓度为150.301ug/mL的芦荟大黄素对照品贮备液；精密量取芦荟大黄素对照品贮备液3mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再重复吸取上一级溶液5mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成浓度分别为45.090μg/mL、22.545μg/mL、11.273μg/mL、5.636μg/mL、2.818μg/mL、1.409μg/mL的对照品溶液。

精密称取大黄素对照品3.496mg于20mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，制得浓度为167.808μg/mL的大黄素对照品贮备液；精密量取大黄素照品贮备液3mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再重复吸取上一级溶液5mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成浓度分别为167.808μg/mL、50.342μg/mL、25.171μg/mL、12.586μg/mL、6.293μg/mL、3.146μg/mL、1.573μg/mL的对照品溶液。

精密称取大黄酸对照品1.775mg于20mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，制得浓度为88.129μg/mL的大黄酸对照品贮备液；精密量取大黄酸照品贮备液5mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再重复吸取上一级溶液5mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成浓度分别为88.129μg/mL、44.064μg/mL、22.032μg/mL、11.016μg/mL、5.508μg/mL、2.754μg/mL的对照品溶液。

精密称取大黄酚对照品3.102mg于20mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，制得浓度为23.362μg/mL的大黄酚对照品贮备液；精密量取大黄酚照品贮备液3mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再重复吸取上一级溶液5mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成浓度分别为154.169μg/mL、46.251μg/mL、23.125μg/mL、11.563μg/mL、5.781μg/mL、2.891μg/mL、1.445μg/mL的对照品溶液。

精密称取大黄素甲醚对照品2.355mg于100mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，制得浓度为23.362μg/mL的大黄素甲醚对照品贮备液；精密量取大黄素甲醚照品贮备液5mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再重复吸取上一级溶液5mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成浓度分别为23.362μg/mL、11.681μg/mL、5.840μg/mL、2.920μg/mL、1.460μg/mL、0.730μg/mL的对照品溶液。

将上述5个对照品不同浓度分别按照确定的色谱条件(6.1.1小节)依次进样5μL，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标(y)，对照品的浓度为横坐标(x)，并绘制标准曲线。

其中，芦荟大黄素回归方程为：y＝77.632x+10.137，R²＝1.0000，表明浓度在1.409～150.301μg/mL的范围内芦荟大黄素浓度与峰面积线性关系良好。

其中，大黄素回归方程为：y＝60.048x+10.753，R²＝1.0000，表明浓度在1.573～167.808μg/mL的范围内大黄素浓度与峰面积线性关系良好。

其中，大黄酸回归方程为：y＝49.273x+16.973，R²＝1.0000，表明浓度在2.754～88.129μg/mL的范围内大黄酸浓度与峰面积线性关系良好。

其中，大黄酚回归方程为：y＝89.245x-59.304，R²＝0.9994，表明浓度在1.445～154.169μg/mL的范围内大黄酚浓度与峰面积线性关系良好。

其中，大黄素甲醚回归方程为：y＝53.159x+0.0674，R²＝1.0000，表明浓度在0.730～23.362μg/mL的范围内大黄素甲醚浓度与峰面积线性关系良好。

6.2.3精密度考察

精密称取小承气汤冻干粉0.25g(批号：S3)，按6.1.3小节的方法制备得到总蒽醌供试品溶液，按6.1.1小节的色谱条件重复进样6次，测定供试品溶液中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积，并计算RSD值。实验结果显示，各指标峰面积RSD值分别为0.16％，0.06％，0.09％，0.10％，0.11％，均小于3.0％，说明仪器精密度良好。

6.2.4重复性考察

取同一批小承气汤冻干粉0.25g(批号：S3)，平行6份，按6.1.3小节的供试品制备方法制备得到总蒽醌供试品溶液，按6.1.1小节的色谱条件进样测定，计算含量的RSD值。实验结果显示，总蒽醌平均含量为0.936％，RSD为2.8％。

6.2.5中间精密度考察

由另外一名分析人员在不同日期取同一批小承气汤冻干粉(批号：S3)，按6.1.3小节的供试品制备方法制备得到总蒽醌供试品溶液，按6.1.1小节的色谱条件，使用不同的仪器进样分析，计算RSD值。实验结果显示，总蒽醌平均含量为0.937％，RSD为2.36％。

6.2.6稳定性考察

取同一批小承气汤冻干粉0.25g(批号：S3)，按6.1.3小节的供试品制备方法制备得到总蒽醌供试品溶液，按6.1.1小节的色谱条件，分别在0，2，4，8，12，16，20，24h进样测定，计算RSD值。实验结果显示，各指标在24小时内的峰面积RSD值分别为0.24％，0.30％，0.25％，0.19％，0.54％，均小于3.0％，说明稳定性良好。

6.2.7准确度考察

分别精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚对照品适量，加甲醇溶解并定容至刻度，分别制成浓度为165.685μg/mL芦荟大黄素、70.741μg/mL，70.931μg/mL大黄酸、359.729μg/mL，326.927μg/mL大黄酚、248.544μg/mL大黄素、47.517μg/mL大黄素甲醚的对照品母液。

取冻干粉(批号：S3)9份，每份约0.125g，精密称定，分别加入一定量的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品；同时精密称取随行空白样品两份，按照6.1.3小节的供试品溶液制备方法制备总蒽醌供试品溶液，再按照6.1.1小节的色谱条件测定，计算各成分回收率。

实验表明，总蒽醌加样回收试验结果中芦荟大黄素回收率范围在91.38％～104.92％，平均回收率为95.77％，RSD为5.1％；大黄酸回收率范围在90.92％～107.04％，平均回收率为98.73，RSD为5.4％；大黄酚回收率范围在90.39％～106.16％，平均回收率为97.66％，RSD为6.2％；大黄素回收率范围在98.30％～107.80％，平均回收率为102.24％，RSD为3.3％；大黄素甲醚回收率范围在92.86％～107.72％，平均回收率为101.69％，RSD为5.2％；均符合《中国药典》2020年版四部“药品质量标准分析方法验证指导原则”规定的限度90％-108％范围内，表明回收率良好。

6.2.8耐用性考察

(1)不同柱温考察

取同一批小承气汤冻干粉(批号：S3)0.25g，按6.1.3小节的方法制备得到总蒽醌供试品溶液，按6.1.1小节的色谱条件，分别在柱温28、30、32℃下进行测定，计算不同柱温下各对照品的含量及RSD值。实验结果显示，不同柱温下，总蒽醌的含量RSD为0.48％，均小于3％，表明该分析方法在柱温±2℃范围内耐用性良好。

