CN115436524B - 温经汤方中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的检测方法及其用途 - Google Patents

温经汤方中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的检测方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及药物检测技术领域，具体涉及温经汤方中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的检测方法及其用途。本发明提供的温经汤方中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的检测方法，在制备供试品溶液的过程中，在碱洗所得的第三中间液中加入酸性溶液以调节第三中间液的pH值，避免因经过碱洗的供试品溶液的pH值过高而导致色谱柱的耐用性差、柱效过快降低、频换更换，因此，本发明的方法能够显著提升色谱柱的耐用性，降低色谱柱的柱效下降速率，进而降低色谱柱的更换频率。

Description

温经汤方中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的检测方法及其用途
技术领域
本发明涉及药物检测技术领域，具体涉及温经汤方中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的检测方法及其用途。
背景技术
温经汤为经典名方，载于宋代《妇人大全良方》(宋·陈自明)，原文记载：“若经道不通，绕脐寒疝痛彻，其脉沉紧。此由寒气客于血室，血凝不行，结积血为气所冲，新血与故血相搏，所以发痛。譬如天寒地冻，水凝成冰。宜温经汤及桂枝桃仁汤、万病丸。”温经汤处方由当归、川芎、芍药、桂心、牡丹皮、莪术各半两，人参、甘草、牛膝各一两组成，功效为温经散寒，活血调经，主治月经后期、过少，闭经，痛经。方中桂心温经散寒，通脉调经；人参甘温补气，助桂心通阳散寒；当归、川芎活血养血调经；莪术、丹皮、牛膝活血祛瘀，助当归、川芎通行血滞；芍药、甘草缓急止痛；全方温经散寒，活血调经。
温经汤处方中人参的质量控制主要通过测定处方中人参皂苷Rg1、Re、Rb1来完成。然而，相关技术中在对温经汤处方中人参皂苷Rg1、Re、Rb1的含量进行测定时，存在色谱柱耐用性较差的问题。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中对温经汤方中人参皂苷Rg1、Re、Rb1的含量进行测定时，色谱柱耐用性较差的缺陷，从而提供一种温经汤方中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的检测方法及其用途。
为此，本发明提供了一种温经汤方中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的检测方法，采用高效液相色谱法进行检测，检测时所采用的供试品溶液的制备过程包括：
1)取供试品，利用醇类溶剂提取，提取液蒸干，得第一残渣；
2)加水溶解所述第一残渣，所得残渣水溶液利用低极性有机溶剂进行第一萃取，取水层，得第一中间液；
3)利用水饱和的正丁醇溶液对所述第一中间液进行第二萃取，取正丁醇层，得第二中间液；
4)利用强碱溶液对所述第二中间液进行洗涤，取正丁醇层，得第三中间液；
5)向所述第三中间液中加入酸性溶液，蒸干，所得第二残渣加醇类溶剂溶解。
可选的，所述醇类溶剂选自甲醇、乙醇、体积百分比不低于70％的甲醇水溶液和体积百分比不低于70％的乙醇水溶液中的至少一种；
可选的，操作1)中，所述提取为超声提取，超声时间为30～90min；相对于1g的所述供试品，所述醇类溶剂的用量为25～200mL；
可选的，操作2)中加水溶解所述第一残渣时，水与所述第一残渣对应的所述提取液的体积比为1:(1～3)。
可选的，操作2)中所述第一萃取的次数为1～3次，单次第一萃取时，所述低极性有机溶剂与所述残渣水溶液的体积比为1:(1～3)；
可选的，所述第一萃取为摇床振摇萃取，单次第一萃取时间的为1～4min；
可选的，所述低极性有机溶剂选自乙醚、氯仿和石油醚中的至少一种。
可选的，操作3)中所述第二萃取的次数为2～4次，单次第二萃取时，所述水饱和的正丁醇溶液与所述第一中间液的体积比为(1～3):1；
可选的，所述第二萃取为摇床振摇萃取，单次第二萃取的时间为1～4min。
可选的，操作4)中在利用强碱溶液对所述第二中间液进行洗涤时，洗涤次数为1～4次，单次洗涤时，所述强碱溶液与所述第二中间液的体积比为1:(1～3)；
可选的，所述强碱溶液为氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液；所述强碱溶液中，强碱的质量分数为0.1％～5％。
可选的，操作4)中利用强碱溶液对所述第二中间液进行洗涤后，所述检测方法还包括：
取强碱溶液层，利用水饱和的正丁醇溶液进行第三萃取，取正丁醇层，与所述第二萃取的正丁醇层合并，得所述第三中间液；
可选的，所述第三萃取的次数为1～3次，单次第三萃取时，所述水饱和的正丁醇溶液与所述强碱溶液层的体积比为1:(1～3)。
可选的，操作5)中向所述第三中间液中加入酸性溶液，调节所述第三中间液的pH值为7.5～10；
可选的，所述酸性溶液选自冰醋酸溶液和/或甲酸溶液；所述酸性溶液中，酸的质量分数为0.1～5％。
可选的，所述高效液相色谱法的检测条件包括如下条件中的至少一项：
