CN103063766A - 一种脑栓通制剂hplc指纹图谱的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脑栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法，包括构建脑栓通制剂HPLC指纹图谱一和脑栓通制剂HPLC指纹图谱二，通过HPLC指纹图谱一和HPLC指纹图谱二共同组成了完整的脑栓通制剂的指纹图谱特征。本发明还公开了上述方法得到的HPLC指纹图谱在脑栓通制剂及其浸膏半成品检测中的应用。本发明采用不同流动相系统和不同检测波长，分别建立脑栓通制剂HPLC指纹图谱一和HPLC指纹图谱二，共同检出脑栓通制剂半成品和成品中的全部五味药材成分，以全面监控脑栓通制剂半成品和成品的质量，保证其质量的稳定、均一、可控。

Description

一种脑栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，特别涉及一种以天然植物药材原料制成的脑栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法及其应用。
背景技术
国际社会对药品的要求是“安全、有效、可控”。现行的中药质量标准，对中成药的质量控制是以传统的性状鉴别和显微鉴别确定真伪，以理化鉴别评价优劣，少数药味对其1~2个指标成分进行检测和控制。从传统中医药观点来看，检测任何一种活性成分均不能反映复方制剂所体现的整体疗效，中医辨证施治用的是药味而非某个化学成分。指纹图谱是基于对中药物质群整体作用的认识，借助于波谱和色谱等技术获得中药化学成分的光谱或色谱图，采用“共有峰”的方式来判断相似程度从而达到控制目的。可利用指纹图谱表达成品的质量、实现对工艺操作和原药材的质控；也可利用指纹追根溯源来寻找工艺操作中的问题和实现对原药材GAP的质量要求。
脑栓通制剂是中药复方制剂，由蒲黄、赤芍、郁金、天麻、漏芦五味药材组成，具有活血通络、祛风化痰的功效，用于风痰淤血痹阻脉络引起的缺血性中风病中经络急性期和恢复期。由于在脑栓通制剂的生产过程中，赤芍、郁金2味药材采用醇提工艺，蒲黄、天麻、漏芦3味药材采用水提醇沉工艺，故其成品中成分既有脂溶性成分又有水溶性成分，成分复杂，极性相差大。但目前脑栓通制剂的质量标准不完善，缺乏全面有效的质量控制方法，难以全面监控成品的质量、全面监控生产工艺的稳定性。现行质量标准“鉴别”项采用薄层色谱法对处方中的蒲黄、天麻、赤芍、漏芦4味药材进行鉴别，“含量测定”项采用高效液相色谱法测定臣药赤芍中芍药苷的含量，其不足之处在于：该标准操作繁琐，没有对郁金进行检测；单一测定方法给出信息少，没有对五味药材中的化学成分进行全面、系统的检测。
发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术中的不足，通过对脑栓通制剂HPLC指纹图谱构建方法的研究，提供一种有效可靠的脑栓通制剂的质量控制方法及其应用。
本发明的技术方案如下所述：本发明公开的脑栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法，包括构建脑栓通制剂HPLC指纹图谱一和脑栓通制剂HPLC指纹图谱二，通过HPLC指纹图谱一和HPLC指纹图谱二共同组成了完整的脑栓通制剂的指纹图谱特征。
所述脑栓通制剂HPLC指纹图谱一的构建方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：精密称取脑栓通制剂1.0g～10.0g，用甲醇提取，滤过，取滤液适量，蒸干，用甲醇配成脑栓通制剂供试品溶液一，优选用30%的甲醇溶液配制,；
(2)采用高效液相色谱法分析供试品溶液和对照品溶液，得到HPLC指纹图谱一，色谱条件为：进样量5～30μl；色谱柱为ODS C18，3μm；流动相为乙腈-四氢呋喃-磷酸水溶液；梯度洗脱；0～70分钟，流动相乙腈-四氢呋喃-磷酸水溶液由2:0:98渐变为20:10:70；柱温20°C；检测波长0～53min为254nm，于53min后将波长切换为275nm。
所述步骤（1）更具体为：取本品内容物适量，混匀，取约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。(1)精密量取续滤液20ml，减压回收溶剂至干，残渣加30%甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加30%甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，用0.45μm微孔滤膜滤过，作为成品供试品溶液一。