(2)不同流速的考察

取同一批小承气汤冻干粉(批号：S3)0.25g，按6.1.3小节的方法制备得到总蒽醌供试品溶液，按6.1.1小节的色谱条件，分别以0.25、0.30、0.35mL/min为流速进行测定，计算不同流速下各对照品的含量及RSD值。实验结果显示，不同流速下总蒽醌含量分别为0.759％，0.753％，0.759％，RSD为0.46％，均小于3％，表明该分析方法在流速为0.25～0.35mL/min范围内耐用性良好。

(3)不同色谱柱考察

取同一批小承气汤冻干粉(批号：S3)0.25g，按6.1.3小节的方法制备得到总蒽醌供试品溶液，按6.1.1小节的色谱条件，分别采用3根相同规格参数的色谱柱进行测定，计算不同色谱柱测得的含量及RSD值。实验结果显示，该分析方法对不同的色谱柱的耐用性良好，RSD为0.28％。

6.3样品测定

取不同批次(S1～S15)小承气汤冻干粉样品适量，分别按照6.1.3小节的方法制备供试品溶液。按6.1.1小节的色谱条件进行测定，分别进样，测定不同批次小承气汤下总蒽醌供试品溶液中总蒽醌的含量。结果如表20所示。

表20不同批次小承气汤中总蒽醌含量测定结果

七、小承气汤中游离蒽醌、和厚朴酚、厚朴酚含量的测定方法

7.1测定方法

7.1.1色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长150mm，内径为3mm，粒径为2.5μm)；以甲醇流动相A，以0.1vol％磷酸水溶液为流动相B，按表21中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟0.3mL；检测波长为254nm和294nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于3000。

表21小承气汤中总游离蒽醌、和厚朴酚、厚朴酚含量测定用梯度洗脱表

需要说明的是，由于小承气汤成分复杂，对于游离蒽醌、和厚朴酚、厚朴酚的测试准确度有较大的影响。为此，本发明在考虑测试方法准确性、耐用性以及专属性的基础上，重新设计了梯度洗脱程序。具体的研究发现：在0min～9min，甲醇比例62％，0.1％磷酸比例38％，可有效地将芦荟大黄素从小承气汤的大极性的杂质分离出来；在9min～12min，甲醇比例62％→72％，0.1％磷酸比例38％→28％，可有效将芦荟大黄素与杂质峰分离，在12～21min，甲醇比例72％～95％，0.1％磷酸比例28％～5％，可有效地将大黄酸、和厚朴酚、厚朴酚、大黄素、大黄酚分离，无需设置太多梯度变化。另外，大黄素甲醚在不同的色谱柱上出峰时间不同，因此在21～30min范围内，设定甲醇-0.1％磷酸(95:5)等度洗脱10min，以确保测试方法对不同色谱柱耐用性，也提升测试准确度。

7.1.2对照品溶液的制备

精密称取芦荟大黄素对照品0.829mg、大黄酸对照品0.809mg、大黄素对照品0.835mg、大黄酚对照品0.888mg、大黄素甲醚0.414mg，加甲醇制成每1mL含芦荟大黄素16.298μg、大黄酸16.067μg、大黄素16.032μg、大黄酚17.653μg、大黄素甲醚8.214μg的混合对照品溶液，即得游离蒽醌对照品溶液。

精密称取和厚朴酚对照品0.634mg、厚朴酚对照品0.432mg，加甲醇制成每1mL含和厚朴酚25.114μg、厚朴酚17.280μg的混合对照品溶液，即得厚朴酚对照品溶液。

7.1.3供试品溶液的制备

取小承气汤冻干粉约0.2g，置于锥形瓶中，精密加入80％甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再次称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得游离蒽醌供试品溶液。

7.1.4测定法

分别精密吸取游离蒽醌对照品溶液、厚朴酚对照品溶液与游离蒽醌供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

7.2方法学验证

7.2.1专属性考察

分别取大黄阴性样品、厚朴阴性样品按7.1.3小节的供试品制备方法制备游离蒽醌大黄阴性样品溶液、游离蒽醌厚朴阴性样品溶液，精密吸取游离蒽醌大黄阴性样品溶液、游离蒽醌厚朴阴性样品溶液、游离蒽醌供试品溶液、游离蒽醌对照品溶液、厚朴酚对照品溶液各5μL注入液相色谱仪，按7.1.1小节的色谱条件测定，记录色谱图。结果见图55～58。结果显示，阴性样品色谱在对照品色谱和供试品溶液色谱相应位置上无对应色谱峰出现，说明该方法专属性较好。

7.2.2线性关系考察

精密称取芦荟大黄素对照品3.058mg于20mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，制得浓度为150.301ug/mL的芦荟大黄素对照品贮备液；精密量取芦荟大黄素对照品贮备液3mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再重复吸取上一级溶液5mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成浓度分别为45.090μg/mL、22.545μg/mL、11.273μg/mL、5.636μg/mL、2.818μg/mL、1.409μg/mL的对照品溶液。

精密称取大黄素对照品3.496mg于20mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，制得浓度为167.808μg/mL的大黄素对照品贮备液；精密量取大黄素照品贮备液3mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再重复吸取上一级溶液5mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成浓度分别为50.342μg/mL、25.171μg/mL、12.586μg/mL、6.293μg/mL、3.146μg/mL、1.573μg/mL的对照品溶液。

精密称取大黄酸对照品1.775mg于20mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，制得浓度为88.129μg/mL的大黄酸对照品贮备液；精密量取大黄酸照品贮备液5mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再重复吸取上一级溶液5mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成浓度分别为44.064μg/mL、22.032μg/mL、11.016μg/mL、5.508μg/mL、2.754μg/mL的对照品溶液。

精密称取大黄酚对照品3.102mg于20mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，制得浓度为23.362μg/mL的大黄酚对照品贮备液；精密量取大黄酚照品贮备液3mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再重复吸取上一级溶液5mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成浓度分别为46.251μg/mL、23.125μg/mL、11.563μg/mL、5.781μg/mL、2.891μg/mL、1.445μg/mL的对照品溶液。

精密称取大黄素甲醚对照品2.355mg于100mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，制得浓度为23.362μg/mL的大黄素甲醚对照品贮备液；精密量取大黄素甲醚照品贮备液5mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再重复吸取上一级溶液5mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成浓度分别为11.681μg/mL、5.840μg/mL、2.920μg/mL、1.460μg/mL、0.730μg/mL的对照品溶液。

精密称取和厚朴酚对照品3.330mg于20mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，制得浓度为166.167μg/mL的和厚朴酚对照品贮备液；精密量取和厚朴酚照品贮备液3mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再重复吸取上一级溶液5mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成浓度分别为49.850μg/mL、24.925μg/mL、12.463μg/mL、6.231μg/mL、3.116μg/mL、1.558μg/mL的对照品溶液。