(1)色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，柱长为150mm，内径为4.6mm，粒径为2.7μm；色谱柱优选为CAPCELL CORE C18柱；
(2)以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0～21min，流动相中乙腈的体积百分比为18％；21～30min，流动相中乙腈的体积百分比为18％→20％；30～35min，流动相中乙腈的体积百分比为20％；35～40min，流动相中乙腈的体积百分比为20％→28％；40～56min，流动相中乙腈的体积百分比为28％→29％；56～60min，流动相中乙腈的体积百分比为29％；
(3)柱温为25～35℃；
(4)流速为0.5～1.0mL/min；
(5)检测波长为200～210nm；
(6)进样量为2～10μl。
可选的，所述梯度洗脱程序还可以包括：60～64min，流动相中乙腈的体积百分比为29％→80％；64～68min，流动相中乙腈的体积百分比为80％；68～75min，流动相中乙腈的体积百分比为80％→18％；75～80min，流动相中乙腈的体积百分比为18％。
可选的，所述供试品包括温经汤复方制剂的成品、温经汤复方制剂的中间品或者温经汤方的基准样品，所述温经汤复方制剂包括温经汤颗粒；
可选的，所述温经汤方包括如下重量份的原料：
1～2重量份当归、1～2重量份川芎、1～2重量份芍药、1～2重量份桂心、1～2重量份牡丹皮、1～2重量份莪术、1～2重量份人参、1～2重量份甘草、1～2重量份牛膝。
本发明还提供了上述所述的检测方法在温经汤复方制剂质量控制中的用途。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的温经汤方中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的检测方法，在制备供试品溶液的过程中，在碱洗所得的第三中间液中加入酸性溶液以调节第三中间液的pH值，避免因经过碱洗的供试品溶液的pH值过高而导致色谱柱的耐用性差、柱效过快降低、频繁更换，因此，本发明的方法能够显著提升色谱柱的耐用性，降低色谱柱的柱效下降速率，进而降低色谱柱的更换频率。
2.本发明提供的温经汤方中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的检测方法，在制备供试品溶液的过程中，在碱洗结束后，利用水饱和的正丁醇溶液对强碱溶液层进行萃取，能够有效回收碱洗过程中流失的人参皂苷，这一方面能够显著提升检测结果的准确性，另一方面能够有效提升检测方法在不同检测系统、不同实验室、不是操作人员以及不同实验次数中的重现性。
3.本发明提供的温经汤方中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的检测方法，在制备供试品溶液的过程中，第一萃取和第二萃取均为摇床振摇萃取，能够显著减少第一萃取和第二萃取过程中的乳化现象，这能够进一步提升检测结果的准确性、重现性和平行性。
4.本发明提供的温经汤方中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的检测方法，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，选用特定的色谱柱和洗脱程序，不仅检测基线平稳，而且能够在较短的时间内实现人参皂苷的良好分离，特别地，能够在60分钟以内实现分离，人参皂苷Rg1和Re的分离度可达2.5，且阴性无干扰；此外，该方法洗脱时间短，具有较强的可操作性；流动相为乙腈-水，毒性小，对检测系统的腐蚀性小，对色谱柱的损伤小；同时，方法稳定、专属性强、线性好、精密度高、耐用性强、重现性较好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1的检测结果图；
图2是本发明实施例2中专属性验证结果图；
图3是本发明实施例3的检测结果图；
图4是本发明实施例4中专属性验证结果图；
图5是本发明实施例4中人参皂苷Rg1的线性回归曲线图；
图6是本发明实施例4中人参皂苷Re的线性回归曲线图；
图7是本发明实施例4中人参皂苷Rb1的线性回归曲线图；
图8是本发明实施例8中利用WatersHSS T3(250×4.6mm，5μm)检测得到的色谱图；
图9是本发明实施例8中利用WatersHSS T3(150×4.6mm，2.5μm)检测得到的色谱图；
图10是本发明实施例8中利用CAPCELL CORE C18(150×4.6mm，2.7μm)检测得到的色谱图；
图11是本发明实施例9中使用第一天时色谱柱柱效示意图；
图12是本发明实施例9中使用第35天时色谱柱柱效示意图；
图13是本发明对比例中使用第一天时色谱柱柱效示意图；
图14是本发明对比例中使用第八天时色谱柱柱效示意图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例中涉及的仪器、试药及试剂如下所示：
仪器：Waters e2695、waters Acouity Arc、Thermo Ultimate 3000、Agilent1260。
试药：人参皂苷Rg1对照品(来源：中国食品药品检定研究院，批号110703-202034，纯度94％)，人参皂苷Re对照品(来源：中国食品药品检定研究院，批号110754-202129，纯度96.0％)，人参皂苷Rb1对照品(来源：中国食品药品检定研究院，批号110704-202129，纯度94.3％)。
