CN107917966B - 一种养血清脑制剂的检测方法 - Google Patents

一种养血清脑制剂的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种养血清脑制剂的检测方法，所述方法为高效液相色谱法，包括以下步骤：步骤1，供试品溶液的制备，步骤2，对照品溶液的制备，步骤3，色谱条件；步骤4，含量测定，将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图。本发明提供的方法供试品经过固相色谱柱处理后，成分经富集、纯化后再分析，使得对应色谱方法的分析时间更短的同时，更保证了色谱峰的分离度和方法的重现性；且本发明清晰定义了指纹图谱的相对定量方式，共明确了含量测定的绝对定量指标(2个)和指纹图谱的相对定量指标(19个)的控制要求，控制指标更全面，对产品的质量属性进行了更量化的描述。

Description

一种养血清脑制剂的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种中药制剂的检测方法，特别涉及一种养血清脑制剂的检测方法。
背景技术：
养血清脑制剂(包括丸、颗粒等)是由当归、川芎、白芍、熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、决明子、珍珠母、延胡索、细辛十一味中药和辅料制成的中成药，目前已经上市。养血清脑制剂具有养血平肝，活血通络的功效，可用于血虚肝亢所致的头痛、眩晕眼花、心烦易怒、失眠多梦等病症，在临床上具有显著的疗效。可以改善软脑膜微循环，增加脑血流量，缓解血管痉挛与止痛。目前，该药已成为临床上治疗CCCI(慢性脑供血不足)引起的头晕头痛失眠等症状的首选现代中药。养血清脑水提浸膏是养血清脑颗粒和养血清脑丸的制剂中间体。制备工艺为：当归、川芎、延胡索、决明子加乙醇加热回流提取，滤过，除杂，回收乙醇并浓缩，备用；白芍加乙醇加热回流提取，滤过，回收乙醇并浓缩，备用；熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛加水煎煮，滤过，浓缩，加乙醇静置，滤过，回收乙醇并浓缩，将所有提取物混合，即得养血清脑水提浸膏。
养血清脑制剂主要药味当归、川芎、夏枯草、白芍等均含有酚酸成分。近年来的研究表明酚酸类化合物不仅具有显著的抗氧化、抗自由基、抑制低密度脂蛋白的氧化以及预防心血管疾病的作用，而且具有抗癌、抗炎症和血小板凝聚等功能，在医药方面有广泛的用途。另一重要药味——决明子，其主要成分蒽醌类物质，如橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚等，也具有降血压、降血脂、抗动脉粥样硬化等功效。
中药产品作为一种多靶向作用制剂，其质量应综合评价。中药指纹图谱技术，作为一种综合宏观分析的可行手段，目前已成为国内外广泛接受的全面评价中药质量的方法。美国FDA在植物药制品指导原则中允许申报者提供产品的色谱指纹图谱资料，德国药用植物学会、英国草药典、印度草药典以及加拿大药用及芳香植物学会也都把指纹图谱作为质量控制标准的内容之一。
针对养血清脑颗粒，之前通过高效液相色谱(李文博等，养血清脑颗粒的高效液相色谱指纹图谱研究，分析化学研究简报，2011(3)：387～391，以下简称文献1)及气相色谱(李文博等，养血清脑颗粒中挥发性成分的GC指纹图谱研究，中草药，2011，42(7)：1321，以下简称文献2)分别进行过指纹图谱的研究。
然而，文献1存在如下缺陷：(1)分析时间过长(90分钟)，不利于实际生产中对养血清脑颗粒的质量评价和控制；(2)因监测波长所限(327nm、280nm)，所选定量成分含量较低(分别为阿魏酸、咖啡酸、迷迭香酸、黄芩苷)；方法未对含量较大的芍药苷进行定量测定(一般检测波长为230～240nm)；(3)未明确方法用于质量控制的评价方式。
文献2存在如下缺陷：①仅针对挥发性成分进行了定性分析，无定量监测成分，多可用于产品的定性鉴别。②本研究共识别了10个共有峰，除一个较大成分峰(Z-藁本内酯)外，各成分所占比例相对较少，且仅来源于当归、川芎两味药材，不能做于本品整体质量评价的代表图谱。
因此，发明人对养血清脑制剂(包括养血清脑颗粒、养血清脑丸等)建立了一种更为全面的、可进行整体评价的指纹图谱，以更好的反映养血清脑制剂的质量。
发明内容：
本发明提供了一种养血清脑制剂的检测方法，所述方法为高效液相色谱法，包括以下步骤：步骤1，供试品溶液的制备，步骤2，对照品溶液的制备，步骤3，色谱条件，步骤4，测定，将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图。
其中，所述高效液相色谱条件如下：
所述色谱条件为：用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.01％～0.5％磷酸或甲酸溶液为流动相B，将供试品溶液Ⅰ和供试品溶液Ⅱ分别按表1所述的梯度洗脱条件进行梯度洗脱；流速为每分钟0.4ml。
表1：梯度洗脱条件
Figure BDA0001126106940000021
Figure BDA0001126106940000031
优选的，本方所述方法，其中，所述供试品的制备包括以下步骤：取养血清脑制剂的粉末适量，加入50％～70％乙醇，使供试品溶液的终浓度为0.4g/10ml～0.4g/50ml，超声处理15～35分钟，放冷后离心，吸取上清液，过反相固相萃取柱，用70％乙醇洗脱，收集流出液，摇匀滤过，即得供试品溶液Ⅰ，继续用乙腈洗脱，收集洗脱液，摇匀滤过，即得。