所述脑栓通制剂HPLC指纹图谱一利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统检测出27个共有色谱峰，归属于蒲黄的共有色谱峰有5个峰，分别为1号峰、3号峰、12号峰、20号峰、22号峰；归属于赤芍的共有色谱峰有10个峰，分别为5号峰、7号峰、11号峰、15号峰、16号峰、21号峰、23号峰、24号峰、25号峰、27号峰；归属于天麻的共有色谱峰有1个峰为6号峰；归属于漏芦的共有色谱峰有6个峰，分别为10号峰、13号峰、14号峰、18号峰、19号峰、26号峰6；归属于郁金的共有色谱峰有一个峰为9号峰，不归属于任何药材的共煎成分色谱峰有4个峰，分别为2号峰、4号峰、8号峰、17号峰。
所述脑栓通制剂HPLC指纹图谱一的构建方法还包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称取香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、芍药苷、天麻素、β-蜕皮甾酮适量，加甲醇使溶解，制成混合对照品溶液，其中香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、芍药苷、天麻素、β-蜕皮甾酮的浓度分别为0.01～3mg/ml；
（2）采用高效液相色谱法分析供对照品溶液，得到对照品指纹图谱，色谱条件为：进样量5～30μl；色谱柱为ODS C18，3μm；流动相为乙腈-四氢呋喃-磷酸水溶液；梯度洗脱；0～70分钟，流动相乙腈-四氢呋喃-磷酸水溶液由2:0:98渐变为20:10:70；柱温20°C；检测波长0～53min为254nm，于53min后将波长切换为275nm；
（3）利用DAD检测器和RRLC/MS/MS技术手段对HPLC指纹图谱一和对照品指纹图谱的色谱峰进行色谱峰归属及峰纯度检测，通过UV吸收曲线的比较确定：6号峰为天麻素、7号峰为没食子酸、11号峰为氧化芍药苷、13号峰为筋骨草素C、15号峰为芍药苷、18号峰为β-蜕皮甾酮、20号峰为香蒲新苷、21号峰为没食子酰基芍药苷或没食子酰基芍药内酯苷或二者的异构体、22号峰为异鼠李素-3-O-新橙皮苷、25号峰为苯甲酰氧芍药苷。
所述脑栓通制剂HPLC指纹图谱二的构建方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：精密称取脑栓通制剂1.0g～10.0g，用甲醇提取，滤过，取滤液适量，蒸干，适当净化，用甲醇配成脑栓通制剂供试品溶液二，优选用30%的甲醇溶液配制；
(2)采用高效液相色谱法分析上述供试品溶液，得到脑栓通制剂HPLC指纹图谱二，色谱条件为：进样量5～30μl；色谱柱为ODS C18，3μm；流动相为乙腈-磷酸水溶液；梯度洗脱；0～5分钟，流动相乙腈-磷酸水溶液由30:70渐变为55:45，5～20分钟流动相乙腈-磷酸水溶液为55:45；柱温25°C；检测波长390nm。
所述步骤（1）更具体为：取脑栓通制剂，混匀，取约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过,精密量取续滤液20ml，减压回收溶剂至干，残渣加50%三氯甲烷25ml振摇提取，分取水层，再用三氯甲烷25ml振摇提取，合并三氯甲烷提取液，回收三氯甲烷至干，残渣定量加入甲醇2ml，使完全溶解，离心，取上清液，用0.45μm微孔滤膜滤过，作为成品供试品溶液二。
所述脑栓通制剂HPLC指纹图谱二利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统检测出5个共有色谱峰，归属于郁金的共有色谱峰为5号峰。利用DAD检测器和RRLC/MS/MS技术手段对色谱峰进行峰归属：2号峰为去甲氧基姜黄素。
本发明还公开了利用上述脑栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法得到的HPLC指纹图谱在脑栓通制剂及其浸膏半成品检测中的应用。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明建立了脑栓通制剂的指纹图谱技术标准，通过指纹图谱中共有峰的有无及特征，有效地全面监控半成品和成品的质量，监控生产工艺的稳定性，保证其质量的稳定、均一、可控。
（2）本发明采用不同流动相系统和不同检测波长，分别建立脑栓通制剂指纹图谱一和指纹图谱二，共同检出复方中的全部五味药材成分。建立的指纹图谱可以全面监控原料药材、半成品和成品的质量，通过色谱指纹特征相似程度的比较，评价优劣、考察稳定性和一致性，弥补了现行质量控制方法的不足。
