CN110455948B - 一种头痛宁胶囊指纹图谱检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种头痛宁胶囊指纹图谱检测方法，包括以下步骤：(1)头痛宁胶囊供试品溶液的制备；(2)通过HPLC色谱技术建立指纹图谱；(3)在指纹图谱基础上，测定其中5种主要特征化学成分的含量。实验证明，本发明的指纹图谱检测技术从定性和定量能够较为全面的反映头痛宁胶囊产品内在质量，为提高该药品的质量标准提供了关键技术的参考。

Description

一种头痛宁胶囊指纹图谱检测方法
技术领域
本发明涉及一种头痛宁胶囊指纹图谱检测方法，属于中成药检测分析技术领域。
背景技术
中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，是从中药物质基础的角度出发，运用现代分析检测技术，能够系统的、整体的、专属的来表征中药中所共有的以及中药的内在特征。现今《中国药典》制定的中药质量标准不仅要符合中药特色,而且运用中药指纹图谱的方法控制中草药质量已经被国际公认。中药及中药制剂均是多组分复杂的体系，为了更好的评价其质量，选取与之相适应的方法是很重要的。中药指纹图谱的建立能够全面的反映中药及中药制剂中所含的化学成分和数量，进而提高其质量及评价指标。
头痛宁胶囊是由土茯苓(360g)、天麻(270g)、何首乌(270g)、当归(180g)、防风(1800g)、全蝎(30g)6味药材进行提取加工而制成的治疗头痛的中药制剂。具有熄风涤痰、逐瘀止痛的功效,临床效果显著。该中药复方制剂已收载于《国家基本医疗保险、工伤保险和生育药品目录》(2009年版)，2009年被国家科技部认定为“国家重点新产品”，目前成为临床治疗偏头痛的中药大品种之一。但现有的质量标准WS-11211(ZD-1211)-2002，该质量标准中采用薄层色谱对防风对照药材、大黄素、当归对照药材进行定性鉴别，且含量测定对该药品中大黄素(C15H10o5)进行定量含量控制。但上述质量控制方法专属性不强、缺乏系统性，一致上述质量标准不能对其药品中内在有效成分进行有效控制。因此，迫切需要一种全面、高效、安全的质量检测方法能同时定性和定量测定及检测头痛宁胶囊的质量。鉴于中药指纹图谱技术在中成药质量控制方面的具有突出优势，本发明研究了头痛宁胶囊指纹图谱的建立方法并测定了制剂中多种主要特征成分的含量。该检测方法能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。
发明内容
本发明目的在于，提供一种头痛宁胶囊指纹图谱的建立方法。该方法能够较全面的分析头痛宁胶囊所含化学成分的种类和含量，为其质量控制提供较为整体、全面的分析和评价。
为解决以上技术问题，本发明提供了一种头痛宁胶囊HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
⑴、供试品溶液的制备：精密称取头痛宁粉末，加入甲醇水溶液为提取溶剂，密塞，称重，超声或加热回流提取，放冷，准确称重，用甲醇水溶液补足失重，得供试品溶液；
⑵、对照品溶液的制备：取天麻素、阿魏酸、落新妇苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、二苯乙烯苷对照品，精密称定，加甲醇水溶液溶解，得对照品溶液；
⑶、液相色谱条件为：色谱柱：Kromasil C18，流动相：A相为甲醇-B相为0.1％的磷酸水，其体积配比为甲醇5％～60％，0.1％的磷酸水其体积配比为95％～40％，进行梯度洗脱，二极管阵列检测器，检测柱温度：25～35℃，检测流速：0.8～1.2mL/min，进样量：5～15μL，检测波长220～290nm；
⑷、指纹图谱的建立：将头痛宁供试品溶液的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》分析，从而建立了头痛宁胶囊指纹图谱。
作为本发明的优选，所述检测方法步骤⑴供试品溶液样品的制备：精密称取头痛宁粉末，置于具塞三角瓶中，加入40％的甲醇水溶液，密塞，称重，超声提取30min，放冷，准确称重，用40％甲醇水溶液补足失重，摇匀，过滤，并用0.45μm有机微孔滤膜过滤，即得。
作为本发明的优选，所述检测方法步骤⑶中梯度洗脱比例为：梯度洗脱程序为：0-15min，5％的A和95％的B；15min-45min，5％-30％的A和95％-70％的B；45min-90min，30％-50％的A和70％-50％的B；90min-100min，50％-60％的A和50％-40％的B。