优选的，本方所述方法，其中，对照品溶液的制备包括以下步骤：取芍药苷对照品适量，加70％乙醇制成浓度为0.006～0.400mg/ml对照品溶液；取橙黄决明素对照品适量，加70％乙醇制成浓度为0.800μg/ml～100μg/ml对照品溶液；
优选地，本方所述方法，其中，含量测定方法为：芍药苷含量的测定如下：分别精密吸取芍药苷对照品溶液与供试品溶液Ⅰ各2μl，注入液相色谱仪，按照梯度洗脱条件Ⅰ进行测定，即得；橙黄决明素含量测定如下：分别精密吸取橙黄决明素对照品溶液与供试品溶液Ⅱ各4μl，注入液相色谱仪，按照梯度洗脱条件Ⅱ进行测定，即得。
更优选的，本发明所述方法，所述供试品的制备包括以下步骤：取养血清脑制剂的粉末适量，加入70％的乙醇溶液，使供试品溶液的终浓度为0.4g/10ml～0.4g/50ml，超声处理15分钟，放冷后离心，吸取上清液，过反相固相萃取柱，后用70％乙醇洗脱，收集所有流出液，摇匀滤过，即得供试品溶液Ⅰ；继续用乙腈洗脱，收集洗脱液，摇匀滤过，即得供试品溶液Ⅱ。
最优选的，本发明所述方法，其中，供试品溶液的制备：取养血清脑制剂的粉末适量，加入70％的乙醇溶液，使供试品溶液的终浓度为0.4g/50ml，超声处理15分钟，放冷后离心，吸取上清液5ml，过已处理好的反相固相萃取柱，后用70％乙醇5ml洗脱，收集上述所有流出液定容至10ml，摇匀滤过，即得供试品溶液Ⅰ；继续用乙腈15ml洗脱，收集洗脱液，加纯化水定容至25ml，摇匀滤过，即得供试品溶液Ⅱ；
最优选的，本发明所述方法，其中，对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，加70％乙醇制成浓度为0.05mg/ml对照品溶液；取橙黄决明素对照品适量，加70％乙醇制成浓度为5μg/ml对照品溶液；
最优选的，本发明所述方法，其中，芍药苷含量：分别精密吸取芍药苷对照品溶液与供试品溶液Ⅰ各2μl，注入液相色谱仪，按梯度洗脱条件Ⅰ进行测定，即得；橙黄决明素含量：分别精密吸取橙黄决明素对照品溶液与供试品溶液Ⅱ各4μl，注入液相色谱仪，按梯度洗脱条件Ⅱ进行测定，即得。
本发明所述方法，优选的，色谱条件及系统适应性试验：用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，具体为Waters ACQUITY UPLC BEH C18，100mm×2.1mm，1.7μm，以乙腈为流动相A，以0.05％的磷酸溶液为流动相B，用表1的梯度洗脱条件进行洗脱；流速为每分钟0.4ml；
本发明所述方法，其中供试品的制备中所用的反相固相萃取柱为DIKMA PLS固相萃取柱。
本发明所述标准指纹图谱是经过对多批合格样品进行高效液相色谱检测，记录色谱图，并参考参照物的色谱图经过计算机统计计算，生成得到的标准高效液相色谱图。
本发明所述的检测方法是对未知样品进行高效液相色谱检测，得到色谱图，将所得色谱图和上述标准指纹图谱进行对比，相似度高于90％则为合格样品，否则为不合格样品。
本发明进一步研究出一种高效液相指纹图谱，其建立方法包括如下步骤：
1)对照品溶液的制备：
取芍药苷对照品适量，加70％乙醇制成浓度为0.006～0.400mg/ml对照品溶液；取橙黄决明素对照品适量，加70％乙醇制成浓度为0.800μg/ml～100μg/ml对照品溶液；
2)合格养血清脑溶液的制备取养血清脑制剂的粉末适量，加入50％～70％乙醇，使供试品溶液的终浓度为0.4g/10ml～0.4g/50ml，超声处理，放冷后离心，吸取上清液，过已处理好的反相固相萃取柱，后用70％乙醇洗脱，收集所有流出液，摇匀滤过，即得供试品溶液Ⅰ；继续用乙腈洗脱，收集洗脱液，加纯化水定容，摇匀滤过，即得供试品溶液Ⅱ；
3)将对照品溶液和合格养血清脑溶液注入色谱仪，经过对多批次合格样品进行测定，所得色谱图综合后，最终得到标准对照指纹图谱；
其中，色谱条件为：用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.01％～0.5％磷酸或甲酸溶液为流动相B，用表1的梯度洗脱条件进行洗脱；流速为每分钟0.4ml。
本发明人还提出了根据相对保留时间和相对峰面积，判断产品的质量的方法——养血清脑制剂的含量标准，即：每袋含白芍以芍药苷计，不得少于9.0mg/袋；含决明子以橙黄决明素计，不得少于0.22mg/袋；各色谱峰的相对保留时间与标准值的差值不得大于5％；相对峰面积不得超过标准范围(表2)。
表2：各色谱峰、相对峰面积的标准值/标准范围
Figure BDA0001126106940000051
需要说明的是：R.T.(相对保留时间)＝具体峰的保留时间/S峰的保留时间；R.A.(相对峰面积)＝具体峰的峰面积/S峰的峰面积。
通过本发明的检测方法，检测养血清脑制剂，将得到相对保留时间和相对峰面积与养血清脑的标准范围，判断产品的质量。
本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：
一、测定方法的建立
根据本品的制备工艺，选择70％乙醇溶液作为预实验阶段提取溶剂，通过超声提取制得预实验供试品溶液。
1、色谱条件的选择：
1.1 检测波长的选择：
以ACQUITY UPLC BEH C18为测试色谱柱，初选乙腈-磷酸/水溶液进行液相色谱分析，采用PDA检测器对供试品溶液在190～400nm间进行全波长扫描，提取常用检测波长(320nm、280nm、254nm、230nm、203nm)下的色谱图，发现：230nm、280nm包含了其他所选波长下的主要色谱峰，且基线、杂质干扰均较合理，故暂定230nm、280nm作为本方法的检测波长。