温经汤基准样品的制备方法如下：按照肉桂1重量份、炒甘草2重量份、酒牛膝2重量份、人参2重量份、白芍1重量份、醋莪术1重量份、酒当归1重量份、川芎1重量份、牡丹皮1重量份，取温经汤各药味，粉碎成1-5mm的粗颗粒，每服20g，加水450ml，浸泡30分钟，以加热板(一枚王)武火500W煮沸，300W文火煎煮至240ml，预冻12h以上，冷冻干燥3～5天，即得。
温经汤颗粒的制备方法如下：按照肉桂1重量份、炒甘草2重量份、酒牛膝2重量份、人参2重量份、白芍1重量份、醋莪术1重量份、酒当归1重量份、川芎1重量份、牡丹皮1重量份，取温经汤各药味，依次投入提取罐中，加水提取两次，同时收集挥发油，水提液进行浓缩、干燥，挥发油加入倍他环糊精包合，两者混合、制粒即得。
实施例1
温经汤基准样品中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的测定，包括：
(1)供试品溶液的制备：
①取温经汤基准样品约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，得第一残渣；
②第一残渣加水25ml使溶解，所得残渣水溶液用乙醚振摇(摇床，每次振摇2分钟)进行第一萃取2次，单次第一萃取使用乙醚20ml，弃去乙醚层，取水层，得第一中间液；
③第一中间液利用水饱和的正丁醇溶液振摇(摇床，每次振摇2分钟)进行第二萃取3次，单次第二萃取使用水饱和的正丁醇溶液30ml，合并3次第二萃取的正丁醇层，得第二中间液；
④第二中间液利用质量分数为1％的氢氧化钠溶液洗涤2次，单次洗涤使用氢氧化钠溶液30ml，分取正丁醇层，合并氢氧化钠溶液层；氢氧化钠溶液层再用水饱和的正丁醇溶液振摇进行第三萃取2次，单次第三萃取使用水饱和的正丁醇溶液30ml，合并2次洗涤及2次第三萃取的正丁醇层，得第三中间液；
⑤向第三中间液中加入质量分数为0.4％的冰醋酸溶液4ml，调节第三中间液的pH值为8-10，然后蒸干第三中间液，所得第二残渣加甲醇使溶解，并转移至10ml量瓶中，继续用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
(2)对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品适量，精密称定，置于同一50ml容量瓶中，加甲醇制成每1ml中含人参皂苷Rg1 54μg、人参皂苷Re 51μg、人参皂苷Rb1 82μg的溶液，即得对照品溶液。
(3)高效液相色谱法检测：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入高效液相色谱仪，按照如下的色谱条件进行测定，即得。
色谱柱为CAPCELL CORE C18柱(4.6×150mm，2.7μm)；流动相为乙腈(A)-水(B)；柱温为30℃；检测波长为为203nm；流速为0.7mL/min；按照表1进行梯度洗脱。
表1实施例1梯度洗脱表
检测结果如图1所示，图1是对照品溶液(下)与供试品溶液(上)的图谱对比图，如图1所示，供试品图谱与对照品图谱在相同位置出现相同的特征峰，且供试品图谱中人参皂苷Rg1峰、人参皂苷Re峰和人参皂苷Rb1峰之间存在良好分离，人参皂苷Rg1峰、人参皂苷Re峰和人参皂苷Rb1峰附近无杂峰，经计算，本实施例所使用的温经汤基准样品中，人参皂苷Rg1的含量为1.06mg/g，人参皂苷Re的含量为1.01mg/g，人参皂苷Rb1的含量为1.64mg/g。
实施例2
本实施例基于温经汤基准样品对本发明的检测方法进行方法学验证：
(1)专属性验证
取温经汤基准样品按照实施例1操作(1)的方法制备供试品溶液，按照实施例1操作(2)的方法制备对照品溶液，以空白溶剂甲醇为空白对照，以不添加人参药材制备的温经汤基准样品为阴性样品，并按照实施例1操作(1)的方法制备阴性对照，按照实施例1操作(3)的方法分别对上述各溶液进行检测，检测结果如图2所示。
在图2中，从下至上依次为空白对照图谱、阴性对照图谱、对照品图谱和供试品图谱，由图2可以看出，空白对照图谱以及阴性对照图谱中不存在与对照品色谱峰对应的色谱峰，这说明上述空白对照和阴性对照对人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的测定无干扰，本发明方法测定温经汤基准样品的专属性良好。
(2)系统适用性验证
按照实施例1操作(2)的方法制备对照品溶液，按照实施例1操作(3)的方法连续进样5针，获得检测图谱，分别记录每次进样后的人参皂苷Rg1峰、人参皂苷Re峰和人参皂苷Rb1峰的峰面积，并计算RSD值，结果如表2所示。
表2系统适应性验证结果
进样次数 Rg1峰面积 Re峰面积 Rb1面积
1 122619 237145 255340
2 122654 236844 256007
3 123250 236859 255159
4 123090 236702 255264
5 122533 236712 255308
RSD值 0.26％ 0.08％ 0.13％
由表2可以看出，在利用同一对照品溶液重复进样5针的情况下，检测得到的人参皂苷Rg1峰、人参皂苷Re峰和人参皂苷Rb1峰的峰面积的RSD值分别为0.26％、0.08％和0.13％，本发明方法测定温经汤基准样品的系统适用性符合要求。
(3)重复性验证
取温经汤基准样品6份，分别按照实施例1操作(1)的方法制备成供试品溶液，按照施例1操作(3)的方法分别对各供试品溶液进行检测，并计算每次检测时人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量，以及6次重复检测过程中三种成分含量的RSD值，结果如表3所示。
表3重复性验证结果
