CN114062536B - 舒气丸高效液相色谱指纹图谱的建立方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了舒气丸高效液相色谱指纹图谱的建立方法，属于药物分析技术领域。舒气丸高效液相色谱指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：(1)供试品溶液的制备；(2)对照品溶液的制备；(3)对照药材溶液的制备；(4)高效液相色谱测定：分别取适量供试品溶液、对照品溶液及对照药材溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图；将供试品溶液的高效液相色谱图进行分析，得到舒气丸的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。该方法具有化合物分离度高、重复性好的优点，使用该方法提供的指纹图谱对舒气丸中的特征化合物进行测定，能够有效地表征和全面监控舒气丸的质量。

Description

舒气丸高效液相色谱指纹图谱的建立方法
技术领域
本申请涉及舒气丸高效液相色谱指纹图谱的建立方法，属于药物分析技术领域。
背景技术
舒气丸收载于卫生部药品标准中药成方制剂第二册：WS3-B-0436-90，其由大黄120g、青皮(醋炒)10g、槟榔120g、苍术(米泔水炒)10g、陈皮20g、香附(醋炒)120g、川芎10g、厚朴(姜制)20g、麦芽(炒)20g、莱菔子(炒)10g、山楂(炒)80g、枳实(麸炒)20g、三棱(醋炒)20g、六神曲(麸炒)40g、莪术(醋煮)20g、牵牛子(炒)240g、木香20g、枳壳(麸炒)20g、五灵脂(醋炒)120g等19味中药材组成，具有消气破滞，理气止痛的功效，用于胃肠积滞，胸闷脘痛，脘腹胀痛，呕恶便秘等症状。
舒气丸药味繁多，化学成分复杂，质量控制研究较少，标准中记载的舒气丸仅以性状及丸剂项下检查进行质量控制，质量标准较低，不能全面反映舒气丸的内在质量，不能保证对舒气丸的质量进行全面的控制。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了舒气丸高效液相色谱指纹图谱的建立方法，该方法具有化合物分离度高、重复性好的优点，使用该方法提供的指纹图谱对舒气丸中的特征化合物进行测定，能够有效地表征和全面监控舒气丸的质量。
本发明所述舒气丸高效液相色谱指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：
取一定重量的舒气丸置于容器中，加入适量甲醇进行提取，冷却，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：
取一定重量的大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄酸和橙皮苷，分别置于容量瓶中，加入适量甲醇并进行超声处理，冷却，摇匀，经微孔滤膜过滤即得对照品溶液；其中，以橙皮苷为参照物；
(3)对照药材溶液的制备：
分别取一定重量的大黄、香附、厚朴和苍术置于容器中，加入适量甲醇并进行超声处理，冷却，摇匀，滤过，取续滤液作为对照药材溶液；
(4)高效液相色谱测定：
分别取适量供试品溶液、对照品溶液及对照药材溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
将供试品溶液的高效液相色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析，得到舒气丸的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。
优选地，所述供试品溶液的制备方法为：取1-2g舒气丸，研碎，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，并称定重量作为初始重量，提取0.5-1.5h，冷却，再称定重量，并用甲醇补足减失的重量以使重量达到初始重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
优选地，所述供试品溶液的制备方法为：取1.5g舒气丸，研碎，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，并称定重量作为初始重量，提取1h，冷却，再称定重量，并用甲醇补足减失的重量以使重量达到初始重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
优选地，所述提取方法为超声提取或回流提取；更优选地，所述提取方法为超声提取，所述超声提取的功率为300W，频率为40kHz。
优选地，所述供试品溶液的高效液相色谱条件为：
色谱柱规格：Agilent Zorbax SB-C18，250mm×4.6mm，2.5μm
流动相：流动相包括流动相A和流动相B；其中，流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.5％的磷酸甲醇溶液；
梯度洗脱程序：
0-20min，流动相A体积浓度由12％增加至20％，流动相B体积浓度由88％减少至80％；