作为本发明的优选，所述检测方法步骤⑶中检测柱温度：30℃，检测流速：1mL/min，进样量：10μL；
优选的，所述检测方法步骤⑶中：检测波长为：0-40min，220nm；40-100min，290nm。
优选的，所述采用该检测方法生成的指纹图谱中共有22个共有峰，其中1号峰为天麻素，11号峰为阿魏酸，12号峰为二苯乙烯苷，15号峰为落新妇苷，21号峰为5-O-甲基维斯阿米醇苷。
优选的，所述采用该检测方法生成的指纹图谱中的色谱峰，其中以落新妇苷为参照峰，其相对保留时间分别为0.2017-0.2020、0.2567-0.2569、0.3666-0.3668、0.4296-0.4298、0.5070-0.5072、0.5201-0.5203、0.6175-0.6178、0.6985-0.6990、0.7477-0.7481、0.7867-0.7873、0.8757-0.8759、0.9188-0.9190、0.9307-0.9309、0.9675-0.9678、1.0000、1.0649-1.0653、1.0875-1.0878、1.0981-1.0984、1.1223-1.1225、1.1452-1.1454、1.2138-1.2140、1.2895-1.2897。
为了突出本发明技术方案创新性，我们将本实验过程中筛选的部分实验提供如下。
⑴、样品制备条件的优化
本实验考察了超声、回流、冷浸提取的方法，通过实验比较，结果发现超声提取后的供试品溶液所得色谱图色谱峰的数目较多、响应值较高，且该提取方法效率高，使用方便，操作简单，因此选择超声提取方法，同时对提取溶剂进行了考察，分别考察了70％乙醇、10％甲醇、40％甲醇、60％甲醇，通过实验结果发现40％甲醇提取液出峰数目较多、吸收强度好、色谱峰之间分离度较大，且该溶剂提取下可以得到天麻素，故选择40％甲醇为提取溶剂。
⑵、流动相选择及梯度比例优化
本实验对流动相进行了考察，选用不同梯度下的流动相，如甲醇-磷酸水(浓度为0.1％的磷酸水)、乙腈-磷酸水(浓度分别为0.1％的磷酸水)。当流动相为甲醇-磷酸水时，色谱峰形较好，色谱峰之间分离度大，基线较为稳定，且目标化合物之间均达到分离，峰形较佳。为了能够检测出更多共有峰，且实现其响应度高、分离度好以及缩短分析时间，并在此基础上实现多种特征成分含量测定，本发明技术方案中其流动相选用的是低比例的乙腈水，本实验前期选用乙腈水作为流动相，但天麻素出峰快，且在出峰处有其他成分干扰，为使天麻素分离度好、保留时间向后些，最终确定0-15min，流动相比例为5％的A和95％的B。由于本发明研究对象头痛宁胶囊中，其中大部分为极性较大的化合物，故流动相比例最终为60％的A和40％的B。最终经过大量实验摸索和比例调整，确定最佳流动相比例为0-15min，5％的A和95％的B；15min-45min，5％-30％的A和95％-70％的B；45min-90min，30％-50％的A和70％-50％的B；90min-100min，50％-60％的A和50％-40％的B。
⑶、特征指标成分的选择
头痛宁胶囊处方由6种中药材组成，对头痛宁胶囊化学成分的研究报道并不是很多而且一些报道大多是对单味药材中某一化合物的含量测定，如天麻素、二苯乙烯苷，该方法并不能全面、便捷的对该制剂进行综合的质量评价及控制。我们选择天麻素和阿魏酸作为含量测定指标成分，现代药理学研究天麻素和阿魏酸，具有降低外周血管阻力，增加心脑血管血流量，对脑组织均有保护作用,具有较好的镇静和安眠作用，对神经衰弱、失眠、头痛症状有缓解作用。以其作为指标成分更能体现其药品的内在质量。我们对处方中君药土茯苓中落新妇苷有效成分，以及臣药何首乌有效成分二苯乙烯苷，防风药材中的5-O-甲基维斯阿米醇苷成分。因此，初步选择该5种化合物为特征化合物，在后续研究中有查阅了其相关的化学性质，处方中药材比例等，最终确定该5种化合物为特征化合物，后期实验过程中又完美的同指纹图谱相匹配，在指纹图谱中，该5种化合物分离度、响应值均很好，且为指纹图谱中的共有峰。使该制剂在质量控制方面在定性的同时，也对其进行了定量，为头痛宁胶囊的质量控制提供了准确、简便、可靠的综合分析方法。
本发明指纹图谱检测方法的有益效果为：