由表3可以看出，6份样品，人参皂苷Rg1含量均值为1.0635mg/g，RSD为1.29％，人参皂苷Re含量均值为1.0124mg/g，RSD为1.38％，人参皂苷Rb1含量均值为1.6406mg/g，RSD为1.80％，本发明方法测定温经汤基准样品的重复性良好。
(4)准确度验证
精密称取人参皂苷Rg1对照品(纯度94.00％)5.899mg、人参皂苷Re对照品(纯度96.00％)5.338mg、人参皂苷Rb1对照品(纯度94.30％)9.003mg，置于500ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得加标溶液。
取重复性项下已知含量的温经汤基准样品(人参皂苷Rg1含量为1.0635mg/g，人参皂苷Re含量为1.0124mg/g，人参皂苷Rb1含量为1.6406mg/g)6份，每份约0.5g，精密称定，分别利用加标溶液50ml替换实施例1操作(1)第①步骤中的甲醇后，按照实施例1操作(1)的方法制备成供试品溶液，按照实施例1操作(3)的方法分别对各供试品溶液进行检测。，按照下式计算三种人参皂苷回收率，结果见表4-表6。
表4人参皂苷Rg1回收率测试结果
表5人参皂苷Re回收率测试结果
表6人参皂苷Rb1回收率测试结果
由表4-表6可以看出，人参皂苷Rg1的回收率均值103.9％，RSD为1.53％；人参皂苷Re的回收率均值102.8％，RSD为1.84％；人参皂苷Rb1的回收率均值96.1％，RSD为2.25％，本发明方法测定温经汤基准样品的准确度良好。
(5)中间精密度验证
不同分析人员在不同时间、在waters(Arc)和Agilent仪器上进行中间精密度实验。取温经汤基准样品12份，分别按照实施例1操作(1)的方法制备成供试品溶液，按照施例1操作(3)的方法分别对各供试品溶液进行检测，并计算每次检测时人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量，以及12份样品中三种成分含量的RSD值，结果如表7所示。
表7中间精密度验证结果
由表7可以看出，12份样品，人参皂苷Rg1含量均值为1.074mg/g，RSD为1.91％，人参皂苷Re含量均值为1.019mg/g，RSD为1.60％，人参皂苷Rb1含量均值为1.670mg/g，RSD为2.44％，本发明方法测定温经汤基准样品的中间精密度良好。
(6)稳定性验证
取温经汤基准样品，按照实施例1操作(1)的方法制备成供试品溶液，分别于室温下放置0h、10h、20h、30h、40h和50h时，按照施例1操作(3)的方法分别对各供试品溶液进行检测，分别记录每次检测时人参皂苷Rg1峰、人参皂苷Re峰和人参皂苷Rb1峰的峰面积，并计算RSD值，结果如表8所示。
表8稳定性验证结果
放置时间 Rg1峰面积 Re峰面积 Rb1面积
0h 266342 453294 484966
10h 271449 458325 491856
20h 269059 458098 489152
30h 270262 460633 492779
40h 263776 451137 483702
50h 261807 447417 481305
RSD值 1.42％ 1.11％ 0.96％
由表8可以看出，供试品溶液在室温、不避光的储存条件下，50小时内稳定性良好。
(7)耐用性考察
1)流速考察
取温经汤基准样品，按照实施例1中操作(1)的方法制备供试品溶液，分别在流速0.6mL/min、0.7mL/min、0.8mL/min下，按照实施例1中操作(3)的方法分别进行高效液相色谱检测，考察实验方法对不同流速的耐用性，分别计算每种流速下人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量，以及含量测定结果与重复性验证项下检测结果的偏差，结果如表9所示。
表9耐用性流速考察结果
由表9可以看出，在流速为0.7ml/min±0.1ml/min的范围内，供试品含量的检测结果与重复性验证项下检测结果的偏差不大于3％，本发明方法测定温经汤基准样品时对流速的耐用性良好。
2)柱温考察
取温经汤基准样品，按照实施例1中操作(1)的方法制备供试品溶液，分别在柱温29℃、30℃、31℃下，按照实施例1中操作(3)的方法进行高效液相色谱检测，考察实验方法对不同柱温的耐用性，分别计算每种柱温下人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量，以及含量测定结果与重复性验证项下检测结果的偏差，结果如表10所示。
表10耐用性柱温考察结果
由表10可以看出，在柱温为30℃±1℃的范围内，供试品含量的检测结果与重复性验证项下检测结果的偏差不大于3％，本发明方法测定温经汤基准样品时对柱温的耐用性良好。
3)流动相梯度考察
取温经汤基准样品，按照实施例1中操作(1)的方法制备供试品溶液，分别按照表11、表1、表12的梯度洗脱表，参照实施例1中操作(3)的方法进行高效液相色谱检测，考察实验方法对不同流动相梯度的耐用性，分别计算每种流动相梯度下人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量，以及含量测定结果与重复性验证项下检测结果的偏差，结果如表13所示。
表11流动相梯度考察梯度洗脱表
表12流动相梯度考察梯度洗脱表
表13耐用性流动相梯度考察结果
由表13可以看出，在流动相梯度在±1％范围内波动时，供试品含量的检测结果与重复性验证项下检测结果的偏差不大于5％，本发明方法测定温经汤基准样品时对流动相梯度变化的耐用性较好。
实施例3