（3）本发明提高了脑栓通制剂成品、半成品的质量监控标准，有效的避免了产品伪造，保证该品种的正常生产、流通秩序；在本发明的基础上，可以开展指纹图谱信息与药效活性信息的相关性研究，从而深入地阐明产品的内在化学成分与该制剂疗效的相关性。
（4）本发明的方法还具有良好的可行性、稳定性和重现性。
附图说明
图1是本发明的脑栓通制剂HPLC指纹图谱一；
图2是本发明的脑栓通制剂HPLC指纹图谱二；
图3是混合对照品与脑栓通制剂剂HPLC指纹图谱一对应的色谱图，图中峰号6、15、18、20、22依次指示为天麻素，芍药苷，β-蜕皮甾酮，香蒲新苷，异鼠李素-3-O-新橙皮苷；
图4是脑栓通制剂、蒲黄药材、缺蒲黄阴性对照色谱图，图中从左到右的箭头所指为脑栓通制剂HPLC指纹图谱一中归属于蒲黄的色谱峰的峰号；
图5是脑栓通制剂、赤芍药材、缺赤芍阴性对照色谱图，图中从左到右的箭头所指为脑栓通制剂HPLC指纹图谱一中归属于赤芍的色谱峰的峰号；
图6是脑栓通制剂、天麻药材、缺天麻阴性对照色谱图，图中箭头所指为脑栓通制剂HPLC指纹图谱一中归属于天麻的色谱峰的峰号；
图7是脑栓通制剂、漏芦药材、缺漏芦阴性对照色谱图，图中从左到右的箭头所指为脑栓通制剂HPLC指纹图谱一中归属于漏芦的色谱峰的峰号；
图8是脑栓通制剂、郁金药材、缺郁金阴性对照色谱图，图中箭头所指为脑栓通制剂指纹HPLC图谱一中归属于郁金的色谱峰的峰号；
图9是脑栓通制剂、郁金药材、缺郁金阴性对照色谱图，图中箭头所指为脑栓通制剂HPLC指纹图谱二中归属于郁金的色谱峰的峰号。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明进行详细描述。
1、仪器与试药
1.1仪器：美国戴安公司Dionex Ultimate 3000DGLC高效液相色谱仪(DGP-3600SD 双三元泵、SRD-3600脱气机、WPS-3000SL自动进样器、TCC3000-RS柱温箱、PDA-3000检测器)；色谱柱：Ultimate AQ-C18(4.6×150mm，3μm)。
1.2试药：10批成品及对应的半成品，均由广东华南药业集团有限公司提供。实验中液相色谱所用试剂乙腈、四氢呋喃均为色谱纯，水为超纯水，其余所用试剂均为分析纯。
1.3对照品：
Figure BDA00002632626400061
Figure BDA00002632626400071
2、方法与结果
2.1脑栓通制剂HPLC指纹图谱一的构建方法
2.1.1溶液的制备
脑栓通制剂供试品溶液的制备：取脑栓通胶囊内容物适量，混匀，取2.5g，置具塞锥形瓶中，精密称定，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20ml，减压回收溶剂至干，残渣加30%甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加30%甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，用0.45μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液一，脑栓通胶囊内容物含量为0.1g/ml；
混合对照品溶液的制备：取香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、芍药苷、天麻素、β-蜕皮甾酮对照品适量，精密称定，加30%甲醇制成每1ml含香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、芍药苷、天麻素、β-蜕皮甾酮各0.1mg的混合溶液；
药材供试品溶液的制备：取上述各味药材粗粉，取样量分别为蒲黄5.56g，赤芍3.97g，郁金3.19g，天麻1.59g，漏芦2.38g，分别制备单一药材供试品溶液。分别按生产工艺的制法提取后，溶液减压蒸干，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20ml，减压回收溶剂至干，残渣加30%甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加30%甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，用0.45μm微孔滤膜滤过，作为药材供试品溶液，备用。
阴性供试品溶液的制备：分别取缺蒲黄阴性样品1.67g，缺赤芍阴性样品1.91g，缺郁金阴性样品2.02g，缺天麻阴性样品2.26g，缺漏芦阴性样品2.14g，按“脑栓通制剂供试品溶液的制备”项下方法操作，即得。