精密称取厚朴酚对照品2.779mg于20mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，制得浓度为138.95μg/mL的厚朴酚对照品贮备液；精密量取和厚朴酚照品贮备液4mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再重复吸取上一级溶液5mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成浓度分别为55.580μg/mL、27.790μg/mL、13.895μg/mL、6.948μg/mL、3.474μg/mL、1.737μg/mL的对照品溶液。

将上述7个对照品不同浓度分别按照确定的色谱条件依次进样5μL，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标(y)，对照品的浓度为横坐标(x)，并绘制标准曲线。

其中，芦荟大黄素回归方程为：y＝77.632x+10.137，R²＝1.0000，表明浓度在1.409～150.301μg/mL的范围内芦荟大黄素浓度与峰面积线性关系良好。

其中，大黄素回归方程为：y＝60.048x+10.753，R²＝1.0000，表明浓度在1.573～167.808μg/mL的范围内大黄素浓度与峰面积线性关系良好。

其中，大黄酸回归方程为：y＝49.273x+16.973，R²＝1.0000，表明浓度在2.754～88.139μg/mL的范围内大黄酸浓度与峰面积线性关系良好。

其中，大黄酚回归方程为：y＝89.245x-59.304，R²＝0.9994，表明浓度在1.445～154.169μg/mL的范围内大黄酚浓度与峰面积线性关系良好。

其中，大黄素甲醚回归方程为：y＝53.159x+0.0674，R²＝1.0000，表明浓度在0.730～23.362μg/mL的范围内大黄素甲醚浓度与峰面积线性关系良好。

其中，和厚朴酚回归方程为：y＝5316.7x+5.6751，相关系数R²＝1.0000，表明在浓度为1.558μg/mL～166.167μg/mL的范围内和厚朴酚浓度与峰面积线性关系良好。

其中，厚朴酚回归方程为：y＝4578.2x+8.8417，相关系数R²＝1.0000，表明在浓度为1.737μg/mL～138.950μg/mL的范围内厚朴酚浓度与峰面积线性关系良好。

7.2.3精密度考察

精密称取小承气汤冻干粉约0.2g(批号：S3)，按7.1.3小节的供试品制备方法制备得到游离蒽醌供试品溶液，按7.1.1小节的色谱条件重复进样6次，测定供试品溶液中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、和厚朴酚、厚朴酚的峰面积，并计算RSD值。实验结果显示，各指标峰面积RSD值分别为0.14％，0.34％，0.12％，0.10％，0.10％，0.13％，0.13％，均小于3.0％，说明仪器精密度良好。

7.2.4重复性考察

精密称取小承气汤冻干粉约0.2g(批号：S3)，按7.1.3小节的供试品制备方法制备得到游离蒽醌供试品溶液，按7.1.1小节的色谱条件测定，计算含量的RSD值。实验结果显示，游离蒽醌平均含量为0.532％，RSD为1.39％；和厚朴酚与厚朴酚平均总含量为0.106％，RSD为1.25％。

7.2.5中间精密度考察

由另外一名分析人员在不同日期取同一批小承气汤冻干粉(批号：S3)，按照7.1.3小节的供试品制备方法制备游离蒽醌供试品溶液，按7.1.1小节的色谱条件，使用不同的仪器进样分析，计算RSD值。实验结果显示，游离蒽醌平均含量为0.359％，RSD为2.32％；和厚朴酚与厚朴酚平均含量为0.104％，RSD2.14％。

7.2.6稳定性考察

取同一批小承气汤冻干粉0.2g(批号：S3)，按7.1.3小节的供试品制备方法制备得到游离蒽醌供试品溶液，按7.1.1小节的色谱条件，分别在0，2，4，8，12，16，20，24h进样测定，计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、和厚朴酚、厚朴酚的RSD值。实验结果显示，各指标在24小时内的峰面积RSD值分别为0.34％，0.20％，0.24％，0.26％，0.30％，0.25％，0.29％，均小于3.0％，说明稳定性良好。

7.2.7准确度试验

分别精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚、和厚朴酚、厚朴酚适量，加甲醇溶解并定容至刻度，分别制成浓度为150.301μg/mL芦荟大黄素、42.217μg/mL大黄酸、62.542μg/mL大黄酚、167.808μg/mL大黄素、23.362μg/mL大黄素甲醚、166.167μg/mL和厚朴酚、138.95μg/mL厚朴酚的对照品母液。

取小承气汤冻干粉(批号：S3)9份，每份约0.1g，精密称定，分别加入一定量的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、和厚朴酚、厚朴酚对照品(溶剂挥干)；同时精密称取随行空白样品两份，按照7.1.3小节的供试品溶液制备方法制备游离蒽醌供试品溶液，再按照7.1.1小节的色谱条件测定，计算各成分回收率。

实验表明，总蒽醌加样回收试验结果中芦荟大黄素回收率范围在96.8％～101.7％，平均回收率为99.0％，RSD为1.5％；大黄酸回收率范围在98.4％～103.5％，平均回收率为100.7％，RSD为1.6％；大黄酚回收率范围在86.5％～90.3％，平均回收率为88.3％，RSD为1.56％；大黄素回收率范围在98.0％～102.7％，平均回收率为99.7％，RSD为1.6％；大黄素甲醚回收率范围在91.8％～102.5％，平均回收率为96.0％，RSD为3.9％；和厚朴酚回收率范围在87.0％～91.9％，平均回收率为88.0％，RSD为1.7％；厚朴酚回收率范围在85.9％～89.3％，平均回收率为87.5％，RSD为1.4％,均符合《中国药典》2020年版四部“药品质量标准分析方法验证指导原则”规定的限度90％-108％范围内，表明回收率良好。

7.2.8耐用性考察

(1)不同柱温考察

取同一批小承气汤冻干粉(批号：S3)0.2g，按7.1.3小节的方法制备得到游离蒽醌供试品溶液，按7.1.1小节的色谱条件，分别在柱温28、30、32℃下进行测定，计算不同柱温下各对照品的含量及RSD值。实验结果显示，不同柱温下，不同柱温下，游离蒽醌、和厚朴酚与厚朴酚含量RSD为1.2％，0.5％，均小于3％，表明该分析方法在柱温±2℃范围内耐用性良好。

(2)不同流速考察

取同一批小承气汤冻干粉(批号：S3)0.2g，按7.1.3小节的方法制备得到游离蒽醌供试品溶液，按7.1.1小节的色谱条件，分别以0.25、0.30、0.35mL/min为流速进行测定，计算不同流速下各对照品的含量及RSD值。实验结果显示，不同流速下游离蒽醌、和厚朴酚与厚朴酚含量分别为0.343％，0.105％，RSD为2.5％，0.5％。