①、药品质量的基本要求是“安全，有效，质量可控”，而批次之间的一致性是药品安全性和有效性的前提。目前，指纹图谱相似度评价可以对中药质量进行整体评价和确保产品质量的一致性，是一种较为成熟的技术。然而，目前头痛宁胶囊质量控制方面未见其有指纹图谱的建立及多成分化学成分的含量测定的方法。本发明建立了头痛宁胶囊的指纹图谱，保证了其批次之间质量的均一性、可控性和稳定性。经试验结果表明，本发明建立的方法精密度良好(五种待测物质RSD范围在0.12％～0.33％)，重复性良好(五种待测物质RSD范围在1.34％～1.80％)，稳定性(五种待测物质RSD范围在0.22％～3.55％)，加样回收率(五种待测物质回收率均在95.5％～98.9％，RSD均在2.0％～4.2％)，上述实验结果表明，该方法简便、准确、重复性好、灵敏度高，为头痛宁胶囊全面质量控制提供了科学依据。
②、目前，中药制剂质量控制标准在含量测定方面，大多停留在对单一化合物的测定。而中成药含中药材种类多，单一化合物的测定并不能使其达到全面、便捷的控制其质量。因此，一些研究人员会结合药效成分，进行多成分含量测定，但药效成分的确定是一个难题，还需经过大量药理实验研究，有些成分含量很低，常规分析仪器很难达到定量分析。本实验发明了一种简便、低成本、全面的分析方法，可以提升头痛宁胶囊的质量评判标准。本发明结合《中国药典》(2015版)第一部中对单味中药材的检测指标，筛选出处方中5种植物药材相对应的5种化学成分，并在指纹图谱建立条件下，实现了同时测定该5种化学成分的含量，该5种化学成分可以分别反映处方中5种植物药材的质量变化，同时参比各中药饮片购买时的检测数据，可以更好的、准确的反映制剂在生产制备过程中的变化，指导其生产工艺的提升，提升该制剂的质量控制标准。
附图说明
附图1，15批头痛宁胶囊HPLC指纹图谱叠加图；
附图2，头痛宁胶囊HPLC指纹图谱共有峰的标定图；
附图3，混合对照品溶液的HPLC色谱图；
附图4，头痛宁胶囊供试品溶液的HPLC色谱图。
具体实施方式
以下是本发明内容的具体实施例，用于阐述本申请文件中所要解决技术问题的技术方案，有助于本领域技术人员理解本发明内容，但本发明技术方案的实现并不限于这些实施例。
实施例1本发明头痛宁胶囊指纹图谱的建立及质量评价具体方案如下：
1.1仪器与材料
Agilent1260高效液相色谱仪(DAD紫外检测器，美国安捷伦公司)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；BT25S型电子分析天平，BS210S型电子分析天平(赛多利斯天平有限公司)。
天麻素对照品(批号：110807-201807，96.7％)、阿魏酸对照品(批号：1100773-201018，99.6％)、落新妇苷对照品(批号：111798-201504，93.9％)、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品(批号：222523-201811，97.4％)及二苯乙烯苷对照品(批号：110844-201814)均购自中国食品药品检定研究院；甲醇(HPLC级，Fisher)；水为超纯水；头痛宁胶囊共15批次(陕西步长制药有限公司)，批号分别为150120、150122、150130、150133、160443、161027、161030、161037、161038、190201、190203、190302、190306、190308、190312。
1.2色谱条件
色谱柱Kromasil C18(4.6mm*250mm，5μm)；流动相A为甲醇，流动相B为0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱(0～15min，5％A；15～45min，5％～30％A；45～90min，30％～50％A；90～100min，50％～60％A)；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：220nm(0～40min)、290nm(40～100min)；进样量：10μl。
1.3供试品溶液的制备
称取本品约1.0g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入40％的甲醇25ml，称定其质量，超声处理30min(500W，40kHz)，放冷并称定质量，用40％甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得。
1.4混合对照品溶液的制备