20-30min，流动相A体积浓度由20％增加至28％，流动相B体积浓度由80％减少至72％；
30-45min，流动相A体积浓度保持28％，流动相B体积浓度保持72％；
45-55min，流动相A体积浓度由28％增加至62％，流动相B体积浓度由72％减少至38％；
55-75min，流动相A体积浓度由62％增加至90％，流动相B体积浓度由38％减少至10％；
75-80min，流动相A体积浓度保持90％，流动相B体积浓度保持10％；
柱温：25℃；
检测波长：255nm；
流速：0.8mL/min；
进样量：20μL；
理论塔板数按橙皮苷峰计算不应低于8000。
优选地，所述对照品溶液的制备方法为：精密称取橙皮苷9.85mg、大黄素9.67mg、大黄酚10.12mg、大黄素甲醚10.58mg和大黄酸9.67mg，分别置于10mL容量瓶中，加入甲醇超声溶解，冷却，定容，摇匀，滤过，取滤液作为对照品溶液；
所述对照药材溶液的制备方法为：精密称取大黄1.4965g、香附1.4908g、厚朴1.4950g和苍术1.4924g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，超声提取1h，放冷，滤过，取续滤液，作为对照药材溶液。
优选地，所述对照品溶液和对照药材溶液的高效液相色谱条件为：
色谱柱规格：C18色谱柱，250mm×4.6mm，5μm；
流动相：流动相包括流动相A和流动相B；其中，流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.5％的磷酸甲醇溶液；
柱温：20℃；
检测波长：255nm；
流速：0.8mL/min；
进样量：20μL；
梯度洗脱程序：
0-20min，流动相A体积浓度由12％增加至20％，流动相B体积浓度由88％减少至80％；
20-30min，流动相A体积浓度由20％增加至28％，流动相B体积浓度由80％减少至72％；
30-45min，流动相A体积浓度保持28％，流动相B体积浓度保持72％；
45-55min，流动相A体积浓度由28％增加至62％，流动相B体积浓度由72％减少至38％；
55-75min，流动相A体积浓度由62％增加至90％，流动相B体积浓度由38％减少至10％；
75-80min，流动相A体积浓度保持90％，流动相B体积浓度保持10％。
优选地，所述舒气丸的对照指纹图谱包括17个共有峰，3、4、5、6、8、9、12、16和17号峰为大黄特征峰，11和13号峰为厚朴特征峰，14号峰为香附特征峰。
优选地，2号峰为橙皮苷，作为参照峰，9号峰为大黄酸，12号峰为大黄素，16号峰为大黄酚，17号峰为大黄素甲醚。
优选地，17个共有峰的相对保留时间的相对标准偏差RSD均小于2％；
以舒气丸对照指纹图谱为参照计算相似度，舒气丸指纹图谱相似度均在0.9以上。
本申请的有益效果包括但不限于：
1.本申请的舒气丸高效液相色谱指纹图谱的建立方法，根据舒气丸中所含组分的药物作用，结合君臣佐使，以大黄、陈皮等药材的主要成分大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、橙皮苷等为研究指标，进行了舒气丸指纹图谱的研究，提供了舒气丸指纹图谱的建立方法和检测方法，为舒气丸的质量控制提供参考和依据；该方法简便、稳定、精密度高、重现性好。
2.根据本申请的舒气丸高效液相色谱指纹图谱的建立方法所建立的舒气丸指纹图谱，具有17个达到有效分离的特征峰，因此获得的指纹图谱能有效地表征舒气丸的质量，有利于全面监控药物的质量。
3.采用本申请的舒气丸高效液相色谱指纹图谱的建立方法，对10个不同批次的舒气丸进行检测，得到相同位置的色谱峰的相对保留时间的RSD均小于2％，因此采用本申请提供的舒气丸高效液相色谱指纹图谱的建立方法所建立的指纹图谱具有良好的可靠性。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为本申请实施例3的样品色谱峰。
图2为本申请实施例1的色谱条件下对照品的色谱峰。
图3为本申请实施例1的色谱条件下对照药材的色谱峰。
图4为本申请实施例2洗脱梯度考察图谱1#。
图5为本申请实施例2洗脱梯度考察图谱2#。
图6为本申请实施例2洗脱梯度考察图谱3#。
图7为本申请实施例3舒气丸指纹图谱的检测色谱图。
图8为本申请实施例3用平均值计算法生成的舒气丸的对照指纹图谱。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
实施例用到的仪器及试剂如下：
1、仪器
Waters 2695高效液相色谱仪；DAD检测器；BSA224S-CW型电子分析天平；力康HEALFORCE NW(30K)VF纯水机；KQ-300DE型数控超声波清洗器。
2、试剂
对照品：橙皮苷、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚，对照药材：大黄、香附、厚朴、苍术，均购于中国食品药品检定研究院，其纯度均≥98％。
供试品：本发明采用舒气丸为自制中试样品，批号：201001、201002、201003、201004、201005、201006、201007、201008、201009、201010。