(3)不同色谱柱考察

取同一批小承气汤冻干粉(批号：S3)0.2g，按7.1.3小节的方法制备得到游离蒽醌供试品溶液，按7.1.1小节的色谱条件，分别采用3根相同规格参数的色谱柱进行测定，计算不同色谱柱测得的含量及RSD值。实验结果显示，该分析方法在不同的色谱柱测试时，游离蒽醌、和厚朴酚与厚朴酚含量的RSD值分别为1.0％、2.0％，均小于3％，耐用性良好。

7.3样品测定

取不同批次(S1～S15)小承气汤适量，分别制备游离蒽醌供试品溶液；按7.1.1小节的色谱条件进行测定，分别进样，测定不同批次小承气汤下供试品溶液中游离蒽醌、厚朴酚、和厚朴酚的含量。并结合表20的测定，计算不同批次小承气汤冻干粉中结合蒽醌的含量，其中结合蒽醌含量＝总蒽醌含量-游离蒽醌含量。结果如表22所示。

表22不同批次小承气汤游离蒽醌、结合蒽醌、和厚朴酚、厚朴酚含量测定结果

综合以上结果，应控制小承气汤成品中和厚朴酚、厚朴酚的总含量为0.04～0.32％，游离蒽醌为0.16～0.56％，总蒽醌为0.74～1.78％；且控制和厚朴酚与厚朴酚转移率为0.98～4.06％，游离蒽醌的转移率为10.42％～25.32％，总蒽醌的转移率为12.38％～22.99％。

八、小承气汤中柚皮苷和新橙皮苷含量的测定方法

8.1测定方法

8.1.1色谱条件

以Waters Xbridge C18(4.6mm×250mm，5μm)为色谱柱；以乙腈-0.1％磷酸(20:80)为流动相；柱温：30℃；流速：1mL/min；检测波长：283nm。

8.1.2对照品溶液的制备

取新橙皮苷对照品3.302mg、柚皮苷对照品3.379mg，精密称定，置容量瓶中，加甲醇制成每1mL含新橙皮苷164.109μg、柚皮苷154.927μg的混合对照品溶液，即得柚皮苷对照品溶液。

8.1.3供试品溶液的制备

取小承气汤冻干粉0.1g，置于锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再次称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得柚皮苷供试品溶液。

8.1.4测定法

分别精密吸取柚皮苷对照品溶液和柚皮苷供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

8.2方法学验证

8.2.1专属性考察

分别取枳实阴性样品按8.1.3小节的供试品制备方法制备柚皮苷枳实阴性样品溶液，精密吸取柚皮苷枳实阴性样品溶液、柚皮苷供试品溶液、游离蒽醌对照品溶液、柚皮苷对照品溶液各5μL注入液相色谱仪，按8.1.1小节的色谱条件测定，记录色谱图，结果见图59～61。结果显示，阴性样品色谱在对照品色谱和供试品溶液色谱相应位置上无对应色谱峰出现，说明该方法专属性较好。

8.2.2线性关系考察

取柚皮苷对照品3.286mg于5mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，制得浓度为602.652ug/mL的柚皮苷对照品贮备液；取新橙皮苷对照品3.179mg于5mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，制得浓度为631.985μg/mL的新橙皮苷对照品贮备液；

精密吸取柚皮苷对照品母液与新橙皮苷对照品母液1.0mL于2mL量瓶中，摇匀，配制成柚皮苷浓度为301.326μg/mL，新橙皮苷浓度为315.993μg/mL的对照品混合溶液⑤；精密吸取对照品混合溶液⑤1.0mL于2mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，配制成浓度柚皮苷浓度为150.663μg/mL，新橙皮苷浓度为157.996μg/mL的对照品混合溶液④；精密吸取对照品混合溶液④1.0mL于5mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，配制成浓度柚皮苷浓度为30.133μg/mL，新橙皮苷浓度为31.599μg/mL的对照品混合溶液③；精密吸取对照品混合溶液③1.0mL于2mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，配制成浓度柚皮苷浓度为15.066μg/mL，新橙皮苷浓度为15.800μg/mL的对照品混合溶液②；精密吸取对照品混合溶液②1.0mL于5mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，配制成浓度柚皮苷浓度为3.013μg/mL，新橙皮苷浓度为3.160μg/mL的对照品混合溶液①。

将上述2个对照品不同浓度分别按照8.1.1小节的色谱条件依次进样5μL，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标(y)，对照品的浓度为横坐标(x)，并绘制标准曲线。

其中，柚皮苷回归方程为：y＝9036.5x+12851，R²＝0.9999，表明浓度在3.013～602.652μg/mL的范围内柚皮苷浓度与峰面积线性关系良好。

其中，新橙皮苷回归方程为：y＝9382.2x+8697.2，R²＝0.9999，表明浓度在3.160～631.985μg/mL的范围内大黄素浓度与峰面积线性关系良好。

8.2.3精密度考察

精密称取小承气汤冻干粉约0.1g(批号：S3)，按照8.1.3小节的方法制备得到柚皮苷供试品溶液，按8.1.1小节的色谱条件重复进样6次，测定柚皮苷供试品溶液中柚皮苷、新橙皮苷的峰面积，并计算RSD值。实验结果显示，各指标峰面积RSD值分别为0.97％，0.74％，均小于3.0％，说明仪器精密度良好。

8.2.4重复性考察

精密称取小承气汤冻干粉约0.1g(批号：S3)，按照8.1.3小节的方法制备得到柚皮苷供试品溶液，按8.1.1小节的色谱条件测定，计算含量的RSD值。实验结果显示，柚皮苷平均含量为6.598％，RSD为1.53％；新橙皮苷平均含量为7.944％，RSD为0.95％。

8.2.5中间精密度考察

由另外一名分析人员在不同日期取同一批小承气汤冻干粉(批号：S3)，按照8.1.3小节的方法制备得到柚皮苷供试品溶液，按8.1.1小节的色谱条件，使用不同的仪器进样分析，计算RSD值。实验结果显示，柚皮苷平均含量6.647％，中间精密度RSD为1.14％；新橙皮苷平均含量为7.761％，中间精密度RSD为1.40％。

8.2.6稳定性考察

取同一批小承气汤冻干粉0.1g(批号：S3)，按照8.1.3小节的方法制备得到柚皮苷供试品溶液，按8.1.1小节的色谱条件，分别在0，2，4，8，12，16，24h进样测定，计算柚皮苷、新橙皮苷的RSD值。实验结果显示，各指标在24小时内的峰面积RSD值分别为1.52％，1.13％，均小于3.0％，说明稳定性良好。

8.2.7准确度试验

取小承气汤冻干粉(批号：S3)9份，每份约0.05g，精密称定，分别加入一定量的柚皮苷、新橙皮苷对照品；同时精密称取随行空白样品两份，按照8.1.3小节的制备方法制备柚皮苷供试品溶液，再按照8.1.1小节的色谱条件测定，计算各成分回收率。