1.2 流动相体系选择
鉴于养血清脑制剂含有部分酚酸类成分，采用含酸的流动相体系将会改善峰形、提高色谱峰分离度，因此，后续选择加酸体系开展研究。
实验主要考察了乙腈-磷酸溶液、甲醇-磷酸溶液。结果表明，甲醇-磷酸溶液体系下，供试品溶液的色谱峰变宽，分离度差且基线不平，故选择乙腈-磷酸溶液作为后续考察的流动相体系。
1.3 流动相梯度洗脱程序的考察
因供试品成分复杂，色谱信息过多。实验前期，参考文献中常见的分析方法，尝试建立“单一洗脱梯度”的色谱分析方法，然而，各色谱峰的分离度难以满足定量要求，且随着洗脱时间的延长，色谱峰宽也增加，色谱峰的检测灵敏度相对下降。分析该阶段的多张色谱图发现，在乙腈-磷酸体系下，随着乙腈比例的增加，供试品溶液对应的多个色谱峰中一个略微明显的成分分界点。考虑到各组分按照极性大小依次流出，分界点以前的成分极性较大，其后的成分则极性较小，故调整分析策略，改为“双洗脱梯度”进行“分段指纹图谱”研究。
以该分界点为界限，分别对前段成分、后段成分进行洗脱梯度考察，以保证两部分各主要色谱峰的分离度及峰型。考察约60余种梯度条件，确定了较佳色谱条件如表1所示。
色谱条件为：用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸溶液为流动相B；流速为每分钟0.4ml；分别按表1进行梯度洗脱。(对应色谱图详见图1)
1.4 不同酸及浓度的考察
按照上述确定的梯度条件，考察不同酸对指纹图谱Ⅰ、Ⅱ中各色谱峰分离效果的影响，所考察的酸分别为0.01％、0.05％、0.5％的磷酸溶液和0.05％甲酸溶液。
结果表明：3种磷酸浓度体系下，供试品溶液的各色谱峰的分离度变化不大(详见图2)，2种酸体系下，供试品溶液的各色谱峰的分离度也变化不大(详见图3)；均满足了指纹/含量对主要色谱峰的分离要求，可认为都是适用本品的指纹/含量测定方法。
分析实验结果，所考察范围内的酸浓度、酸类型对本实验影响较小，即主要色谱峰成分受酸的影响作用不大，推测可能原因为：本条件下的主要监测成分无明显的酸性、碱性，或受离子化作用影响较弱。
2、供试品制备方法的选择
2.1 提取溶剂种类的选择：
根据本品的制备工艺推测，中等浓度的醇溶液对本品粉末的提取可能较为充分；试验人员比较了常用的醇提取溶剂。结果表明：甲醇、乙醇，二者对成分的提取效果相似，而乙醇相对价格低廉，毒性等危害较小，故本实验选择一定浓度的乙醇溶液作为本品的提取溶剂。
2.2 提取溶剂浓度的选择：
取本品粉末适量精密称定，分别以不同浓度的乙醇溶液(0％、30％、50％、70％、95％)为提取溶剂，超声35分钟进行提取，摇匀滤过后进行色谱分析。
结果表明：①0％、30％、95％乙醇的提取溶液均存在部分色谱峰比例低或缺失现象；而50％、70％乙醇的提取溶液对应的色谱峰则相对丰富，且较为一致。②进一步分析50％、70％乙醇溶液的提取效果，通过比较相同色谱条件下对应色谱峰的峰面积大小发现，各色谱峰面积RAD均＜5％，可认为50％、70％乙醇两种溶剂的提取效果差异不大，均较完整地提取了本品的主要成分，可作为本品的指纹图谱及含量测定的供试品制备。
2.3 提取溶剂的固液比选择：
取本品粉末适量精密称定，以70％乙醇溶液为提取溶剂，固液比分别为0.4g/10ml、0.4g/50ml，超声35分钟进行提取，摇匀滤过后进行色谱分析。
结果分析：以“色谱峰面积/固液比”作为评价指标，比对发现，两种固液比提取效果RAD＜5％，可认为两种固液比的提取效果差异不大，均较完整地提取了本品的主要成分，均可用于其指纹其含量的供试品处理过程。
2.4 超声时间的选择
取本品粉末约0.4g，精密加入70％乙醇溶液50ml，分别超声15分钟、35分钟提取，摇匀滤过后进行色谱分析。
结果分析：对各主要色谱峰的峰面积进行比对发现，两种超声时间所得供试品溶液的各色谱峰面积RAD均＜5％。可认为两种不同固液比下的提取效果差异不大，超声15分钟对本品的提取效果完全。
2.5 萃取柱的选择：
因2.4中所得溶液在“梯度洗脱条件Ⅰ”、“梯度洗脱条件Ⅱ”下所得的指纹图谱Ⅰ和指纹图谱Ⅱ中，分别有大量杂质色谱峰堆积于目标色谱峰的后端(指纹图谱Ⅰ)和前端(指纹图谱Ⅱ)。若杂质色谱峰在色谱图后端堆积，将会导致后续分析重现性差，且对色谱柱的使用寿命有不良影响；在色谱图前端的堆积，则可能影响该次分析的色谱峰分离度，同样会出现保留时间漂移、分析重现性差等不利影响。故拟定采用固相萃取技术，对2.4中所得溶液进行进一步的富集、分离，以得到分别对应指纹图谱Ⅰ、Ⅱ的的供试品溶液Ⅰ、Ⅱ。
本实验对常用的大孔树脂、聚酰胺、十八烷基硅烷键合硅胶及其他聚合物吸附剂等柱色谱填料进行筛查。
经多次实验证明，采用聚酰胺填料进行柱分离时，未见明显的成分界限，提示“聚酰胺填料”对本品各成分无吸附分离作用；弱极性或非极性大孔树脂柱-AB-8型大孔树脂、十八烷基硅烷键合硅胶或亲水亲油型聚合物等反相色谱填料进行柱分离时，通过适当的洗脱程序，均可以得到满足“梯度洗脱条件Ⅰ”、“梯度洗脱条件Ⅱ”的供试品溶液。可认为：反相固相萃取柱填料均适用于本品的指纹图谱及含量测定分析。
鉴于固相萃取技术已发展为一种成熟的商业化SPE柱，具有高效、快速、溶剂用量少、操作简便，易于定量控制和自动化、重现性好等诸多优点，选取一种商业化的SPE柱(Dikma PLS柱，500mg，填料为亲水亲油型聚合物)进行后续洗脱溶剂的考察。
2.6 洗脱溶剂的考察：
2.6.1 第一洗脱溶剂(洗脱得到供试品溶液Ⅰ，对应“指纹图谱Ⅰ”)
将本项下(4)中所得溶液转移至固相萃取柱，柱前必定存在样品残留，故而在进行样品富集分离前，须以一定体积的空白提取溶剂将样品全部转移至柱中填料，即第一阶段的洗脱溶剂确定为70％乙醇。收集从上样到洗脱的全部洗脱液，合并作为供试品溶液Ⅰ。