甲醇、乙腈均为色谱纯，购自美国默克公司，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
实施例1舒气丸高效液相色谱指纹图谱的建立方法
对照品溶液的制备方法为：精密称取橙皮苷9.85mg、大黄素9.67mg、大黄酚10.12mg、大黄素甲醚10.58mg和大黄酸9.67mg，分别置于10mL容量瓶中，加入甲醇超声溶解，冷却，定容，摇匀，滤过，取滤液作为对照品溶液。
在上述5种化合物中，橙皮苷在舒气丸中的含量较稳定，且在图谱中保留时间适中、分离度较好，因此选择橙皮苷作为参照物，后续相应的橙皮苷色谱峰作为参照峰。
对照药材溶液的制备方法为：精密称取大黄1.4965g、香附1.4908g、厚朴1.4950g和苍术1.4924g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，超声提取1h，放冷，滤过，取续滤液，作为对照药材溶液。
对对照品溶液和对照药材溶液进行检测，高效液相色谱条件为：
色谱柱规格：C18色谱柱，250mm×4.6mm，5μm；
流动相：流动相包括流动相A和流动相B；其中，流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.5％的磷酸甲醇溶液，甲醇与体积浓度为0.5％的磷酸溶液的体积比为1:9；
柱温：20℃；
检测波长：255nm；
流速：0.8mL/min；
进样量：20μL；
梯度洗脱程序：
0-20min，流动相A体积浓度由12％增加至20％，流动相B体积浓度由88％减少至80％；
20-30min，流动相A体积浓度由20％增加至28％，流动相B体积浓度由80％减少至72％；
30-45min，流动相A体积浓度保持28％，流动相B体积浓度保持72％；
45-55min，流动相A体积浓度由28％增加至62％，流动相B体积浓度由72％减少至38％；
55-75min，流动相A体积浓度由62％增加至90％，流动相B体积浓度由38％减少至10％；
75-80min，流动相A体积浓度保持90％，流动相B体积浓度保持10％。结果见图2和图3。
实施例2色谱的建立及方法验证
1、色谱条件选择
1.1检测波长的选择
除检测波长条件外其他与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。二极管阵列检测器的波长范围是190～400nm，通过比较不同波长下样品的色谱图，依据色谱峰的数量、色谱峰响应值、基线是否稳定等原则，最终选择255nm作为舒气丸指纹图谱的检测波长。
1.2洗脱梯度考察
除洗脱梯度条件外，其余色谱条件与实施例1相同，梯度洗脱条件分别按照表1、表2、表3进行。
表1溶剂洗脱程序1#
Figure BDA0003319933360000081
表2溶剂洗脱程序2#
Figure BDA0003319933360000082
表3溶剂洗脱程序3#
Figure BDA0003319933360000083
供试品溶液的制备：精密称取批号为201001批的舒气丸适量，研碎，称取1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
精密吸取供试品溶液20μL，注入高效液相色谱仪，记录80min的色谱图，图谱见图4-图6，根据试验结果，选择洗脱程序2#为指纹图谱洗脱条件。
2、供试品溶液制备条件的优化
2.1提取方法的选择
取批号为201001批的舒气丸适量，研细，精密称取2份，分别为1.5012g和1.4983g，分别置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，考察超声提取(300W，40KHz)1h和回流提取1h，放冷，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。分别精密称取上述两份供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，记录80min的色谱图，以色谱峰个数和主峰峰面积除以取样量为评价指标，试验结果表明，超声与回流两种方式提取效果相当，考虑到超声提取操作简单易行，故选择超声提取法。
2.2提取时间的选择
取批号为201001批的舒气丸内容物，研细，精密称取2份，分别1.5013g和1.4879g，分别置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，考察超声提取(300W，40KHz)30min和超声提取(300W，40KHz)1h，放冷，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
分别精密称取上述2份供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，记录80min的色谱图，以色谱峰个数和主峰峰面积除以取样量为评价指标进行分析，试验结果表明，超声1h色谱峰个数和主峰峰面积大于超声30min，选择提取时间为1h。
综合上述试验结果，确定舒气丸指纹图谱供试品溶液的制备方法为：取舒气丸粉末1.5g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25mL，超声(300W，40kHz)处理1h，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