实验表明，柚皮苷加样回收试验结果中柚皮苷回收率范围在95.99％～101.83％，平均回收率为98.88％，RSD为1.9％；新橙皮苷回收率范围在95.02％～98.42％，平均回收率为95.66％，RSD为1.16％，均符合《中国药典》2020年版四部“药品质量标准分析方法验证指导原则”规定的限度95％-105％范围内，表明回收率良好。

8.2.8耐用性考察

(1)不同柱温考察

取同一批小承气汤冻干粉(批号：S3)0.1g，按照8.1.3小节的方法制备得到柚皮苷供试品溶液，按8.1.1小节的色谱条件，分别在柱温27、30、33℃下进行测定，计算不同柱温下各对照品的含量及RSD值。实验结果显示，不同柱温下，柚皮苷、新橙皮苷含量RSD分别为2.72％，1.13％，均小于3％，表明该分析方法在柱温±3℃范围内耐用性良好。

(2)不同流速考察

取同一批小承气汤冻干粉(批号：S3)0.1g，按照8.1.3小节的方法制备得到柚皮苷供试品溶液，按8.1.1小节的色谱条件，分别在以0.8、1.0、1.2mL/min为流速进行测定，计算不同流速下各对照品的含量及RSD值。实验结果显示，不同流速下柚皮苷、新橙皮苷含量分别为6.934％，7.732％，RSD分别为1.63％，1.90％。

(3)不同色谱柱考察

取同一批小承气汤冻干粉(批号：S3)0.1g，按照8.1.3小节的方法制备得到柚皮苷供试品溶液，按8.1.1小节的色谱条件，分别采用3根相同规格参数的色谱柱进行测定，计算不同品牌色谱柱测得的含量及RSD值。实验结果显示，该分析方法在不同品牌色谱柱测定时，柚皮苷、新橙皮苷含量的RSD值分别为0.57％、0.75％，均小于3％，表明该方法耐用性良好。

8.3样品测定

取不同批次(S1～S15)小承气汤适量，分别按照8.1.3小节的方法制备得到柚皮苷供试品溶液；按8.1.1小节的色谱条件进行测定，分别进样，测定不同批次小承气汤下供试品溶液中肉桂酸、桂皮醛的含量。结果如表23所示。

表23不同批次小承气汤中柚皮苷、新橙皮苷含量测定结果

综合以上结果，应控制小承气汤成品中柚皮苷含量为5.3～9.84％，新橙皮苷含量为6.05～11.24％；且控制柚皮苷的转移率26.96～50.07％，新橙皮苷的转移率为24.58～45.64％。

九、小承气汤中辛弗林含量的测定方法

9.1测定方法

9.1.1色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长150mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇-水(含0.1％磷酸、0.1％十二烷基磺酸钠)(15:55)为流动相；柱温为30℃；流速为每分钟1.0mL；检测波长为224nm。理论板数按辛弗林峰计算应不低于3000。

9.1.2对照品溶液的制备

精密称取辛弗林对照品2.093mg，精密称定，加50％甲醇制成每1mL含辛弗林对照品104.127μg的对照品溶液，即得辛弗林对照品溶液。

9.1.3供试品溶液的制备

取小承气汤冻干粉0.2g，置于锥形瓶中，精密加入80％甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再次称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得辛弗林供试品溶液。

9.1.4测定法

分别精密吸取辛弗林对照品溶液与辛弗林供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

9.2方法学验证

9.2.1专属性考察

取枳实阴性样品按9.1.3节的供试品制备方法制备辛弗林枳实阴性样品溶液，精密吸取辛弗林枳实阴性样品溶液、辛弗林供试品溶液、辛弗林对照品溶液各10μL，按9.1.1小节的色谱条件测定(图62～图64)。结果显示，阴性样品色谱在对照品色谱和供试品溶液色谱相应位置上无对应色谱峰出现，说明该方法专属性较好。

阴性供试品溶液在甘草酸对照品的相应保留时间无色谱峰，说明组方中其他组份对甘草酸无干扰，该方法专属性良好。

9.2.2线性关系考察

精密称取辛弗林对照品4.155mg于10mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，制得浓度为413.422ug/mL的辛弗林对照品贮备液；将上述辛弗林对照品贮备液稀释1、2、5、10、25、50、100倍，得到不同浓度的对照品溶液；

将上述对照品不同浓度分别按照9.1.1小节的色谱条件依次进样10μL，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标(y)，对照品的浓度为横坐标(x)，并绘制标准曲线。

辛弗林回归方程为：y＝30006x-82901，R²＝0.9998，表明浓度在4.1342～413.422μg/mL的范围内辛弗林浓度与峰面积线性关系良好。

9.2.3精密度考察

精密称取小承气汤冻干粉约0.2g(批号：S3)，按9.1.3小节的方法制备得到辛弗林供试品溶液，按9.1.1小节的色谱条件重复进样6次，测定辛弗林供试品溶液中辛弗林的峰面积，并计算RSD值。实验结果显示，辛弗林峰面积RSD值分别为0.42％，小于3.0％，说明仪器精密度良好。

9.2.4重复性考察

取同一批小承气汤冻干粉0.2g(批号：S3)，平行6份，按9.1.3小节的方法制备得到辛弗林供试品溶液，按9.1.1小节的色谱条件测定，计算辛弗林含量的RSD值。实验结果显示，辛弗林平均含量为2.135％，RSD为0.13％。

9.2.5中间精密度考察

由另外一名分析人员在不同日期取同一批小承气汤冻干粉(批号：S3)，按9.1.3小节的方法制备得到辛弗林供试品溶液，按9.1.1小节的色谱条件，使用不同的仪器进样分析，计算RSD值。实验结果显示，辛弗林平均含量0.2156％，中间精密度RSD为0.82％。

9.2.6稳定性考察

取同一批小承气汤冻干粉0.2g(批号：S3)，按9.1.3小节的方法制备得到辛弗林供试品溶液，按9.1.1小节的色谱条件，分别在0，2，4，8，12，16，24h进样测定，计算辛弗林的RSD值。实验结果显示，辛弗林在24小时内的峰面积RSD值为1.97％，小于3.0％，说明稳定性良好。

9.2.7准确度试验

精密称取辛弗林对照品4.146mg，加80％甲醇制成每1mL含辛弗林412.527μg的对照品储备液；

分别精密吸取已知浓度的对照品储备液0.25、0.5、0.75mL于具塞锥形瓶中，每组平行3份，挥干，分别精密称取已知含量的小承气汤冻干粉0.1g，按照9.1.3小节的方法制备辛弗林供试品溶液，再按照确定的色谱条件测定，计算各成分回收率。