2.1.2高效液相色谱分析：精密吸取脑栓通制剂供试品溶液10μl，进样；色谱条件：色谱柱为Ultimate AQ-C18(4.6×150mm，3μm)；流动相为乙腈(A)-四氢呋喃(B)-0.05%磷酸溶液(C)，采用以下梯度洗脱方式：
检测波长：0～53min为254nm，于53min后将波长切换为275nm；流速：1.1ml/min；柱温：20°C；得到脑栓通制剂HPLC指纹图谱一，如图1所示。
2.1.3对照色谱图分析
对脑栓通制剂、混合对照品，以及单一药材和缺该药材的阴性供试品溶液药分别进行对照色谱图检测，如图3-图8所示。
其中图3是混合对照品与脑栓通制剂指纹图谱一对应的色谱图，图中峰号6、15、18、20、22依次指示为天麻素，芍药苷，β-蜕皮甾酮，香蒲新苷，异鼠李素-3-O-新橙皮苷。
图4是脑栓通制剂、蒲黄药材、缺蒲黄阴性对照色谱图，图中从左到右的箭头所指为脑栓通制剂指纹图谱一中归属于蒲黄的色谱峰的峰号。
图5是脑栓通制剂、赤芍药材、缺赤芍阴性对照色谱图，图中从左到右的箭头所指为脑栓通制剂指纹图谱一中归属于赤芍的色谱峰的峰号。
图6是脑栓通制剂、天麻药材、缺天麻阴性对照色谱图，图中箭头所指为脑栓通制剂指纹图谱一中归属于天麻的色谱峰的峰号。
图7是脑栓通制剂、漏芦药材、缺漏芦阴性对照色谱图，图中从左到右的箭头所指为脑栓通制剂指纹图谱一中归属于漏芦的色谱峰的峰号。
图8是脑栓通制剂、郁金药材、缺郁金阴性对照色谱图，图中箭头所指为脑栓通制剂指纹图谱一中归属于郁金的色谱峰的峰号。
2.1.4共有峰确定：将上述得到的10批脑栓通制剂的高效液相色谱指纹图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2009版)进行比较，确定27个共有特征峰并获得共有模式(参照指纹图谱)。所得的HPLC指纹图谱一检出与处方中蒲黄、赤芍、天麻、漏芦、郁金药材参照指纹图谱相同的色谱峰如下：归属于蒲黄的共有峰为1号峰、3号峰、12号峰、20号峰、22号峰五个峰，归属于赤芍的共有峰为5号峰、7号峰、11号峰、15号峰、16号峰、21号峰、23号峰、24号峰、25号峰、27号峰十个峰，归属于天麻的共有峰为6号峰一个峰，归属于漏芦的共有峰为10号峰、13号峰、14号峰、18号峰、19号峰、26号峰六个峰，归属于郁金的共有峰为9号峰一个峰，不归属于任何药材的共煎成分色谱峰为2号峰、4号峰、8号峰、17号峰四个峰。利用DAD检测器和RRLC/MS/MS技术手段对主要峰进行色谱峰归属及峰纯度检测，通过UV吸收曲线的比较，结合质谱的分子离子峰、裂解碎片信息鉴定：6号峰为天麻素、7号峰为没食子酸、11号峰为氧化芍药苷、13号峰为筋骨草素C、15号峰为芍药苷、18号峰为β-蜕皮甾酮、20号峰为香蒲新苷、21号峰为没食子酰基芍药苷/没食子酰基芍药内酯苷或其异构体、22号峰为异鼠李素-3-O-新橙皮苷、25号峰为苯甲酰氧芍药苷。以上色谱峰构成了脑栓通制剂HPLC指纹图谱一的指纹特征。
以15号峰芍药苷为参照物峰，脑栓通胶囊HPLC指纹图谱一共有峰的相对保留值列表如下：
Figure BDA00002632626400091
Figure BDA00002632626400101
2.1.5精密度试验：取同一脑栓通制剂供试品溶液一，连续进样6次，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2009版)进行评价，相似度均大于0.99，表明仪器的精密度良好。
相似度结果如下：
精密度1 精密度2 精密度3 精密度4 精密度5 精密度6 对照指纹图谱
精密度1 1.000 0.997 0.988 0.988 0.990 0.993 0.996
精密度2 0.997 1.000 0.992 0.990 0.990 0.997 0.997
精密度3 0.988 0.992 1.000 0.998 0.996 0.992 0.997
精密度4 0.988 0.990 0.998 1.000 0.997 0.990 0.997
精密度5 0.990 0.990 0.996 0.997 1.000 0.991 0.997
精密度6 0.993 0.997 0.992 0.990 0.991 1.000 0.997
对照指纹图谱 0.996 0.997 0.997 0.997 0.997 0.997 1.000
2.1.6稳定性考察：取同一脑栓通制剂供试品溶液一，分别在放置0、2、4、8、10、24、48小时进样，检测指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2009版)进行评价，相似度均大于0.99，表明供试品溶液放置48小时内稳定。
相似度结果如下：