在确定洗脱溶剂用量时，需着重考虑供试品溶液Ⅰ、Ⅱ中对应主要成分均满足定量要求(即，供试品溶液Ⅰ、Ⅱ中主要成分不相同，二者界限分析)。故而以“指纹图谱Ⅰ中最后一个色谱峰洗脱完全”、“指纹图谱Ⅱ中第一个色谱峰未检出”两个条件作为评价指标，分别考察洗脱溶剂用量分别为4ml、5ml、6ml、7ml时的供试品溶液Ⅰ对应的液相色谱图。
结果表明，当上样量为5、6ml时，两个评价指标均满足测试要求，而上样量为7ml时，指纹图谱Ⅱ中检测到微量第一个色谱峰。为降低供试品溶液Ⅰ中出现“供试品溶液Ⅱ中成分”的风险，确定70％乙醇的洗脱用量为5ml。
2.6.2 第二洗脱溶剂(洗脱得到供试品溶液Ⅱ，对应“指纹图谱Ⅱ”)
为保证第二部分指纹图谱的定量要求(即主要成分在固相萃取柱上无残留)，同时避免过分稀释导致的检测灵敏度降低，需对上样量进行考察，寻找最佳洗脱体积。
本实验所用的固相萃取柱填料为反相色谱填料，为将弱极性成分从柱上解吸附，应选用弱极性的洗脱剂进行洗脱。尝试常用的洗脱剂——甲醇进行洗脱，未能将剩余药物成分洗脱完全；故采用极性更弱的乙腈作为本实验的第二洗脱溶剂。收集该阶段的全部洗脱液，作为分段测定的供试品溶液Ⅱ。
以测试方法条件下全部成分洗脱完全为评价指标，分别考察了乙腈洗脱10ml、11ml、12ml、15ml时的样品峰残留情况。
结果表明，乙腈洗脱10ml时，指纹图谱Ⅱ中主要成分仍有微量成分检查；而洗脱至11ml、12ml时，则无检出；证明各成分已洗脱完全。故将乙腈洗脱体积确定为15ml，确保了固相萃取柱上所有成分均洗脱完全。
3、测定方法的确定
综上分析，最终确定本品的指纹图谱/含量测定方法如下：
对照品溶液的制备分别取芍药苷、橙黄决明素对照品适量，精密称定，加70％乙醇制成一定浓度的对照品溶液。
供试品溶液的制备取本品粉末适量，称定至具塞锥形瓶，精密加入50％～70％乙醇10ml～50ml，使供试品溶液的终浓度为0.4g/10ml～0.4g/50ml，密塞超声处理15～35分钟，放冷后离心5分钟，精密吸取上清液5ml，过已处理好的反相固相萃取柱(如弱极性或非极性大孔树脂柱，十八烷基硅烷键合硅胶，或亲水亲油型聚合物等吸附剂为填料，500mg，先用乙腈10ml预洗，再用水10ml预洗)，后用70％乙醇5ml洗脱，收集上述所有流出液定容至10ml，摇匀滤过，即得供试品溶液Ⅰ。继续用乙腈15ml洗脱，收集洗脱液，加纯化水定容至25ml，摇匀滤过，即得供试品溶液Ⅱ。
色谱条件与系统适用性试验用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)，以乙腈为流动相A，以0.01％～0.5％磷酸(或甲酸)溶液为流动相B，分别按表3进行梯度洗脱；流速为每分钟0.4ml。
表3：梯度洗脱表
Figure BDA0001126106940000101
测定法
指纹图谱Ⅰ/芍药苷含量分别精密吸取芍药苷对照品溶液与供试品溶液Ⅰ各2μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
指纹图谱Ⅱ/橙黄决明素含量分别精密吸取橙黄决明素对照品溶液与供试品溶液Ⅱ各4μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
二、用于本品整体性评价的指标及限度标准的确定
为更好地保护本产品，拟通过“指标成分的绝对定量”和“其他成分的相对定量”相结合，以一种更综合、高效、低成本的质量控制形式，来限定本产品的质量属性。
具体描述如下：指纹图谱Ⅰ、Ⅱ中各选取一种成分(即指标成分)进行含量控制(即绝对定量)，并结合指纹图谱的共有峰(即其他成分，通过相对保留时间进行定性)及其相对峰面积(即相对定量)，从而达到本品的全成分控制的目的。
1、色谱峰归属
采用对照品保留时间定性的方法，对供试品溶液Ⅰ、Ⅱ中的各色谱峰进行成分定性，共确定了8个已知成份。
其中，指纹图谱Ⅰ确定的5个成分分别为：芍药花苷、芍药苷、阿魏酸、洋川芎内酯I、迷迭香酸；指纹图谱Ⅱ确定的3个色谱峰分别为：橙黄决明素、大黄素、大黄酚(按照保留时间排序)。
2、含量测定的指标及限度标准
分析指纹图谱Ⅰ、Ⅱ中各已知成分，选择“药理作用明显”、“色谱峰面积较大”的成分作为含量测定指标。
指纹图谱Ⅰ的各已知成分中，芍药苷的色谱比例最大，且是主要药味白芍的含量控制指标(参见《中国药典》2015版一部)；同时，文献资料表明，芍药苷具有降低血液粘度、抗血小板聚集、扩张血管等药理作用，故选择芍药苷作为指纹图谱Ⅰ的含量测定控制指标。
指纹图谱Ⅱ的各已知成分均来源于主要药味决明子，其中，橙黄决明素作为色谱比例较大的成分，同时是决明子的含量控制指标(参见《中国药典》2015版一部)，且文献资料表明，其具有明确的降血脂、降压、抗血小板凝聚等药理作用，故选择橙黄决明素作为指纹图谱Ⅱ的含量测定控制指标。
经过对多批养血清脑制剂进行测试，分析芍药苷和橙黄决明素的含量水平，确定限度标准为：本品每袋含白芍以芍药苷计，不得少于9.0mg/袋；含决明子以橙黄决明素计，不得少于0.22mg/袋。
3、指纹图谱的指标及限度标准
经过对多批养血清脑制剂进行测试，分析主要色谱峰及批次重现性，并结合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》，确定了指纹图谱Ⅰ、Ⅱ中的共有色谱峰(通过相对保留时间进行成分定性控制)，以及各色谱峰的可接受标准(通过相对峰面积进行相对定量控制)见图4-1、4-2和表4：
以下各色谱峰的相对保留时间与标准值的差值不得大于5％；相对峰面积不得超过标准范围。