实验表明，辛弗林加样回收试验中辛弗林回收率范围在95.68％～102.60％，平均回收率为98.96％，RSD为2.48％，符合《中国药典》2020年版四部“药品质量标准分析方法验证指导原则”规定的限度95％-105％范围内，表明回收率良好。

9.2.8耐用性考察

(1)不同柱温考察

取同一批小承气汤冻干粉(批号：S3)0.2g，按9.1.3小节的方法制备得到辛弗林供试品溶液，按9.1.1小节的色谱条件，分别在柱温28、30、32℃下进行测定，计算不同柱温下各对照品的含量及RSD值。实验结果显示，不同柱温下，辛弗林含量和RSD为0.3934％，1.49％，小于3％，表明该分析方法在柱温±3℃范围内耐用性良好。

(2)不同流速考察

取同一批小承气汤冻干粉0.2g(批号：S3)0.2g，按9.1.3小节的方法制备得到辛弗林供试品溶液，按9.1.1小节的色谱条件，分别以0.9、1.0、1.1mL/min为流速进行测定，计算不同流速下各对照品的含量及RSD值。实验结果显示，不同流速下辛弗林含量为0.3965％，RSD值为2.6％。

(3)不同色谱柱考察

取同一批小承气汤冻干粉0.2g批号：S3)0.2g，按9.1.3小节的方法制备得到辛弗林供试品溶液，按9.1.1小节的色谱条件，分别采用3根相同规格参数的色谱柱进行测定，计算不同色谱柱测得的含量及RSD值。实验结果显示，该分析方法在使用不同色谱柱时，辛弗林含量的RSD值为1.96％，小于3％，表明该方法耐用性良好。

9.3样品测定

取不同批次(S1～S15)小承气汤适量，分别按照9.1.3小节的方法制备得到辛弗林供试品溶液；按9.1.1小节的色谱条件进行测定，分别进样，测定不同批次小承气汤下供试品溶液中辛弗林的含量。结果如表24所示。

表24不同批次小承气汤中辛弗林含量测定结果

综合以上结果，应控制小承气汤成品中辛弗林含量为0.21～0.50％，辛弗林的转移率为17.09～48.43％。

以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (37)

1.一种小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述小承气汤由以下组分组成：大黄、厚朴和枳实；所述建立方法包括：

(1)采用薄层色谱法对大黄、厚朴、枳实进行鉴别；

(2)构建指纹图谱对小承气汤中的成分进行鉴别；

(3)采用高效液相色谱法对小承气汤中的总蒽醌含量、游离蒽醌含量、和厚朴酚含量、厚朴酚含量、柚皮苷含量、新橙皮苷含量、辛弗林含量进行测定，并计算结合蒽醌含量；其中，结合蒽醌含量＝总蒽醌含量-游离蒽醌含量。

2.如权利要求1所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述大黄的薄层色谱鉴别方法为：

(1)取小承气汤制剂0.2～0.5g，加甲醇20～30mL，超声处理30～60min，滤过，取滤液5mL，蒸干，残渣加水10mL使溶解，再加盐酸1mL，加热回流30～60min，立即冷却，用乙醚分2～3次振摇提取，每次20～30mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1～2mL使溶解，作为大黄薄层供试品溶液；

(2)取大黄对照药材0.1～0.5g，加水100mL，加热煮沸45～60分钟，滤过，滤液浓缩至约10～20mL，再加盐酸1mL，加热回流30～60min，立即冷却，用乙醚分2～3次振摇提取，每次20～30mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1～2mL使溶解，作为大黄薄层对照药材溶液；

(3)取芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄素、大黄酸和大黄酚对照品，加甲醇制成每1mL含芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄素、大黄酸和大黄酚各0.1mg的溶液，作为大黄薄层对照品溶液；

(4)分别吸取大黄薄层供试品溶液、大黄薄层对照药材溶液各3～5μL、大黄薄层对照品溶液5～10μL，点样于同一硅胶G薄层板上，以体积比为8.5:1.5:0.2的石油醚、乙酸乙酯、甲酸的混合溶液为展开剂，展开，取出，晾干，在波长为365nm的紫外光下检视，供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的5个斑点；置氨蒸气中熏蒸后，斑点变为红色；

其中，所述石油醚的沸程为60～90℃。

3.如权利要求1所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述厚朴的薄层色谱鉴别方法为：

(1)取小承气汤制剂，加甲醇提取后得到厚朴薄层供试品溶液；

(2)取厚朴对照药材，加甲醇提取后得到厚朴薄层对照药材溶液；

(3)取和厚朴酚、厚朴酚对照品，加甲醇溶解后得到厚朴薄层对照品溶液；

(4)分别吸取厚朴薄层供试品溶液、厚朴薄层对照药材溶液和厚朴薄层对照品溶液，点于同一硅胶G板上，以环己烷、甲酸乙酯和甲酸的混合溶液为展开剂，展开；供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

4.如权利要求1或3所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述厚朴的薄层色谱鉴别方法为：

(1)取小承气汤制剂0.2～0.5g，加甲醇20～30mL，超声处理30～60min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1～2mL使溶解，即得厚朴薄层供试品溶液；

(2)取厚朴对照药材1～3g，加水100mL，加热煮沸45～60分钟，滤过，滤液浓缩至约10mL，拌入预设量的硅藻土，蒸干，再加甲醇20～30mL，超声处理30～60min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1～2mL使溶解，即得厚朴薄层对照药材溶液；

(3)取厚朴酚、和厚朴酚对照品，加甲醇制成每1mL含厚朴酚、和厚朴酚各0.1mg的溶液，即得厚朴薄层对照品溶液；

(4)分别吸取厚朴薄层供试品溶液5～10μL、厚朴薄层对照药材溶液3～5μL及厚朴薄层对照品溶液5～10μL，点样于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15:5:1的环己烷、甲酸乙酯和甲酸的混合溶液的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

5.如权利要求1所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述枳实的薄层色谱鉴别方法为：

(1)取小承气汤制剂，加甲醇提取后得到枳实薄层供试品溶液；

(2)取枳实对照药材，加甲醇提取后得到枳实薄层对照药材溶液；

(3)取辛弗林对照品，加甲醇溶解后得到枳实薄层对照品溶液；

(4)分别吸取枳实薄层供试品溶液、枳实薄层对照药材溶液和枳实薄层对照品溶液，点于同一硅胶G板上，以三氯甲烷和甲醇的混合溶液为展开剂，展开；供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

6.如权利要求1或5所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述枳实的薄层色谱鉴别方法为：

(1)取小承气汤制剂0.2～0.5g，加甲醇20～30mL，超声处理30～60min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1～2mL使溶解，得到枳实薄层供试品溶液；

(2)取枳实对照药材0.5～2g，加水100mL，加热煮沸45～60分钟，滤过，滤液浓缩至约10mL，拌入预设量的硅藻土，蒸干，再加甲醇20～30mL，超声处理30～60min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1～2mL使溶解，得到枳实薄层对照药材溶液；