温经汤颗粒(批号：220201，华润三九医药股份有限公司)中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的测定，包括：
(1)供试品溶液的制备：取颗粒约1.5g，其余操作同实施例1操作(1)。
(2)对照品溶液的制备：同实施例1操作(2)。
(3)高效液相色谱法检测：同实施例1操作(3)。
检测结果如图3所示，图3是对照品溶液(下)与供试品溶液(上)的图谱对比图，如图3所示，供试品图谱与对照品图谱在相同位置出现相同的特征峰，且供试品图谱中人参皂苷Rg1峰、人参皂苷Re峰和人参皂苷Rb1峰之间存在良好分离，人参皂苷Rg1峰、人参皂苷Re峰和人参皂苷Rb1峰附近无杂峰，经计算，本实施例所使用的温经汤颗粒中，人参皂苷Rg1的含量为0.4953mg/g，人参皂苷Re的含量为0.6276mg/g，人参皂苷Rb1的含量为1.0384mg/g。
实施例4
本实施例基于温经汤颗粒(批号：220201，华润三九医药股份有限公司)对本发明的检测方法进行方法学验证：
(1)专属性验证
取温经汤颗粒按照实施例3操作(1)的方法制备供试品溶液，按照实施例3操作(2)的方法制备对照品溶液，以空白溶剂甲醇为空白对照，以不添加人参药材制备的温经汤颗粒为阴性样品，并按照实施例3操作(1)的方法制备阴性对照，按照实施例3操作(3)的方法分别对上述各溶液进行检测，检测结果如图4所示。
在图4中，从下至上依次为空白对照图谱、阴性对照图谱、对照品图谱和供试品图谱，由图4可以看出，空白对照图谱以及阴性对照图谱中不存在与对照品色谱峰对应的色谱峰，且供试品中色谱峰与对照品峰保留时间一致，这说明上述空白对照和阴性对照对人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的测定无干扰，本发明方法测定温经汤颗粒的专属性良好。
(2)线性与范围考察
精密称取人参皂苷Rg1对照品(纯度94.0％)14.482mg、人参皂苷Re对照品(纯度96.0％)28.749mg、人参皂苷Rb1对照品(纯度94.3％)36.601mg，置于50ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，溶解，混合均匀，制成混合对照品溶液⑥。分别精密量取混合对照品溶液⑥3ml置5ml量瓶中，2ml置10ml量瓶中量瓶中，2ml置20ml，5ml置100ml量瓶中，2ml置100ml量瓶中，依次分别加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液⑤、④、③、②和①。取上述各浓度对照品溶液，按照实施例3操作(3)的方法进行检测，分别记录每次进样的后人参皂苷Rg1峰、人参皂苷Re峰和人参皂苷Rb1峰的峰面积。以各对照品色谱峰的峰面积为纵坐标，各对照品浓度为横坐标，观察是否呈线性，以最小二乘法进行线性回归，求得人参皂苷Rg1在在浓度5.45～272.26μg/ml范围内的线性回归方程为：y＝4969.9x-3481.1(r2＝1)；人参皂苷Re在浓度11.04～551.98μg/ml范围内的线性回归方程为：y＝4145.9x-3362.3(r2＝1)；人参皂苷Rb1在浓度为13.81～690.29μg/ml范围内的线性回归方程为：y＝3537.4x-1343.2(r2＝1)。检测结果见表14-16，以及图5-图7，其中，图5为人参皂苷Rg1的线性回归曲线图，图6为人参皂苷Re的线性回归曲线图，图7为人参皂苷Rb1的线性回归曲线图。
表14人参皂苷Rg1线性检测结果
编号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥
浓度(μg/ml) 5.45 13.61 27.23 54.45 163.36 272.26
峰面积 21432 63377 132049 269059 811278 1347577
表15人参皂苷Re线性检测结果
编号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥
浓度(μg/ml) 11.04 27.6 55.2 110.4 331.19 551.98
峰面积 41064 107761 223321 458098 1378218 2279632
表16人参皂苷Rb1线性检测结果
编号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥
浓度(μg/ml) 13.81 34.51 69.03 138.06 414.18 690.29
峰面积 46690 117403 241345 489152 1472821 2434974
(3)重复性验证
取温经汤颗粒6份，分别按照实施例3操作(1)的方法制备成供试品溶液，按照实施例3操作(3)的方法分别对各供试品溶液进行检测，并计算每次检测时人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量，以及6次重复检测过程中三种成分含量的RSD值，结果如表17所示。
表17重复性验证结果
Rg1含量，mg/g Re含量，mg/g Rb1含量，mg/g
重复性1 0.4865 0.6148 1.0103
重复性2 0.4975 0.6283 1.0554
重复性3 0.4955 0.6286 1.0301
重复性4 0.4919 0.6230 1.0340
重复性5 0.5074 0.6453 1.0672
重复性6 0.4929 0.6254 1.0333
均值 0.4953 0.6276 1.0384
RSD值 1.42％ 1.60％ 1.94％