表4：指纹图谱的限定标准
Figure BDA0001126106940000111
Figure BDA0001126106940000121
三、方法学验证
为保证养血清脑制剂的指纹/含量测定方法的准确性和合理性，按照方法验证要求，对其方法进行方法学验证，证明方法适用性良好。具体内容如下：
1、含量测定方法学验证
1.1 专属性测试
阴性样品Ⅰ：按照本品工艺处方，去除白芍的制备过程，得到阴性样品Ⅰ。
阴性样品Ⅱ：按照本品工艺处方，去除决明子的制备过程，得到阴性样品Ⅱ。
阴性供试品溶液：分别取阴性样品Ⅰ、Ⅱ，按照前述确定的供试品制备方法，制备得到供试品溶液Ⅰ、Ⅱ阴性供试品溶液。
分别取空白溶剂(70％乙醇溶液)、对照品溶液、正常供试品溶液、阴性供试品溶液，按照前述规定的色谱条件进行分析测试。
结果表明：①空白溶剂、供试品溶液Ⅰ阴性供试品溶液均未在芍药苷对照品出峰位置检测到色谱峰，且不干扰正常供试品溶液Ⅰ中芍药苷的含量测定；②空白溶剂、供试品溶液Ⅱ阴性供试品溶液均未在橙黄决明素对照品出峰位置检测到色谱峰，且不干扰正常供试品溶液Ⅱ中橙黄决明素的含量测定；测试结果满足分析验证要求。
1.2 溶液稳定性测试
取芍药苷对照品溶液、橙黄决明素对照品溶液、供试品溶液Ⅰ、供试品溶液Ⅱ，分别按前述分析方法，在各规定的时间点测试，测定各时间点下峰面积的RSD％。测试结果详见表、表。
表5 含量测定方法学验证之对照品溶液稳定性测试
Figure BDA0001126106940000122
Figure BDA0001126106940000131
表6 含量测定方法学验证之供试品溶液稳定性测试
Figure BDA0001126106940000132
表5、6结果表明：①供试品溶液Ⅰ在16h内的峰面积RSD＝1.7％＜3.0％；芍药苷对照品溶液在24h内的峰面积RSD＝0.8％＜3.0％；②供试品溶液Ⅱ供试品溶液、橙黄决明素对照品溶液在24h内的峰面积RSD分别为1.3％、1.2％；各溶液的稳定性测试均符合要求。
1.3 线性测试
系列对照品溶液的制备：以供试品溶液所含待测成分的浓度为100％，分别制备至少5个不同浓度的对照品溶液，其浓度范围应至少为50％～150％。
分别取上述系列对照品溶液，按照前述分析方法进行色谱分析，绘制“浓度-峰面积”标准曲线。测试结果详见表。
表7 含量测定方法学验证之线性范围测试
Figure BDA0001126106940000141
表7结果表明：①芍药苷对照品在0.0064125～0.4104mg/ml范围内，R2≥0.999，浓度与峰面积线性关系良好；②橙黄决明素在0.8238～101.7μg/ml范围内，R2≥0.999，浓度与峰面积线性关系良好。
1.4 重复性测试
取同一批号本品，按前述供试品溶液制备方法操作，共制备供试品溶液9份，分别进行色谱分析，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD。测试结果详见表。
表8 含量测定方法学验证之重复性测试
Figure BDA0001126106940000142
表8结果表明：①各供试品溶液Ⅰ中芍药苷含量的RSD＝1.1％＜3.0％；②各供试品溶液Ⅱ橙黄决明素含量的RSD＝1.4％＜3.0％；测试结果满足分析验证要求。
1.5 准确度测试
取同一批号本品，按前述供试品溶液制备方法，取称样量的1/2，精密加入相应对照品溶液适量，挥干溶剂后，继续后续操作，共制备9份加标供试品溶液。分别进行色谱分析，并计算回收率及RSD。测试结果详见表。
表9 含量测定方法学验证之准确度测试
Figure BDA0001126106940000151
表9结果表明：①各供试品溶液Ⅰ芍药苷的平均回收率为：101.5％(在95.0～105.0％之间)，且RSD＝2.7％≤3.0％；②各供试品溶液Ⅱ橙黄决明素的平均回收率为：100.4％(在95.0～105.0％之间)，且RSD＝2.6％≤3.0％；测试结果满足分析验证要求。
2、指纹图谱方法学验证
针对前面建立的养血清脑制剂的指纹图谱测定方法(指纹图谱Ⅰ、指纹图谱Ⅱ)，为保证其方法的准确性和合理性，按照方法验证要求，对其方法进行方法学验证。方法学验证内容如下：
2.1 精密度测试
取本品1份，按前述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，并按照前述分析方法连续测试6次，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD。
结果显示见表、表
表10 指纹图谱Ⅰ方法学验证之精密度测试
Figure BDA0001126106940000161
表11 指纹图谱Ⅱ方法学验证之精密度测试
Figure BDA0001126106940000162
Figure BDA0001126106940000171
表10、11结果表明：供试品溶液Ⅰ的13个共有峰、供试品溶液Ⅱ的7个共有峰的相对保留时间RSD均＜8.0％，相对峰面积的RSD均＜3.0％；均满足方法学验证要求。
2.2 重复性测试
取同一批号本品，按前述供试品溶液制备方法操作，共制备供试品溶液9份。分别进行色谱分析，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD。
结果见表12、表13。
表12 指纹图谱Ⅰ方法学验证之重复性测试
Figure BDA0001126106940000172
表13 指纹图谱Ⅱ方法学验证之重复性测试
Figure BDA0001126106940000173
Figure BDA0001126106940000181