分别取天麻素、阿魏酸、落新妇苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、二苯乙烯苷的对照品适量，精密称定，加40％甲醇制成分别含161.49μg/ml、11.16μg/ml、221.60μg/ml、30.97μg/ml、85.54μg/ml的混合对照品溶液。
2方法学考察
2.1精密度试验
取头痛宁胶囊(批号160443)供试品溶液，按以上色谱条件测定，连续进样6针，记录各色谱图，以落新妇苷为参比峰，计算各共有峰相对保留时间RSD均小于1.0％，相对峰面积RSD均小于2.0％，表明该仪器精密度良好。
2.2重复性试验
取同一批供试品(批号160443)6份，按上述方法制备供试品溶液，选用上述色谱条件测定，记录色谱图，以落新妇苷为参比峰，计算各共有峰相对保留时间RSD均小于1.0％，相对峰面积RSD均小于2.0％，表明该方法重复性良好。
2.3稳定性试验
取头痛宁胶囊(批号160443)供试品溶液，于0、2、4、8、12、18h按上述色谱条件测定，记录色谱图，以落新妇苷为参比峰，计算各共有峰相对保留时间RSD均小于1.0％，相对峰面积RSD均小于2.0％，表明供试品在18h内稳定。
3头痛宁胶囊指纹图谱的建立及相似度分析
将15批头痛宁胶囊的供试品溶液进样分析，记录各色谱图，并对其色谱图进行积分处理。导入“《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)”软件进行数据分析，将S1的图谱设为参照图谱，进行多点校正和全谱峰匹配，标定出22个共有峰，得到头痛宁胶囊指纹图谱，其中1号峰(天麻素)、11号峰(阿魏酸)、12号峰(二苯乙烯苷)、15号峰(落新妇苷)、21号峰(5-O-甲基维斯阿米醇苷)，15批头痛宁胶囊色谱图与对照指纹图谱相比较，相似度均大于0.977(见表1所示)，说明头痛宁指纹图谱的监理方法可行。
表1相似度结果
Figure BDA0002163323100000071
4头痛宁胶囊中化学成分含量测定
4.1精密吸取上述配制的混合对照品溶液1、4、8、12、16、20μL，按照以上色谱条件进样分析，并记录色谱图。绘制得到各化学成分的标准曲线，结果见表2。
表2各对照品标准曲线
Figure BDA0002163323100000081
4.2精密度试验
精密吸取上述混合对照品溶液10μL，按照色谱条件进样分析，重复进样6次，并记录色谱图。分别计算天麻素、阿魏酸、落新妇苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、二苯乙烯苷的峰面积RSD值，分别为0.33％，0.33％，0.18％，0.12％，0.32％，结果说明仪器精密度良好。
4.3重复性试验
取同一批供试品(批号160443)6份，按上述方法制备供试品溶液，进样分析，记录相应峰的峰面积，天麻素、阿魏酸、落新妇苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、二苯乙烯苷RSD％分别为1.37，1.63，1.34，1.57，1.80，结果说明该方法重复性好。
4.4稳定性试验
取供试品(批号160443)，按上述方法制备供试品溶液，分别于0，4，8，12h进样测定，记录各指标成分峰面积的RSD％值分别为0.44，3.55，0.31，0.22，0.50，结果说明供试品溶液在12h内稳定。
4.5加样回收率试验
取已知含量的头痛宁胶囊(批号20190205)6份，每份均精密称取约0.5g，分别置于150mL具塞三角瓶中，每份精密加入天麻素对照品溶液(1.2774mg/mL)1.0mL、阿魏酸对照品溶液(0.1006mg/mL)0.5mL、落新妇苷对照品溶液(1.0902mg/mL)1.0mL、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品溶液(0.5698mg/mL)1.0mL、二苯乙烯苷对照品溶液(0.7316mg/mL)0.5mL，按上述方法制备供试品溶液，进样分析，记录色谱图，计算各化合物的加样回收率及RSD值，见表3。结果天麻素、阿魏酸、落新妇苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、二苯乙烯苷的平均加样回收率分别为95.9％、95.5％、98.9％、98.7％、97.0％，RSD分别为3.8％、2.0％、4.2％、2.5％、3.3％。