由表17可以看出，平行制备的6份供试品测得的人参皂苷Rg1含量RSD值为1.42％，人参皂苷Re含量RSD值为1.60％，人参皂苷Rb1含量RSD值为1.94％，本发明方法测定温经汤颗粒的重复性良好。
(4)准确度验证
精密称取人参皂苷Rg1对照品(纯度94.00％)4.048mg、人参皂苷Re对照品(纯度96.00％)5.023mg、人参皂苷Rb1对照品(纯度94.30％)7.973mg，置于500ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，溶解，混合均匀，即得加标对照品溶液。
取重复性项下已知含量的温经汤颗粒(人参皂苷Rg1含量为0.4953mg/g，人参皂苷Re含量为0.6276mg/g，人参皂苷Rb1含量为1.0384mg/g)6份，每份约0.75g，精密称定，分别精密加入加标对照品溶液50ml，按照实施例3操作(3)的方法分别对各供试品溶液进行检测，按照下式计算人参皂苷回收率，结果见表18-表20。
表18人参皂苷Rg1回收率测试结果
表19人参皂苷Re回收率测试结果
表20人参皂苷Rb1回收率测试结果
由表18-表20可以看出，人参皂苷Rg1回收率在99.86％～101.93％，平均回收率为100.83％，RSD值为0.68％；人参皂苷Re回收率在96.86％～100.57％，平均回收率为99.09％，RSD值为1.39％；人参皂苷Rb1回收率在92.80％～96.67％，平均回收率为94.32％，RSD值为1.47％，本发明方法测定温经汤颗粒的准确度良好。
(5)中间精密度验证
不同分析人员在不同时间、在waters(Arc)和Agilent仪器上进行中间精密度实验。取温经汤颗粒12份，分别按照实施例3操作(1)的方法制备成供试品溶液，按照实施例3操作(3)的方法分别对各供试品溶液进行检测，并计算每次检测时人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量，以及12份样品中三种成分含量的RSD值，结果如表21所示。
表21中间精密度验证结果
Rg1含量，mg/g Re含量，mg/g Rb1含量，mg/g
精密度1 0.5000 0.6408 0.9924
精密度2 0.4917 0.6250 1.0312
精密度3 0.4897 0.6179 1.0004
精密度4 0.5075 0.6399 1.0452
精密度5 0.4815 0.6231 0.9897
精密度6 0.4758 0.6246 0.9706
精密度7 0.4865 0.6148 1.0103
精密度8 0.4975 0.6283 1.0554
精密度9 0.4955 0.6286 1.0301
精密度10 0.4919 0.6230 1.0340
精密度11 0.5074 0.6453 1.0672
精密度12 0.4929 0.6254 1.0333
均值 0.4932 0.6281 1.0217
RSD值 1.91％ 1.49％ 2.84％
由表21可以看出，12份样品，人参皂苷Rg1含量均值为0.4932mg/g，RSD为1.91％，人参皂苷Re含量均值为0.6281mg/g，RSD为1.49％，人参皂苷Rb1含量均值为1.0217mg/g，RSD为2.84％，本发明方法测定温经汤颗粒的中间精密度良好。
(6)稳定性验证
取温经汤颗粒，按照实施例3操作(1)的方法制备成供试品溶液，分别于室温下放置0h、8h、30h、48h、70h、88h、108h和128h时，按照实施例3操作(3)的方法分别对各供试品溶液进行检测，分别记录每次检测时人参皂苷Rg1峰、人参皂苷Re峰和人参皂苷Rb1峰的峰面积，并计算RSD值，结果如表22所示。
表22稳定性验证结果
放置时间 Rg1峰面积 Re峰面积 Rb1峰面积
0h 93667 101916 144174
8h 94265 102735 144710
30h 95456 103243 146589
48h 96779 105534 149064
70h 95072 103300 144796
88h 96595 104871 148009
108h 94297 102687 145486
128h 94445 103232 145427
RSD值 1.19％ 1.15％ 1.18％
由表22可以看出，供试品溶液在室温、不避光的储存条件下，128小时内稳定性良好。
(7)耐用性考察
1)流速考察
取温经汤颗粒，按照实施例3中操作(1)的方法制备供试品溶液，分别在流速0.65mL/min、0.70mL/min、0.75mL/min下，按照实施例3中操作(3)的方法分别进行高效液相色谱检测，考察实验方法对不同流速的耐用性，分别计算每种流速下人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量，并计算RSD值，结果如表23所示。
表23耐用性流速考察结果
由表23可以看出，在流速为0.7ml/min±0.05ml/min的范围内，本发明方法测定温经汤颗粒时对流速具有一定耐用性。
2)柱温考察
取温经汤颗粒，按照实施例3中操作(1)的方法制备供试品溶液，分别在柱温29℃、30℃、31℃下，按照实施例3中操作(3)的方法进行高效液相色谱检测，考察实验方法对不同柱温的耐用性，分别计算每种柱温下人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量，并计算RSD值，结果如表24所示。
表24耐用性柱温考察结果
由表24可以看出，在柱温为30℃±1℃的范围内，本发明方法测定温经汤颗粒时对柱温具有一定耐用性。
3)流动相梯度考察