表12、13结果显示：供试品溶液Ⅰ的13个共有峰、供试品溶液Ⅱ的7个共有峰的相对保留时间RSD均＜8.0％，相对峰面积的RSD均＜3.0％；均满足方法学验证要求。
2.3 稳定性测试
取本品1份，按前述供试品溶液制备方法制备供试品溶液；取供试品溶液及对照品溶液分别在规定时间点进行色谱分析，技术不同时间点下各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD％。
结果见表、表。
表1 指纹图谱Ⅰ方法学验证之稳定性测试
Figure BDA0001126106940000182
Figure BDA0001126106940000191
表2 指纹图谱Ⅱ方法学验证之稳定性测试
Figure BDA0001126106940000192
Figure BDA0001126106940000201
表、表结果显示：供试品溶液Ⅰ的13个共有峰、供试品溶液Ⅱ的7个共有峰的相对保留时间RSD均＜8.0％，相对峰面积的RSD均＜3.0％；均满足方法学验证要求。
本发明提供的检测方法具有以下优点：
1、从检测方法来说，本研究建立了一种养血清脑制剂的整体评价的测定方法，并首次明确了用于本品整体性评价的质量属性。具体描述如下：
通过色谱条件考察、供试品制备方法考察等，建立了一种含量+指纹图谱的测定方法：采用两张指纹图谱(指纹I、指纹II)对紫外吸收成分进行分段监测，总分析时长较短(仅45分钟)；每个指纹图谱选择其中一个“药理作用明显”、“色谱峰面积较大”的已知成分进行定量控制，其他各主要成分以相对峰面积进行相对定量控制；并通过产品质量分析，确定了各成分的含量(或相对含量)，从而实现了本品的整体性质量评价。
2、从技术难度角度而言，本发明限定的产品是根据中医药传统理论，以中医传统名方“四物汤”为基础，配伍活血通络、平肝潜阳、镇痛安神等药物，按照现代工艺制备而成。处方含有当归、川芎、白芍、鸡血藤、决明子、延胡索等11味中药，药味多、成分类型多样(如酚酸类成分、糖苷类、蒽醌类成分等)，如何实现多类成分的有效控制是本品质量控制的技术难点。
本发明提供的方法实现了21个成分的定量或相对定量，监控成分数量多，极性覆盖范围大；且通过对多批效期内、不同年次的制剂产品进行质量检测，数据表明：指纹图谱监测的21个色谱峰均稳定出现，且满足拟定要求；同时对6批养血清脑制剂进行了长期及加速稳定性考察发现，监测成分均未见趋势性下降，证明了本检测方法适用于养血清脑制剂的质量控制。
3、从技术先进性角度而言，与现有技术如文献“养血清脑颗粒的高效液相色谱指纹图谱研究”(李文博等，养血清脑颗粒的高效液相色谱指纹图谱研究，分析化学研究简报，2011(3)：387～391)、“养血清脑颗粒中挥发性成分的GC指纹图谱研究”(李文博等，养血清脑颗粒中挥发性成分的GC指纹图谱研究，中草药，2011，42(7)：1321)相比，本发明提供的方法供试品经过固相色谱柱处理后，成分经富集、纯化后再分析，使得对应色谱方法的分析时间更短的同时，更保证了色谱峰的分离度和方法的重现性；且本发明清晰定义了指纹图谱的相对定量方式，共明确了含量测定的绝对定量指标(2个)和指纹图谱的相对定量指标(19个)的控制要求，控制指标更全面，对产品的质量属性进行了更量化的描述。
附图说明
图1-1、1-2为典型色谱图，其中图1-1为指纹图谱Ⅰ，图1-2为指纹图谱Ⅱ；
图2-1、2-2为不同酸浓度的比对色谱图，由上而下分别为0.5％、0.05％、0.01％磷酸溶液，其中图2-1为指纹图谱Ⅰ，图2-2为指纹图谱Ⅱ；
图3-1、3-2为不同类型酸的比对色谱图，由上而下，分别为：0.05％磷酸溶液、0.05％甲酸溶液，其中图3-1为指纹图谱Ⅰ，图3-2为指纹图谱Ⅱ；
图4-1、4-2为标准对照指纹图谱，其中图4-1为标准对照指纹图谱Ⅰ，其中1-芍药花苷，2(S)-芍药苷，3-阿魏酸，4-洋川芎内酯I，8-迷迭香酸；图4-2为标准对照指纹图谱Ⅱ，其中1-橙黄决明素，6(S)-大黄素，7-大黄酚。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1：
1、对照品溶液的制备
取芍药苷对照品适量，精密称定，加70％乙醇制成浓度为0.05mg/ml的溶液，摇匀，即得芍药苷对照品溶液；
取橙黄决明素对照品适量，精密称定，加70％乙醇制成浓度为5.0μg/ml的溶液，摇匀，即得橙黄决明素对照品溶液。
2、供试品溶液的制备取养血清脑颗粒约0.4g，精密称定至具塞锥形瓶，精密加入70％乙醇15ml，密塞超声处理15分钟，放冷后离心(3000转/分钟)5分钟，精密吸取上清液5ml，过已处理好的DIKMA PLS固相萃取柱(500mg，先用乙腈10ml预洗，再用水10ml预洗)，后用70％乙醇5ml洗脱，收集上述所有流出液至10ml量瓶中，定容至刻线，摇匀滤过，即得供试品溶液Ⅰ。
继续用乙腈15ml洗脱至25ml量瓶中，加纯化水定容至刻度，摇匀滤过，即得供试品溶液Ⅱ。
3、色谱条件与系统适用性试验用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(柱长100mm，内径为2.1mm，1.7μm)色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.01％磷酸溶液为流动相B，流速为每分钟0.4ml；按照本专利确定的分析方法进行分析。
4、检测结果见表16：
表16：检测结果
Figure BDA0001126106940000221