S1(0h) S2(2h) S3(4h) S4(8h) S5(12h) S6(24h) S7(48h) 对照指纹图谱
S1(0h) 1.000 0.997 0.988 0.990 0.988 0.990 0.987 0.994
S2(2h) 0.997 1.000 0.992 0.990 0.991 0.991 0.990 0.996
S3(4h) 0.988 0.992 1.000 0.996 0.997 0.995 0.997 0.998
S4(8h) 0.990 0.990 0.996 1.000 0.997 0.998 0.996 0.998
S5(12h) 0.988 0.991 0.997 0.997 1.000 0.997 0.998 0.998
S6(24h) 0.990 0.991 0.995 0.998 0.997 1.000 0.995 0.998
S7(48h) 0.987 0.990 0.997 0.996 0.998 0.995 1.000 0.998
对照指纹图谱 0.994 0.996 0.998 0.998 0.998 0.998 0.998 1.000
2.17重复性试验：取同一批脑栓通制剂6份，按供试品溶液制备项下方法操作，分别进样，检测指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2009版)进行评价，相似度均大于0.99，表明方法重复性好。
相似度结果如下：
S1 S2 S3 S4 S5 S6 对照指纹图谱
S1 1.000 0.997 0.992 0.996 0.996 0.995 0.998
S2 0.997 1.000 0.998 0.998 0.996 0.996 0.999
S3 0.992 0.998 1.000 0.996 0.993 0.993 0.997
S4 0.996 0.998 0.996 1.000 0.999 0.994 0.999
S5 0.996 0.996 0.993 0.999 1.000 0.994 0.998
S6 0.995 0.996 0.993 0.994 0.994 1.000 0.997
对照指纹图谱 0.998 0.999 0.997 0.999 0.998 0.997 1.000
2.1.8中间精密度：精密称取同一批号的脑栓通制剂，分别在不同日期、不同分析人员、不同仪器等变动因素条件下，依法测定，检测指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2009版)进行评价。表明该方法中间精密度好，脑栓通制剂HPLC指纹图谱一质量控制方法可行。
(1)不同分析时间：取同一批号的脑栓通制剂，分别于不同日期按“供试品溶液的制备”项下方法操作，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2009版)进行评价，相似度均大于0.99。
相似度结果如下：
分析时间1 分析时间2 对照指纹图谱
分析时间1 1.000 0.970 0.992
分析时间2 0.970 1.000 0.993
对照指纹图谱 0.992 0.993 1.000
(2)不同分析人员：取同一批号的脑栓通制剂，不同人员分别按“供试品溶液的制备”项下方法操作，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2009版)进行评价，相似度均大于0.99。
相似度结果如下：
分析人员1 分析人员2 对照指纹图谱
分析人员1 1.000 0.997 0.999
分析人员2 0.997 1.000 0.999
对照指纹图谱 0.999 0.999 1.000
2.2脑栓通制剂HPLC指纹图谱二的构建方法
2.2.1溶液的制备
脑栓通制剂供试品溶液的制备：取本品内容物适量，研细，取约2.5g，置具塞锥形瓶中，精密称定，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20ml，减压回收溶剂至干，残渣加50%三氯甲烷25ml振摇提取，分取水层，再用三氯甲烷25ml振摇提取，合并三氯甲烷提取液，回收三氯甲烷至干，残渣定量加入甲醇2ml，使完全溶解，离心，取上清液，用0.45μm微孔滤膜滤过，作为成品供试品溶液二(0.5g/ml)；
药材供试品溶液的制备：取郁金药材粗粉3.19g，按生产工艺的制法提取后，溶液减压蒸干，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20ml，减压回收溶剂至干，残渣加50%三氯甲烷25ml振摇提取，分取水层，再用三氯甲烷25ml振摇提取，合并三氯甲烷提取液，回收三氯甲烷至干，残渣定量加入甲醇2ml，使完全溶解，离心，取上清液，用0.45μm微孔滤膜滤过，作为药材供试品溶液，备用。