取温经汤颗粒，按照实施例3中操作(1)的方法制备供试品溶液，分别按照表11、表1、表12的梯度洗脱表，参照实施例3中操作(3)的方法进行高效液相色谱检测，考察实验方法对不同流动相梯度的耐用性，分别计算每种流动相梯度下人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量，并计算RSD值，结果如表25所示。
表25耐用性流动相梯度考察结果
由表25可以看出，在流动相梯度在±1％范围内波动时，本发明方法测定温经汤颗粒时对流动相梯度变化的耐用性较好。
实施例5强碱溶液洗涤次数考察
取温经汤基准样品6份，分别按照实施例1操作(1)的方法制备供试品溶液，区别在于：其中2份在步骤④中利用质量分数为1％的氢氧化钠溶液洗涤的次数为2次，另外2份在步骤④中利用质量分数为1％的氢氧化钠溶液洗涤的次数为3次，剩下2份在步骤④中利用质量分数为1％的氢氧化钠溶液洗涤的次数为4次；6份样品在步骤④中进行第三萃取的次数均为4次。
取上述制备得到的供试品溶液，分别按照实施例1操作(3)的方法进行检测，每份供试品溶液进样2次，分别计算各供试品溶液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量及RSD值，结果如表26所示。
表26强碱溶液洗涤次数考察结果
由表26可以看出，在强碱溶液洗涤次数为2-4次的范围内，本发明的方法能够准确检测温经汤基准样品中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量。
实施例6第三萃取次数考察
取温经汤基准样品6份，分别按照实施例1操作(1)的方法制备供试品溶液，区别在于：其中2份步骤④中第三萃取的次数为2次，另外2份步骤④中第三萃取的次数为3次，剩下2份步骤④中第三萃取的次数为4次；6份样品在步骤⑤中加入的质量分数为0.4％的冰醋酸溶液的体积均为3ml。
取上述制备得到的供试品溶液，分别按照实施例1操作(3)的方法进行检测，每份供试品溶液进样2次，分别计算各供试品溶液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量及RSD值，结果如表27所示。
表27第三萃取次数考察结果
由表27可以看出，在第三萃取次数为2-4次的范围内，本发明的方法能够准确检测温经汤基准样品中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量。
实施例7酸性溶液添加量考察
取温经汤基准样品6份，分别按照实施例1操作(1)的方法制备供试品溶液，区别在于：其中2份步骤⑤中冰醋酸溶液的添加量为3ml，调节第三中间液的pH值为10.0；另外2份步骤⑤中冰醋酸溶液的添加量为4ml，调节第三中间液的pH值为9.5；剩下2份步骤⑤中冰醋酸溶液的添加量为5ml，调节第三中间液的pH值为8.7。
取上述制备得到的供试品溶液，分别按照实施例1操作(3)的方法进行检测，每份供试品溶液进样2次，分别计算各供试品溶液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量及RSD值，结果如表28所示。
表28酸性溶液添加量考察结果
由表28可以看出，在第三中间液的pH值为8.7-10的范围内，本发明的方法能够准确检测温经汤基准样品中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量。
实施例8色谱柱考察
取温经汤基准样品1份，按照实施例1中操作(1)的方法制备供试品溶液，同时以不添加人参药材制备的温经汤基准样品为阴性样品，并按照实施例1操作(1)的方法制备阴性对照，分别利用色谱柱WatersHSS T3(250×4.6mm，5μm)、Waters/>HSST3(150×4.6mm，2.5μm)和CAPCELL CORE C18(150×4.6mm，2.7μm)，按照实施例1中操作(3)的方法进行高效液相色谱检测，考察实验方法对不同色谱柱的耐用性，获得色谱图，如图8-10所示，其中，图8是利用Waters/>HSS T3(250×4.6mm，5μm)检测得到的色谱图，图9是利用Waters/>HSS T3(150×4.6mm，2.5μm)检测得到的色谱图，图10是利用CAPCELL CORE C18(150×4.6mm，2.7μm)检测得到的色谱图。
由图8-10可以看出，WatersHSS T3(250ers XS，5μm)色谱柱条件下，阴性溶液存在干扰且分析时间达到了120min，分析时间较长；Waters/>HSS T3(150×4.6mm，2.5μm)色谱柱条件下，各色谱峰分离度均良好，专属性良好，分析时间80min，适中，但由于色谱柱pH耐受范围为2-8，而供试品溶液呈碱性，故大大损耗了色谱柱的使用寿命；CAPCELL CORE C18(150CELL C，2.7μm)色谱柱条件下，各色谱峰分离度均良好，专属性良好，该色谱柱pH耐受范围为1.5-10，适用于温经汤中人参含量测定供试品溶液的分析。/>
实施例9
按照实施例1中操作(1)的方法制备供试品溶液，按照实施例1操作(3)的方法进行检测，第一天时，色谱柱柱效如图11所示；重复上述操作35天，第35天时，色谱柱柱效如图12所示。
由图11和12可以看出，连续使用35天后，以人参皂苷Rg1峰记，色谱柱理论塔板数从103115降低至70122；以人参皂苷Re峰记，色谱柱理论塔板数从118062降低至81817；以人参皂苷Rb1峰记，色谱柱理论塔板数从378168降低至221251；可见，柱效未明显降低，各峰之间分离度良好。
对比例不加醋酸色谱柱耐用性结果