3、方法学验证
3.1精密度实验
对本发明提供的舒气丸指纹图谱建立方法进行精密度实验，过程如下：
供试品溶液的制备：取批号为201001批的舒气丸内容物，研磨，精密称取1.5010g，置于具塞锥形瓶中，向锥形瓶中加入甲醇25mL，并在300W/40kHz超声条件下超声处理1h，冷却，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。将供试品溶液平行进样6次，计算主要色谱峰(占总峰面积1％以上)的相对保留时间和相对峰面积，结果见表4和表5。
表4精密度考察结果(相对保留时间)
Figure BDA0003319933360000101
表5精密度考察结果(相对峰面积)
Figure BDA0003319933360000102
Figure BDA0003319933360000111
3.2溶液稳定性试验
对本发明提供的舒气丸指纹图谱建立方法进行溶液稳定性实验，过程如下：
供试品溶液的制备：取批号为201001批的舒气丸，研磨，精密称取1.5065g，置于具塞锥形瓶中，向锥形瓶中加入甲醇25mL，并在300W/40kHz超声条件下超声处理1h，冷却，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
将供试品溶液分别在0h、2h、4h、8h、12h进样，记录指纹色谱图谱，共测定5个时间点，计算主要色谱峰(占总峰面积1％以上)的相对保留时间和相对峰面积，结果见表6和表7，结果表明供试品溶液在室温条件下24小时内稳定性良好。
表6稳定性考察结果(相对保留时间)
Figure BDA0003319933360000112
Figure BDA0003319933360000121
表7稳定性考察结果(相对峰面积)
Figure BDA0003319933360000122
3.3重复性试验
对本发明提供的舒气丸指纹图谱建立方法进行重复性试验，过程如下：
供试品溶液的制备：取批号为201001批的舒气丸适量，研磨，精密称取1.4975g，置于容器中，向容器中加入甲醇25mL，并在300W/40kHz超声条件下超声处理1h，冷却，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；同法制备供试品溶液6份。
分别精密吸取供试品溶液和参照峰溶液，注入高效液相色谱仪，依照提供的色谱条件进行梯度洗脱，记录色谱图。计算主要色谱峰(占总峰面积1％以上)的相对保留时间(见表8)、相对峰面积(见表9)。
表8舒气丸指纹图谱建立方法重复性考察结果(相对保留时间)
Figure BDA0003319933360000131
表9舒气丸指纹图谱建立方法重复性考察结果(相对峰面积)
Figure BDA0003319933360000132
Figure BDA0003319933360000141
由表8和表9可以看出，相对保留时间的RSD及相对峰面积的RSD均小于2％，表明该方法重复性良好。
实施例3指纹图谱的建立
1、舒气丸指纹图谱的检测
取批号分别为：201001、201002、201003、201004、201005、201006、201007、201008、201009、201010的舒气丸。
供试品溶液的制备：取上述10批次的舒气丸内容物，置于容器中，向容器中加入甲醇20mL，并在300W/40kHz超声条件下超声处理30min，冷却，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；201001、201002、201003、201004、201005、201006、201007、201008、201009、201010称样量分别为：1.5045g、1.5157g、1.5522g、1.5458g、1.5346g、1.5234g、1.5533g、1.5541g、1.5472g、1.5391g。
精密吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，依照提供的色谱条件进行梯度洗脱，记录色谱图，结果见图1。计算主要色谱峰(占总峰面积1％以上)的相对峰面积(见表10)和相对保留时间(见表11)。
表10 10批舒气丸指纹图谱测定结果1(相对峰面积)
Figure BDA0003319933360000151
表11 10批舒气丸指纹图谱测定结果1(相对保留时间)
Figure BDA0003319933360000152
Figure BDA0003319933360000161
2、共有峰的确定及对照指纹图谱的获得
将10批舒气丸指纹图谱的AIA格式从仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，见附图7，选择10批舒气丸指纹图谱中均存在的色谱峰作为共有峰。用平均值计算法生成舒气丸的对照指纹图谱，见附图8，计算各共有峰的相似度，结果见表12。
表12 10批舒气丸指纹图谱相似度结果
Figure BDA0003319933360000162