5、检测结果表明：芍药苷含量和橙黄决明素含量均满足拟定的可接受标准；与标准指纹图谱进行比较，对应指纹图谱Ⅰ、指纹图谱Ⅱ中，全部限定色谱峰均有检出，且相对峰面积(峰面积与S峰面积的比值)满足拟定的标准图谱限定要求。
实施例2：
1、对照品溶液的制备
取芍药苷对照品适量，精密称定，加70％乙醇制成浓度为0.01mg/ml的溶液，摇匀，即得芍药苷对照品溶液；
取橙黄决明素对照品适量，精密称定，加70％乙醇制成浓度为1.5μg/ml的溶液，摇匀，即得橙黄决明素对照品溶液。
2、供试品溶液的制备取养血清脑颗粒约0.4g，精密称定至具塞锥形瓶，精密加入70％乙醇10ml，密塞超声处理20分钟，放冷后离心(3000转/分钟)5分钟，精密吸取上清液5ml，过已处理好的DIKMA PLS固相萃取柱(500mg，先用乙腈10ml预洗，再用水10ml预洗)，后用70％乙醇5ml洗脱，收集上述所有流出液至10ml量瓶中，定容至刻线，摇匀滤过，即得供试品溶液Ⅰ。
继续用乙腈15ml洗脱至25ml量瓶中，加纯化水定容至刻度，摇匀滤过，即得供试品溶液Ⅱ。
3、色谱条件与系统适用性试验用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(柱长100mm，内径为2.1mm，1.7μm)色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.5％磷酸溶液为流动相B，流速为每分钟0.4ml；按照本专利确定的分析方法进行分析。
4、检测结果见表17：
表17：检测结果
Figure BDA0001126106940000231
5、检测结果表明：芍药苷含量和橙黄决明素含量均满足拟定的可接受标准；与标准指纹图谱进行比较，对应指纹图谱Ⅰ、指纹图谱Ⅱ中，全部限定色谱峰均有检出，且相对峰面积(峰面积与S峰面积的比值)满足拟定的标准图谱限定要求。
实施例3：
1、对照品溶液的制备
取芍药苷对照品适量，精密称定，加70％乙醇制成浓度为0.10mg/ml的溶液，摇匀，即得芍药苷对照品溶液；
取橙黄决明素对照品适量，精密称定，加70％乙醇制成浓度为20μg/ml的溶液，摇匀，即得橙黄决明素对照品溶液。
2、供试品溶液的制备取养血清脑丸约0.3g，精密称定至具塞锥形瓶，精密加入70％乙醇25ml，密塞超声处理25分钟，放冷后离心(3000转/分钟)5分钟，精密吸取上清液5ml，过已处理好的DIKMA PLS固相萃取柱(500mg，先用乙腈10ml预洗，再用水10ml预洗)，后用70％乙醇5ml洗脱，收集上述所有流出液至10ml量瓶中，定容至刻线，摇匀滤过，即得供试品溶液Ⅰ。
继续用乙腈15ml洗脱至25ml量瓶中，加纯化水定容至刻度，摇匀滤过，即得供试品溶液Ⅱ。
3、色谱条件与系统适用性试验用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(柱长100mm，内径为2.1mm，1.7μm)色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.01％甲酸溶液为流动相B，流速为每分钟0.4ml；按照本专利确定的分析方法进行分析。
4、检测结果见表18：
表18：检测结果
Figure BDA0001126106940000241
5、检测结果表明：芍药苷含量和橙黄决明素含量均满足拟定的可接受标准；与标准指纹图谱进行比较，对应指纹图谱Ⅰ、指纹图谱Ⅱ中，全部限定色谱峰均有检出，且相对峰面积(峰面积与S峰面积的比值)满足拟定的标准图谱限定要求。
实施例4：
1、对照品溶液的制备
取芍药苷对照品适量，精密称定，加70％乙醇制成每1ml含0.30mg/ml的溶液，摇匀，即得芍药苷对照品溶液；
取橙黄决明素对照品适量，精密称定，加70％乙醇制成每1ml含50μg/ml的溶液，摇匀，即得橙黄决明素对照品溶液。
2、供试品溶液的制备取养血清脑丸约0.3g，精密称定至具塞锥形瓶，精密加入70％乙醇50ml，密塞超声处理35分钟，放冷后离心(3000转/分钟)5分钟，精密吸取上清液5ml，过已处理好的DIKMA PLS固相萃取柱(500mg，先用乙腈10ml预洗，再用水10ml预洗)，后用70％乙醇5ml洗脱，收集上述所有流出液至10ml量瓶中，定容至刻线，摇匀滤过，即得供试品溶液Ⅰ。
继续用乙腈15ml洗脱至25ml量瓶中，加纯化水定容至刻度，摇匀滤过，即得供试品溶液Ⅱ。
3、色谱条件与系统适用性试验用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(柱长100mm，内径为2.1mm，1.7μm)色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.5％甲酸溶液为流动相B，流速为每分钟0.4ml；按照本专利确定的分析方法进行分析。
4、检测结果见表19：
表19：检测结果
Figure BDA0001126106940000251
Figure BDA0001126106940000252
Figure BDA0001126106940000261
5、检测结果表明：芍药苷含量和橙黄决明素含量均满足拟定的可接受标准；与标准指纹图谱进行比较，对应指纹图谱Ⅰ、指纹图谱Ⅱ中，全部限定色谱峰均有检出，且相对峰面积(峰面积与S峰面积的比值)满足拟定的标准图谱限定要求。
为了考察本发明的方法，发明人对现有市场上的产品进行了检测，方法为实施例1的方法，结果如下：
1、养血清脑颗粒(市售产品3批，批号分别为121139、130303、131121)
表20：养血清脑颗粒的检测
所考察的3批养血清脑颗粒：
1)芍药苷含量和橙黄决明素含量均满足拟定的可接受标准；