按照实施例1中操作(1)的方法制备供试品溶液，区别在于步骤⑤中不添加冰醋酸溶液，直接蒸干第三中间液，所得残渣加甲醇使溶解，并转移至10ml量瓶中，继续用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
取上述制备得到的供试品溶液，按照实施例1操作(3)的方法进行检测，第一天时，色谱柱柱效如图13所示；重复上述操作1周，第八天时，色谱柱柱效如图14所示。
由图13和14可以看出，连续使用1周后，以人参皂苷Rg1峰记，色谱柱理论塔板数从95081降低至23315；以人参皂苷Re峰记，色谱柱理论塔板数从107003降低至24387；以人参皂苷Rb1峰记，色谱柱理论塔板数从382294降低至188119；可见，色谱柱柱效降低明显，人参皂苷Rg1和人参皂苷Re色谱峰峰型拖尾，分离度变差。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种温经汤方中人参皂苷Rg1、Re和Rb1的检测方法，所述温经汤方由当归、川芎、芍药、桂心、牡丹皮、莪术、人参、甘草、牛膝组成，其特征在于，采用高效液相色谱法进行检测，检测时所采用的供试品溶液的制备过程包括：
1）取供试品，利用甲醇提取，提取液蒸干，得第一残渣；
2）加水溶解所述第一残渣，所得残渣水溶液利用乙醚进行第一萃取，取水层，得第一中间液；
3）利用水饱和的正丁醇溶液对所述第一中间液进行第二萃取，取正丁醇层，得第二中间液；
4）利用强碱溶液对所述第二中间液进行洗涤，取正丁醇层，得第三中间液，所述强碱溶液为氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液；所述强碱溶液中，强碱的质量分数为0.1%～5%；
5）向所述第三中间液中加入酸性溶液，蒸干，所得第二残渣加醇类溶剂溶解，所述酸性溶液选自冰醋酸溶液和/或甲酸溶液；所述酸性溶液中，酸的质量分数为0.1～5%；
其中，所述高效液相色谱法的检测条件包括：
（1）色谱柱为CAPCELL CORE C18柱，柱长为150mm，内径为4.6mm，粒径为2.7μm；
（2）以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0～21min，流动相中乙腈的体积百分比为18%；21～30min，流动相中乙腈的体积百分比为18%→20%；30～35min，流动相中乙腈的体积百分比为20%；35～40min，流动相中乙腈的体积百分比为20%→28%；40～56min，流动相中乙腈的体积百分比为28%→29%；56～60min，流动相中乙腈的体积百分比为29%；
（3）柱温为25～35℃；
（4）流速为0.5～1.0mL/min；
（5）检测波长为200～210nm。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，操作1）中，所述提取为超声提取，相对于1g的所述供试品，所述甲醇的用量为25～200mL；
操作2）中加水溶解所述第一残渣时，水与所述第一残渣对应的所述提取液的体积比为1:（1～3）。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，操作2）中所述第一萃取的次数为1～3次，单次第一萃取时，所述乙醚与所述残渣水溶液的体积比为1:（1～3）；
所述第一萃取为摇床振摇萃取，单次第一萃取的时间为1～4min。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，操作3）中所述第二萃取的次数为2～4次，单次第二萃取时，所述水饱和的正丁醇溶液与所述第一中间液的体积比为（1～3）: 1；
所述第二萃取为摇床振摇萃取，单次第二萃取的时间为1～4min。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，操作4）中在利用强碱溶液对所述第二中间液进行洗涤时，洗涤次数为1～4次，单次洗涤时，所述强碱溶液与所述第二中间液的体积比为1:（1～3）。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，操作4）中利用强碱溶液对所述第二中间液进行洗涤后，所述检测方法还包括：
取强碱溶液层，利用水饱和的正丁醇溶液进行第三萃取，取正丁醇层，与所述第二萃取的正丁醇层合并，得所述第三中间液；
所述第三萃取的次数为1～3次，单次第三萃取时，所述水饱和的正丁醇溶液与所述强碱溶液层的体积比为1:（1～3）。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，操作5）中向所述第三中间液中加入酸性溶液，调节所述第三中间液的pH值为7.5～10。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的检测条件还包括：进样量为2～10μl。
9.根据权利要求1～7中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述供试品包括温经汤复方制剂的成品、温经汤复方制剂的中间品或者温经汤方的基准样品，所述温经汤复方制剂包括温经汤颗粒；
其中，所述温经汤方由如下重量份的原料组成：
1～2重量份当归、1～2重量份川芎、1～2重量份芍药、1～2重量份桂心、1～2重量份牡丹皮、1～2重量份莪术、1～2重量份人参、1～2重量份甘草、1～2重量份牛膝。
10.权利要求1～9中任一项所述的检测方法在温经汤复方制剂质量检测中的用途。
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