(3)取辛弗林对照品，加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液，得到枳实薄层对照品溶液；

(4)吸取枳实薄层供试品溶液2～5μL、枳实薄层对照药材溶液2～4μL及枳实薄层对照品溶液5～10μL，点样于同一硅胶G薄层板上，以体积比为10:3的三氯甲烷和甲醇的混合溶液为展开剂，置氨蒸气饱和15～30分钟的展开缸内，展开，取出，晾干，喷以0.5％茚三酮乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视；供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

7.如权利要求1所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述小承气汤指纹图谱的构建方法为：

(1)分别取芦荟大黄素对照品、大黄素对照品、大黄素甲醚对照品、大黄酸对照品、没食子酸对照品、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品、大黄酚对照品、大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品、大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷对照品、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷对照品、儿茶素对照品、川陈皮素对照品、橙皮苷对照品、新橙皮苷对照品、柚皮苷对照品、厚朴酚对照品、和厚朴酚对照品，加入溶剂溶解或提取，制得指纹图谱对照品溶液；

(2)取小承气汤制剂，加提取溶剂提取，制得指纹图谱供试品溶液；

(3)取预设量的指纹图谱对照品溶液和指纹图谱供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，构建小承气汤的指纹图谱。

8.如权利要求7所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述梯度洗脱按下述程序进行：

0～5min，流动相A从3％→21％，流动相B从97％→79％；

5～20min，流动相A从21％→36％，流动相B从79％→64％；

20～32min，流动相A从36％→50％，流动相B从64％→50％；

32～42min，流动相A从50％→62％，流动相B从50％→38％；

42～50min，流动相A从62％→85％，流动相B从38％→15％；

50～60min，流动相A从85％→95％，流动相B从15％→5％。

9.如权利要求7所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，步骤(3)中，分别吸取指纹图谱对照品溶液和供试品溶液各1～3μL，注入液相色谱仪进行检测，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，所述液相色谱仪以甲醇为流动相A，以0.1～0.2vol％的磷酸水溶液为流动相B；流速为0.18～0.22mL/min；柱温为28～32℃，检测波长为220～290nm。

10.如权利要求9所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，步骤(3)中，分别吸取指纹图谱对照品溶液和指纹图谱供试品溶液各1μL，注入液相色谱仪进行检测，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm；所述液相色谱仪以甲醇为流动相A，以0.1vol％的磷酸溶液为流动相B；流速为0.2mL/min；柱温为30℃，检测波长为260nm。

11.如权利要求7所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，步骤(1)中，分别取芦荟大黄素对照品、大黄素对照品、大黄素甲醚对照品、大黄酸对照品、没食子酸对照品、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品、大黄酚对照品、大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品、大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷对照品、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷对照品、儿茶素对照品、川陈皮素对照品、橙皮苷对照品、新橙皮苷对照品、柚皮苷对照品、厚朴酚对照品、和厚朴酚对照品，加入甲醇制成每1mL含芦荟大黄素-8-0-β-D-葡萄糖苷对照品15μg、柚皮苷对照品150μg、新橙皮苷对照品200μg、大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷对照品20μg、大黄酚-8-O-葡萄糖苷对照品30μg、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品20μg、芦荟大黄素对照品10μg、川陈皮素对照品10μg、大黄酸对照品30μg、和厚朴酚对照品15μg、厚朴酚对照品15μg、大黄素对照品10μg、大黄酚对照品15μg、大黄素甲醚对照品5μg的混合溶液，得到指纹图谱对照品溶液。

12.如权利要求7所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，步骤(2)中，所述提取溶剂为50～100％甲醇，提取时间为15～30min，提取方式为超声提取或回流提取。

13.如权利要求12所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，步骤(2)包括：

取小承气汤制剂0.2g，置于锥形瓶中，精密加入80％甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再次称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；或取小承气汤煎液2mL，精密加入甲醇8mL，超声处理30分钟，用80％甲醇补足减失的重量，取续滤液，即得指纹图谱供试品溶液。

14.如权利要求7所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述小承气汤的指纹图谱包括18个特征峰；其中，峰1为没食子酸，峰2为儿茶素，峰3为芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷，峰4为柚皮苷，峰5为橙皮苷，峰6为大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷，峰7为新橙皮苷，峰8为大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷，峰9为大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷，峰10为大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷，峰11为芦荟大黄素，峰12为川陈皮素，峰13为大黄酸，峰14为和厚朴酚，峰15为厚朴酚，峰16为大黄素，峰17为大黄酚，峰18为大黄素甲醚。

15.如权利要求1所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述总蒽醌含量的测定方法为：

(1)取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚，加甲醇制成混合溶液，制得总蒽醌对照品溶液；

(2)取小承气汤制剂，加入提取溶剂提取，制得总蒽醌供试品溶液；

(3)吸取总蒽醌对照品溶液、总蒽醌供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，所述液相色谱仪以甲醇为流动相A，磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，测定得到小承气汤中总蒽醌的含量。

16.如权利要求15所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述总蒽醌含量的测定方法按照以下洗脱程序进行：

0～9min，流动相A为62％，流动相B为38％；

9～12min，流动相A从62％→72％，流动相B从38％→28％；

12～21min，流动相A从72％→95％，流动相B从28％→5％；

21～30min，流动相A为95％，流动相B为5％。

17.如权利要求15所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述总蒽醌含量的测定方法中，所述总蒽醌供试品溶液的制备方法为：

取小承气汤制剂0.25～0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25～50mL，密塞，称定重量，采用功率为200～300kW，频率为35～45kHz的超声波处理30～60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取续滤液10mL，置烧瓶中，挥去溶剂，加8％盐酸溶液10mL，超声处理2分钟，再加三氯甲烷10～20mL，加热回流1～2小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10～20mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

18.如权利要求15所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述总蒽醌含量的测定方法中，分别吸取总蒽醌对照品溶液、总蒽醌供试品溶液各5～10μL，注入液相色谱仪进行检测，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱温为28～32℃；所述液相色谱仪以甲醇为流动相A，以0.08～0.12vol％的磷酸水溶液为流动相B，流速为0.25～0.35mL/min，检测波长为250～260nm。

19.如权利要求18所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述总蒽醌的含量测定方法中，分别吸取总蒽醌对照品溶液5μL和总蒽醌供试品溶液5μL，注入液相色谱仪进行检测，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长为150mm，内径为3.0mm，粒径为2.5μm，柱温为30℃；以甲醇为流动相A，以0.1vol％的磷酸溶液为流动相B；流速为0.3mL/min，检测波长为254nm。

20.如权利要求1所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述游离蒽醌、和厚朴酚、厚朴酚含量的测定方法为：