阴性供试品溶液的制备：取缺郁金阴性样品2.02g，按“脑栓通制剂供试品溶液的制备”项下方法操作，即得。
2.2.2高效液相色谱分析：精密吸取供试品溶液10μl，进样；色谱条件：色谱柱为Ultimate AQ-C18(4.6×150mm，3μm)；流动相为乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B)，采用以下梯度洗脱方式：
Figure BDA00002632626400131
检测波长：390nm；流速：1.0ml/min；柱温：25°C；得到脑栓通制剂HPLC指纹图谱二，如图2所示。
2.2.3对照色谱检测
图9为脑栓通制剂、郁金药材、缺郁金阴性对照色谱图，图中箭头所指为脑栓通制剂指纹图谱二中归属于郁金的色谱峰的峰号。
2.2.4共有峰确定：将上述得到的10批脑栓通制剂HPLC指纹图谱二经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2009版)进行比较，确定5个共有特征峰并获得共有模式(参照指纹图谱)。所得的色谱图应检出与处方中郁金药材参照指纹图谱相同的色谱峰如下：归属于郁金的共有峰为5号峰一个峰；利用DAD检测器和RRLC/MS/MS技术手段对色谱峰进行峰归属：2号峰为去甲氧基姜黄素。以上色谱峰构成了脑栓通制剂HPLC指纹图谱一的指纹特征。
以2号峰去甲氧基姜黄素为参照物峰，脑栓通胶囊指纹图谱二共有峰的相对保留值列表如下：
峰号 相对保留值 归属药材 色谱峰成分名称
1 0.3 - -
2 1.0 郁金 去甲氧基姜黄素
3 1.3 - -
4 1.6 - -
5 1.8 郁金 -
2.2.5精密度试验：取同一脑栓通制剂供试品溶液二，连续进样6次，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2009版)进行评价，各检测波长下的相似度均大于0.999，表明仪器的精密度良好。
相似度结果如下：
精密度1 精密度2 精密度3 精密度4 精密度5 精密度6 对照指纹图谱
精密度1 1.000 0.998 0.998 0.998 0.998 0.998 0.999
精密度2 0.998 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
精密度3 0.998 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
精密度4 0.998 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
精密度5 0.998 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
精密度6 0.998 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
对照指纹图谱 0.999 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
2.2.6稳定性考察：取同一脑栓通制剂供试品溶液二，分别在0、2、4、8、10、24、48小时进样，检测指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2009版)进行评价，相似度均大于0.999，表明供试品溶液放置48小时内稳定。相似度结果如下：
S1(0h) S2(2h) S3(4h) S4(8h) S5(12h) S6(24h) S7(48h) 对照指纹图谱
S1(0h) 1.000 0.998 0.998 0.997 0.997 0.999 0.999 0.999
S2(2h) 0.998 1.000 1.000 1.000 0.999 0.998 0.999 1.000
S3(4h) 0.998 1.000 1.000 1.000 0.999 0.997 0.999 1.000
S4(8h) 0.997 1.000 1.000 1.000 1.000 0.997 0.999 1.000
S5(12h) 0.997 0.999 0.999 1.000 1.000 0.997 0.998 0.999
S6(24h) 0.999 0.998 0.997 0.997 0.997 1.000 0.999 0.999
S7(48h) 0.999 0.999 0.999 0.999 0.998 0.999 1.000 1.000