2)与标准指纹图谱进行比较，对应指纹图谱Ⅰ、指纹图谱Ⅱ中，全部限定色谱峰均有检出，且相对峰面积(峰面积与S峰面积的比值)满足拟定的标准图谱限定要求。
2、养血清脑丸(市售产品3批，批号分别为1307169、131102、140324)
表21：养血清脑丸的检测
Figure BDA0001126106940000262
Figure BDA0001126106940000271
所考察的3批养血清脑丸：
1)芍药苷含量和橙黄决明素含量均满足拟定的可接受标准；
与标准指纹图谱进行比较，对应指纹图谱Ⅰ、指纹图谱Ⅱ中，全部限定色谱峰均有检出，且相对峰面积(峰面积与S峰面积的比值)满足拟定的标准图谱限定要求。

Claims (8)

1.一种养血清脑制剂的检测方法，所述方法为高效液相色谱法，包括以下步骤：
步骤1，供试品溶液的制备，
步骤2，对照品溶液的制备，
步骤3，色谱条件；
步骤4，测定，将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，
其中，所述供试品的制备包括以下步骤：取养血清脑制剂的粉末适量，加入70％的乙醇溶液，使供试品溶液的终浓度为0.4g/10ml～0.4g/50ml，超声处理15分钟，放冷后离心，吸取上清液，过反相固相萃取柱，后用70％乙醇洗脱，收集所有流出液，摇匀滤过，即得供试品溶液Ⅰ；继续用乙腈洗脱，收集洗脱液，摇匀滤过，即得供试品溶液Ⅱ，
所述色谱条件为：用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.01％～0.5％磷酸或甲酸溶液为流动相B，将供试品溶液Ⅰ和供试品溶液Ⅱ分别按表1所述的梯度洗脱条件进行梯度洗脱；流速为每分钟0.4ml，
表1：梯度洗脱条件
Figure FDA0003288666730000011
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中，供试品溶液的制备：取养血清脑制剂的粉末适量，加入70％的乙醇溶液，使供试品溶液的终浓度为0.4g/50ml，超声处理15分钟，放冷后离心，吸取上清液5ml，过已处理好的反相固相萃取柱，后用70％乙醇5ml洗脱，收集上述所有流出液定容至10ml，摇匀滤过，即得供试品溶液Ⅰ；继续用乙腈15ml洗脱，收集洗脱液，加纯化水定容至25ml，摇匀滤过，即得供试品溶液Ⅱ。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中，对照品溶液的制备包括以下步骤：取芍药苷对照品适量，加70％乙醇制成浓度为0.006～0.400mg/ml对照品溶液；取橙黄决明素对照品适量，加70％乙醇制成浓度为0.800μg/ml～100μg/ml对照品溶液。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，其中，对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，加70％乙醇制成浓度为0.05mg/ml对照品溶液；取橙黄决明素对照品适量，加70％乙醇制成浓度为5μg/ml对照品溶液。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中，含量测定方法为：芍药苷含量：分别精密吸取芍药苷对照品溶液与供试品溶液Ⅰ各2μl，注入液相色谱仪，按梯度洗脱条件Ⅰ进行测定，即得；橙黄决明素含量：分别精密吸取橙黄决明素对照品溶液与供试品溶液Ⅱ各4μl，注入液相色谱仪，按梯度洗脱条件Ⅱ进行测定，即得。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中，色谱条件：色谱柱WatersACQUITY UPLC BEH C18，100mm×2.1mm，1.7μm，以乙腈为流动相A，以0.05％的磷酸溶液为流动相B，流速为每分钟0.4ml，梯度洗脱条件：
Figure FDA0003288666730000021
7.一种养血清脑制剂标准指纹图谱的构建方法，所述方法包括以下步骤：
1)对照品溶液的制备：
取芍药苷对照品适量，加70％乙醇制成浓度为0.006～0.400mg/ml对照品溶液；取橙黄决明素对照品适量，加70％乙醇制成浓度为0.800μg/ml～100μg/ml对照品溶液；
2)合格养血清脑溶液的制备取养血清脑制剂的粉末适量，加入50％～70％乙醇，使供试品溶液的终浓度为0.4g/10ml～0.4g/50ml，超声处理，放冷后离心，吸取上清液，过已处理好的反相固相萃取柱，后用70％乙醇洗脱，收集所有流出液，摇匀滤过，即得供试品溶液Ⅰ；继续用乙腈洗脱，收集洗脱液，加纯化水定容，摇匀滤过，即得供试品溶液Ⅱ；
3)将对照品溶液和合格养血清脑溶液注入色谱仪，经过对多批次合格样品进行测定，所得色谱图综合后，最终得到标准对照指纹图谱；
其中，色谱条件为：用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.01％～0.5％磷酸或甲酸溶液为流动相B，流速为每分钟0.4ml；梯度洗脱条件如下：
Figure FDA0003288666730000031
8.根据权利要求7所述的指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述指纹图谱中各色谱峰、相对峰面积的标准值/标准范围为：
Figure FDA0003288666730000032
Figure FDA0003288666730000041
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