CN102608248B - 热淋清颗粒和头花蓼的薄层色谱指纹图谱的测定方法 - Google Patents
热淋清颗粒和头花蓼的薄层色谱指纹图谱的测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及热淋清颗粒和头花蓼的薄层色谱指纹图谱的测定方法。该方法是照薄层色谱法测定，包括以下步骤：(a)薄层点样液制备：热淋清颗粒或者头花蓼药材用水超声处理，用乙酸乙酯萃取，得头花蓼供试品溶液；(b)薄层层析：采用聚酰胺薄层板，取上述供试品溶液和对照品溶液点样于薄层板上，用体积比为7∶6.5∶2.5∶3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作为展开剂进行展开；(c)显色：向挥干的薄层板上喷以显色液AlCl3试液，挥尽薄层板上的残余溶剂，置320nm的紫外光灯下检视荧光薄层色谱，即得。本发明方法为热淋清颗粒和头花蓼的质量监测和评价提供了一种有效的新途径。
Description
技术领域
本发明涉及中药领域，特别涉及中药质量评价领域，具体涉及一种热淋清颗粒及其原料药材头花蓼的质量评价方法，特别涉及热淋清颗粒及其原料药材头花蓼指纹图谱的测定方法，更特别地具体涉及一种通过薄层色谱指纹图谱对热淋清颗粒及不同产地头花蓼进行质量评价的方法。
背景技术
头花蓼为蓼科植物头花蓼Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don的干燥全草或地上部分，收载于《贵州省中药材民族药材质量标准》2003年版，具清热利湿、抗菌消炎、利尿通淋等功效(贵州省食品药品监督管理局.贵州省中药材民族药材质量标准[M].贵阳：贵州科技出版社，2003：147)。
头花蓼是贵州常用苗药，是贵州省中药现代化重点发展的“六大苗药”和重点培育发展的“七大中药产业链”的品种之一。本发明的申请人已在贵州施秉及贵阳乌当区建立了头花蓼规范化种植基地，并通过国家GAP认证。
现在有关头花蓼GAP种植及化学成分等方面的研究已取得一定成果(孙长生，韩见宇，杨锦纲，等.头花蓼GAP种植基地的环境质量评价[J].中药研究与信息，2005，7(2)：27～30)，但头花蓼药材现行质量标准较为简单，仅以单一成分槲皮素为指标进行评价，无法达到真实、全面反应药材内在品质的目的。
CN101091749A公开了一种头花蓼药材、提取物及其质量控制方法，其中的头花蓼药材具有如HPLC指纹图谱，含有13个特征峰，其中色谱条件为：色谱柱：依利特HYPERSIL ODS色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；柱温：25℃；流动相：乙腈(A)-0.4％磷酸(B)溶液二元梯度洗脱，重量百分比为：0-30％∶100-70％；流速：0.8mL·min-1；检测波长：310nm；进样量20μL。该发明质控制方法对不同产地头花蓼进行了考察比较，构建了头花蓼HPLC 的指纹图谱。
CN102296118A公开了一种DNA分子标记鉴别技术鉴别头花蓼与尼泊尔蓼的方法，在该发明中，以贵州具有代表性的民族药头花蓼为研究对象，探索使用RAPD分析方法对头花蓼与尼泊尔蓼进行遗传多样性分析；并在RAPD的实验基础上，将RAPD方法转化为SCAR标记，为头花蓼与尼泊尔蓼的药材鉴定提供了准确可靠、快速稳定的方法。DNA分子标记鉴别技术同样不适合药材的常规质量评价和控制。
中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱对于有效控制中药材或中成药的质量具有重要的意义。日本汉方药主要生产企业在20世纪80年代就已经在企业内部采用高效液相指纹图谱控制质量。德国、法国在对银杏叶提取物联合开发的过程中，发现银杏叶提取物的医疗作用是提取物所得物质群的整体作用结果，而对这样一个整体的质量控制，亦采用高效液相指纹图谱方法。美国FDA最近几年制定的植物草药指南中已经明确把指纹图谱作为混合物质群的质量控制方法(FDA.Guidance of Industy：Botanical Drug(Draft).2000August)。随着研究的深入，人们发现，作为中医理论的实践产物，中药，尤其是复方中药，其中所含的任一成分都不能代表其整体疗效。人们逐渐认识到，现行的参照西药(合成药)质量控制模式的质量标准不能恰当地反映中药内在的质量。从发展趋势看，从现行的质量控制模式向一种综合的、宏观的、可量化的鉴别与主要有效成分含量测定结合已是发展的趋势。
中药质量评价的现行标准是利用光谱或色谱手段鉴别和测定某一种或几种有效成分、活性成分或指标成分，以及药典规定的常规检查项目。显然，这些质量标准的设置是模仿了化学药品的模式。其它国家如英国、印度、美国草药典、日本药局方中的汉药及德国Commission E编辑的德国草药专论等也采用了基本相同的内容。对于化学药品而言，其药效成分为结构清晰的单一化合物，构效关系明确，其含量和纯度直接表达其有效及安全性。然而，中医用药的特点是复方配伍，任何单一的有效或活性成分的含量高低均不能表达其整体的疗效。例如，黄芪所含的黄芪甲苷(aastraga loside IV)是当前被选择为质量标准的鉴别和含量测定的最为常见的目标，但并没有依据证明黄芪甲苷与黄芪的功能主治的明确联系。同样，黄连、黄柏、三棵针均含小檗碱，一般都以它作为检测的目标，但是三者的功能主治却截然不同。复方制剂的情况就更加复杂。中医这种不是一对一的非线性的理论和实践说明中药质量应该采用某种宏观的综合的质量评价手段。
然而就头花蓼药材的质量评价，例如就产地差异对头花蓼药材进行质量评价，或者对药材的真伪进行鉴别，以及就由头花蓼制备得到的提取物或者制剂，例如热淋清颗粒，迄今为止尚无一从整体上控制样品质量的适用的常规检验方法。因此，本领域仍然需要有一从整体上控制头花蓼药材提取物或者制剂例如热淋清颗粒质量评价的方法，特别是可以用于头花蓼药材真伪鉴别以及药材、提取物或制剂简便、宏观、可行的质量判定方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适合常规使用的用于热淋清颗粒及其原料药材头花蓼质量评价的方法，特别是可以用于热淋清颗粒及其头花蓼药材真伪鉴别和/或初步质量判定的方法。本发明人发现采用一种独特的薄层色谱法(TLC)方法可以有效地实现至少一个上述的目的，该方法可以有效地为客观、准确地评价热淋清颗粒及其头花蓼药材的品质，为热淋清颗粒及头花蓼药材质量标准提升以及头花蓼药材优良种源选育、规范化生产提供参考依据。本发明基于此发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了一种头花蓼药材指纹图谱的测定方法，其是照薄层色谱法测定，包括以下步骤：