对照指纹图谱 0.999 1.000 1.000 1.000 0.999 0.999 1.000 1.000
2.2.7重复性试验：取同一批脑栓通制剂6份，按供试品溶液制备项下方法操作，分别进样，检测指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2009版)进行评价，相似度均大于0.92，表明方法重复性好。
相似度结果如下：
S1 S2 S3 S4 S5 S6 对照指纹图谱
S1 1.000 0.993 0.997 0.988 0.942 0.988 0.998
S2 0.993 1.000 0.988 0.971 0.969 0.971 0.990
S3 0.997 0.988 1.000 0.996 0.925 0.995 1.000
S4 0.988 0.971 0.996 1.000 0.887 1.000 0.995
S5 0.942 0.969 0.925 0.887 1.000 0.887 0.928
S6 0.988 0.971 0.995 1.000 0.887 1.000 0.995
对照指纹图谱 0.998 0.990 1.000 0.995 0.928 0.995 1.000
2.2.8中间精密度：精密称取同一批号的脑栓通制剂，分别在不同日期、不同分析人员、不同仪器等变动因素条件下，依法测定，检测指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2009版)进行评价。表明该方法中间精密度好，脑栓通制剂HPLC指纹图谱二质量控制方法可行。
(1)不同分析时间：取同一批号的脑栓通制剂，分别于不同日期按“供试品溶液的制备”项下方法操作，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2009版)进行评价，相似度均大于0.99。
相似度结果如下：
分析时间1 分析时间2 对照指纹图谱
分析时间1 1.000 0.988 0.995
分析时间2 0.988 1.000 0.999
对照指纹图谱 0.995 0.999 1.000
(2)不同分析人员：取同一批号的脑栓通制剂，不同人员分别按“供试品溶液的制备”项下方法操作，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2009版)进行评价，相似度均大于0.99。
相似度结果如下：
分析人员1 分析人员2 对照指纹图谱
分析人员1 1.000 0.991 0.999
分析人员2 0.991 1.000 0.996
对照指纹图谱 0.999 0.996 1.000
本发明采用不同流动相系统和不同检测波长，分别建立脑栓通制剂指纹图谱一和指纹图谱二，共同检出复方中的全部五味药材成分。
本发明不但可以利用上述脑栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法应用到脑栓通制剂的质量检测中，还可以应用到脑栓通制剂浸膏半成品检测中，有效地全面监控半成品和成品的质量，监控生产工艺的稳定性，保证其质量的稳定、均一、可控。
综上所述，尽管本发明通过具体实施方式对本发明进行了详细描述，但本领域一般技术人员应该明白的是，上述实施例仅仅是对本发明的优选实施例的描述，而非对本发明保护范围的限制，本领域一般技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化，均在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种脑栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于：包括构建脑栓通制剂HPLC指纹图谱一和脑栓通制剂HPLC指纹图谱二，通过HPLC指纹图谱一和HPLC指纹图谱二共同组成了完整的脑栓通制剂的指纹图谱特征。
2.如权利要求1所述的脑栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于所述脑栓通制剂HPLC指纹图谱一的构建方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：精密称取脑栓通制剂1.0g～10.0g，用甲醇提取，滤过，取滤液适量，蒸干，用甲醇配成脑栓通制剂供试品溶液一；
(2)采用高效液相色谱法分析供试品溶液，得到HPLC指纹图谱一，色谱条件为：进样量5～30μl；色谱柱为ODS C18，3μm；流动相为乙腈-四氢呋喃-磷酸水溶液；梯度洗脱；0～70分钟，流动相乙腈-四氢呋喃-磷酸水溶液由2:0:98渐变为20:10:70；柱温20°C；检测波长0～53min为254nm，于53min后将波长切换为275nm。