(1)取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚，加甲醇制成混合溶液，制得游离蒽醌对照品溶液；

(2)取和厚朴酚、厚朴酚，加甲醇制成混合溶液，制得厚朴酚对照品溶液；

(3)取小承气汤制剂，利用提取溶剂提取，制得游离蒽醌供试品溶液；

(3)吸取游离蒽醌对照品溶液、厚朴酚对照品溶液和游离蒽醌供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，测定得到小承气汤中游离蒽醌、和厚朴酚、厚朴酚含量。

21.如权利要求20所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述游离蒽醌、和厚朴酚、厚朴酚含量的测定方法按照以下洗脱程序进行：

0～9min，流动相A为62％，流动相B为38％；

9～12min，流动相A从62％→72％，流动相B从38％→28％；

12～21min，流动相A从72％→95％，流动相B从28％→5％；

21～30min，流动相A为95％，流动相B为5％。

22.如权利要求20所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述游离蒽醌供试品溶液的制备方法为：

取小承气汤制剂0.2～0.5g，置于锥形瓶中，精密加入70～80％甲醇10～20mL，密塞，称定重量，采用功率为200～300kW、频率为35～45kHz的超声波处理20～30分钟，放冷，再次称定重量，用70～80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

23.如权利要求20所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述游离蒽醌、和厚朴酚、厚朴酚含量的测定方法中，分别吸取游离蒽醌对照品溶液、厚朴酚对照品溶液和游离蒽醌供试品溶液各5～10μL，注入液相色谱仪进行检测，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱温为28～32℃；所述液相色谱仪以甲醇为流动相A，以0.08～0.12vol％的磷酸水溶液为流动相B，流速为0.25～0.35mL/min，检测波长为250～300nm。

24.如权利要求23所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述游离蒽醌、和厚朴酚、厚朴酚含量的测定方法中，分别吸取游离蒽醌对照品溶液、厚朴酚对照品溶液和游离蒽醌供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪进行检测，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长为150mm，内径为3mm，粒径为2.5μm，其柱温为30℃；所述液相色谱仪以甲醇为流动相A，以0.1vol％的磷酸水溶液为流动相B，流速为0.3mL/min，检测波长为254nm和294nm。

25.如权利要求1所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述柚皮苷和新橙皮苷含量的测定方法为：

(1)取柚皮苷、新橙皮苷，加甲醇制成混合溶液，即得柚皮苷对照品溶液；

(2)取小承气汤制剂，加入提取溶剂提取，制得柚皮苷供试品溶液；

(3)吸取柚皮苷对照品溶液、柚皮苷供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，所述液相色谱仪以乙腈为流动相A，磷酸水溶液为流动相B进行洗脱，测定得到小承气汤中柚皮苷和新橙皮苷的含量。

26.如权利要求25所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述柚皮苷供试品溶液的制备方法为：

取小承气汤制剂0.1～0.3g，置于锥形瓶中，精密加入甲醇50～100mL，密塞，称定重量，以功率为200～300kW、频率为35～45kHz的超声波处理20～60分钟，放冷，再次称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

27.如权利要求25所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述柚皮苷和新橙皮苷含量的测定方法中，分别吸取柚皮苷对照品溶液和柚皮苷供试品溶液各5～10μL，注入液相色谱仪进行检测，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱温为27～33℃；所述液相色谱仪以乙腈为流动相A，以0.08～0.12vol％的磷酸溶液为流动相B；流速为0.8～1.2mL/min；检测波长为254～290nm。

28.如权利要求27所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述柚皮苷和新橙皮苷含量的测定方法中，分别吸取柚皮苷对照品溶液和柚皮苷供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪进行检测，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5.0μm，柱温为30℃；所述液相色谱仪以乙腈为流动相A，以0.1vol％的磷酸溶液为流动相B，且洗脱过程中流动相A与流动相B的体积比为20:40；流速为1.0mL/min；检测波长为283nm。

29.如权利要求1所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述辛弗林含量的测定方法为：

(1)取辛弗林，加甲醇制成混合溶液，即得辛弗林对照品溶液；

(2)取小承气汤制剂，加入提取溶剂提取，制得辛弗林供试品溶液；

(3)吸取辛弗林对照品溶液、辛弗林供试品溶液，注入液相色谱仪，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，所述液相色谱仪以甲醇为流动相A，磷酸和十二烷基磺酸钠混合水溶液为流动相B进行洗脱，测定得到小承气汤中辛弗林的含量。

30.如权利要求29所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述辛弗林供试品溶液的制备方法为：

取小承气汤制剂0.2～0.5g，置于锥形瓶中，精密加入50～80％甲醇10～20mL，密塞，称定重量，以功率为200～300kW、频率为35～45kHz的超声波处理30～60分钟，放冷，再次称定重量，用50～80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

31.如权利要求29所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，磷酸和十二烷基磺酸钠混合水溶液中，磷酸的浓度为0.05～0.15vol％，十二烷基磺酸钠的浓度为0.05～0.15vol％。

32.如权利要求29所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述辛弗林含量的测定方法中，分别吸取辛弗林对照品溶液和辛弗林供试品溶液各5～10μL，注入液相色谱仪进行检测，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱温为28～32℃；所述液相色谱仪以甲醇为流动相A，以磷酸和十二烷基磺酸钠混合水溶液为流动相B；流速为0.9～1.1mL/min；检测波长为220～254nm。

33.如权利要求32所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述辛弗林含量的测定方法中，分别吸取辛弗林对照品溶液和辛弗林供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪进行检测，所述液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其柱长为150mm，内径为4.6mm，粒径为5.0μm，柱温为30℃；所述液相色谱仪以甲醇为流动相A，以磷酸和十二烷基磺酸钠混合水溶液为流动相B；流速为1.0mL/min；检测波长为224nm；

其中，所述磷酸和十二烷基磺酸钠混合水溶液中，磷酸的浓度为0.1vol％，十二烷基磺酸钠的浓度为0.1vol％；洗脱过程中，流动相A与流动相B的体积比为45:55。

34.如权利要求1所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，还包括：

(4)将小承气汤蒸干，测定其出膏率；

(5)测定小承气汤的浸出物。

35.如权利要求1所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述小承气汤由以下重量份的组分组成：生大黄55.2份，姜厚朴27.6份，麸炒枳实36份。

36.如权利要求1所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述小承气汤的制备方法为：取大黄、厚朴和枳实，加500～1200mL水浸泡，武火煮沸，文火沸腾至药液为200～300mL，滤过即得。

37.如权利要求36所述的小承气汤物质基准的建立方法，其特征在于，所述小承气汤的制备方法为：取生大黄55.2g、姜厚朴27.6g和麸炒枳实27.6g，加800mL水浸泡，武火煮沸，文火沸腾至药液为240mL，滤过即得。

Images