表3加样回收率结果(n＝6)
Figure BDA0002163323100000091
Figure BDA0002163323100000101
4.6含量测定
取15批的头痛宁胶囊按上述方法制备供试品溶液，进样分析，记录其色谱图，结果见表4。
表4头痛宁胶囊15批含量测定结果(mg/g)
Figure BDA0002163323100000102
Figure BDA0002163323100000111
以上的实验结果表明，该方法稳定性可靠，可作为控制本发明头痛宁胶囊的内在质量检测方法。
最后应说明的是：本发明并不局限于上述的具体实施方案，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下，但凡在本发明的精神和实质范围内，所作的任何改变、等同替换和改进，均在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种头痛宁胶囊指纹图谱检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
⑴、供试品溶液的制备：精密称取头痛宁粉末，加入甲醇水溶液为提取溶剂，密塞，称重，超声或加热回流提取，放冷，准确称重，用甲醇水溶液补足失重，得供试品溶液；
⑵、对照品溶液的制备：取天麻素、阿魏酸、落新妇苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、二苯乙烯苷对照品，精密称定，加甲醇水溶液溶解，得对照品溶液；
⑶、液相色谱条件为：色谱柱：Kromasil C18，流动相：A相为甲醇-B相为0.1％的磷酸水，其体积配比为甲醇5％～60％，0.1％的磷酸水其体积配比为95％～40％，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0-15min，5％的A和95％的B；15min-45min，5％-30％的A和95％-70％的B；45min-90min，30％-50％的A和70％-50％的B；90min-100min，50％-60％的A和50％-40％的B，二极管阵列检测器，检测柱温度：25～35℃，检测流速：0.8～1.2mL/min，进样量：5～15μL，检测波长220～290nm；
⑷、指纹图谱的建立：将头痛宁供试品溶液的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》分析，从而建立了头痛宁胶囊指纹图谱。
2.如权利要求1所述指纹图谱检测方法，其特征在于：所述检测方法步骤⑴供试品溶液样品的制备：精密称取头痛宁粉末，置于具塞三角瓶中，加入40％的甲醇水溶液，密塞，称重，超声提取30min，放冷，准确称重，用40％甲醇水溶液补足失重，摇匀，过滤，并用0.45μm有机微孔滤膜过滤，即得。
3.如权利要求1所述指纹图谱检测方法，其特征在于：所述检测方法步骤⑶中检测柱温度：30℃，检测流速：1mL/min，进样量：10μL；
4.如权利要求1所述指纹图谱检测方法，其特征在于：所述检测方法步骤⑶中：检测波长为：0-40min，220nm；40-100min，290nm。
5.如权利要求1所述指纹图谱检测方法，其特征在于：采用该检测方法生成的指纹图谱中共有22个共有峰，其中1号峰为天麻素，11号峰为阿魏酸，12号峰为二苯乙烯苷，15号峰为落新妇苷，21号峰为5-O-甲基维斯阿米醇苷。
6.如权利要求1所述指纹图谱检测方法，其特征在于：采用该检测方法生成的指纹图谱中的色谱峰，其中以落新妇苷为参照峰，其相对保留时间分别为0.2017-0.2020、0.2567-0.2569、0.3666-0.3668、0.4296-0.4298、0.5070-0.5072、0.5201-0.5203、0.6175-0.6178、0.6985-0.6990、0.7477-0.7481、0.7867-0.7873、0.8757-0.8759、0.9188-0.9190、0.9307-0.9309、0.9675-0.9678、1.0000、1.0649-1.0653、1.0875-1.0878、1.0981-1.0984、1.1223-1.1225、1.1452-1.1454、1.2138-1.2140、1.2895-1.2897。
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