3.如权利要求2所述的脑栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述脑栓通制剂HPLC指纹图谱一利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统检测出27个共有色谱峰，归属于蒲黄的共有色谱峰有5个峰，分别为1号峰、3号峰、12号峰、20号峰、22号峰；归属于赤芍的共有色谱峰有10个峰，分别为5号峰、7号峰、11号峰、15号峰、16号峰、21号峰、23号峰、24号峰、25号峰、27号峰；归属于天麻的共有色谱峰有1个峰为6号峰；归属于漏芦的共有色谱峰有6个峰，分别为10号峰、13号峰、14号峰、18号峰、19号峰、26号峰6；归属于郁金的共有色谱峰有1个峰为9号峰，不归属于任何药材的共煎成分色谱峰有4个峰，分别为2号峰、4号峰、8号峰、17号峰。
4.如权利要求2所述脑栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于所述脑栓通制剂HPLC指纹图谱一的构建方法还包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称取香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、芍药苷、天麻素、β-蜕皮甾酮适量，加甲醇使溶解，制成混合对照品溶液，其中香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、芍药苷、天麻素、β-蜕皮甾酮的浓度分别为0.01～3mg/ml；
（2）采用高效液相色谱法分析供对照品溶液，得到对照品指纹图谱，色谱条件为：进样量5～30μl；色谱柱为ODS C18，3μm；流动相为乙腈-四氢呋喃-磷酸水溶液；梯度洗脱；0～70分钟，流动相乙腈-四氢呋喃-磷酸水溶液由2:0:98渐变为20:10:70；柱温20°C；检测波长0～53min为254nm，于53min后将波长切换为275nm；
（3）利用DAD检测器和RRLC/MS/MS技术手段对HPLC指纹图谱一和对照品指纹图谱的色谱峰进行色谱峰归属及峰纯度检测，通过UV吸收曲线的比较确定：6号峰为天麻素、7号峰为没食子酸、11号峰为氧化芍药苷、13号峰为筋骨草素C、15号峰为芍药苷、18号峰为β-蜕皮甾酮、20号峰为香蒲新苷、21号峰为没食子酰基芍药苷或没食子酰基芍药内酯苷或二者的异构体、22号峰为异鼠李素-3-O-新橙皮苷、25号峰为苯甲酰氧芍药苷。
5.如权利要求1所述的脑栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于所述脑栓通制剂HPLC指纹图谱二的构建方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：精密称取脑栓通制剂1.0g～10.0g，用甲醇提取，滤过，取滤液适量，蒸干，适当净化，用甲醇配成脑栓通制剂供试品溶液二；
(2)采用高效液相色谱法分析上述供试品溶液，得到脑栓通制剂HPLC指纹图谱二，色谱条件为：进样量5～30μl；色谱柱为ODS C18，3μm；流动相为乙腈-磷酸水溶液；梯度洗脱；0～5分钟，流动相乙腈-磷酸水溶液由30:70渐变为55:45，5～20分钟流动相乙腈-磷酸水溶液为55:45；柱温25°C；检测波长390nm。
6.如权利要求5所述脑栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述脑栓通制剂HPLC指纹图谱二利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统检测出5个共有色谱峰，归属于郁金的共有色谱峰为5号峰。
7.如权利要求6所述脑栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于：利用DAD检测器和RRLC/MS/MS技术手段对色谱峰进行峰归属：2号峰为去甲氧基姜黄素。
8.如权利要求2或5所述脑栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于：配制供试品溶液和对照品溶液的所用的甲醇浓度为30%。
9.利用权利要求1所述脑栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法得到的HPLC指纹图谱在脑栓通制剂及其浸膏半成品检测中的应用。
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