上述试验结果表明，以对照指纹图谱为参照计算相似度，10批舒气丸指纹图谱相似度均在0.9以上，因此暂定舒气丸指纹图谱标准为：供试品图谱应与对照指纹图谱一致，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。
以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.舒气丸高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：
取一定重量的舒气丸置于容器中，加入适量甲醇进行提取，冷却，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：
取一定重量的大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄酸和橙皮苷，分别置于容量瓶中，加入适量甲醇并进行超声处理，冷却，摇匀，过滤后即得对照品溶液；其中，以橙皮苷为参照物；
(3)对照药材溶液的制备：
分别取一定重量的大黄、香附、厚朴和苍术置于容器中，加入适量甲醇并进行超声处理，冷却，摇匀，滤过，取续滤液作为对照药材溶液；
(4)高效液相色谱测定：
分别取适量供试品溶液、对照品溶液及对照药材溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
将供试品溶液的高效液相色谱图进行分析，得到舒气丸的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；
所述供试品溶液的高效液相色谱条件为：
色谱柱规格：Agilent Zorbax SB-C18，250mm×4.6mm，2.5μm；
流动相：流动相包括流动相A和流动相B；其中，流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.5％的磷酸甲醇溶液；
流速：0.8mL/min；
柱温：25℃；
检测波长：255nm；
进样量：20μL；
理论塔板数按橙皮苷峰计算不应低于8000；
梯度洗脱程序：
0-20min，流动相A体积浓度由12％增加至20％，流动相B体积浓度由88％减少至80％；
20-30min，流动相A体积浓度由20％增加至28％，流动相B体积浓度由80％减少至72％；
30-45min，流动相A体积浓度保持28％，流动相B体积浓度保持72％；
45-55min，流动相A体积浓度由28％增加至62％，流动相B体积浓度由72％减少至38％；
55-75min，流动相A体积浓度由62％增加至90％，流动相B体积浓度由38％减少至10％；
75-80min，流动相A体积浓度保持90％，流动相B体积浓度保持10％。
2.根据权利要求1所述的舒气丸高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述对照品溶液和对照药材溶液的高效液相色谱条件为：
色谱柱规格：C18色谱柱，250mm×4.6mm，5μm。
3.根据权利要求2所述的舒气丸高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，流动相：流动相包括流动相A和流动相B；其中，流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.5％的磷酸甲醇溶液；
柱温：20℃；
检测波长：255nm；
流速：0.8mL/min；
进样量：20μL。
4.根据权利要求3所述的舒气丸高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，梯度洗脱程序：
0-20min，流动相A体积浓度由12％增加至20％，流动相B体积浓度由88％减少至80％；
20-30min，流动相A体积浓度由20％增加至28％，流动相B体积浓度由80％减少至72％；
30-45min，流动相A体积浓度保持28％，流动相B体积浓度保持72％；
45-55min，流动相A体积浓度由28％增加至62％，流动相B体积浓度由72％减少至38％；
55-75min，流动相A体积浓度由62％增加至90％，流动相B体积浓度由38％减少至10％；
75-80min，流动相A体积浓度保持90％，流动相B体积浓度保持10％。
5.根据权利要求1所述的舒气丸高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，舒气丸的对照指纹图谱包括17个共有峰，3、4、5、6、8、9、12、16和17号峰为大黄特征峰，11和13号峰为厚朴特征峰，14号峰为香附特征峰。
6.根据权利要求5所述的舒气丸高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，2号峰为橙皮苷，作为参照峰，9号峰为大黄酸，12号峰为大黄素，16号峰为大黄酚，17号峰为大黄素甲醚。
7.根据权利要求6所述的舒气丸高效液相色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，17个共有峰的相对保留时间的相对标准偏差RSD均小于2％；
以舒气丸对照指纹图谱为参照计算相似度，舒气丸指纹图谱相似度均在0.9以上。
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