(a)薄层点样液制备：称取头花蓼药材粉末，加水超声处理，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酸萃取液蒸干，残渣用乙酸乙酯使溶解，作为头花蓼供试品溶液；以及任选地分别制备芦丁、槲皮苷和没食子酸的对照品溶液；
(b)薄层层析：采用聚酰胺薄层板，取上述供试品溶液和任选的对照品溶液点样于薄层板上，用体积比为7∶6.5∶2.5∶3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作为展开剂进行展开；
(c)显色：向挥干的薄层板上喷以显色液AlCl3试液，挥尽薄层板上的残余溶剂，置320nm的紫外光灯下检视荧光薄层色谱，得到头花蓼药材的指纹图谱。
在本发明中，所述“薄层色谱法”的一般操作规范可以不作限定。在第一方面方法的一个实施方案中，所述的薄层色谱法可以是记载于包括但不限于下列文件中的方法：中华人民共和国药典2010年版一部附录VI B、中华人民共和国药典2010年版二部附录VB、中华人民共和国药典2005年版一部附录VI B、中华人民共和国药典2005年版二部附录VB等。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中，所述头花蓼供试品溶液是用如下方法配制的：取头花蓼药材粉末，至容量瓶中，加水适量，超声处理，放冷，用水定容至刻度，滤过，滤液用乙酸乙酯萃取，使乙酸乙酯液蒸干，残渣加乙酸乙酯使溶解，即得供试品溶液。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中超声处理是以功率250W、频率33kHz的条件超声处理15～60min，优选20～40min，例如约30min。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中，所述头花蓼供试品溶液是用如下方法配制的：取头花蓼药材粉末2g，至25mL容量瓶中，加水25mL，以功率250W、频率33kHz超声处理30min，放冷，用水定容至刻度，滤过，滤液用乙酸乙酯萃取3次，每次25mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加5mL乙酸乙酯使溶解，即得供试品溶液。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中，还包括分别制备芦丁、槲皮苷和没食子酸的对照品溶液的操作，其步骤是：分别精密称取干燥至恒重的芦丁、槲皮苷、没食子酸对照品适量，用甲醇制成浓度分别为0.5±0.05mg/mL、0.1±0.02mg/mL、0.1±0.02mg/mL的对照品溶液。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，点样液的体积为2～10μL，优选2～6μL，例如4μL，例如5μL。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，点样液点样于距薄层板底边10mm处。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，展开距离为7～15cm，例如7～12cm，例如7～10cm，优选8cm。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，使用体积比为7∶6.5∶2.5∶3 的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液进行二次展开。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述展开是在双槽展开箱的一侧加入上述展开溶剂进行预平衡，温度20℃，相对湿度至小于88％(优选小于72％，更优选小于50％)的条件下进行的。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)是以如下方式操作的：采用聚酰胺薄层板，取供试品溶液、对照品溶液各4μL，用半自动点样仪点于距薄层板底边10mm处；用体积比为7∶6.5∶2.5∶3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作为展开剂；在温度20℃、相对湿度至小于88％的条件下于双槽展开箱的一侧加入上述展开溶剂预平衡15min，上行展开，展距8cm；用体积比为7∶6.5∶2.5∶3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作为展开剂进行二次展开，即可。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)中，所述检视可以是肉眼观察、照相处理和/或扫描仪扫描。照相处理和/或扫描仪扫描可以容易获得展开的薄层板上的斑点和色谱峰，对于进一步对结果进行评价是有益的。
根据本发明第一方面的方法，其中还包括步骤(d)对薄层色谱图进行分析：包括5个共有峰/斑点的薄层色谱指纹图谱所对应的药材可初步判定为头花蓼药材正品，无5个共有峰/斑点则可判定为伪品。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(d)中，如果药材的第3、4号峰/斑点与芦丁显示的峰/斑点对应，则可初步判定该药材为头花蓼药材正品，否则可判定为伪品。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(d)中，如果药材的第4号峰/斑点与槲皮苷显示的峰/斑点对应，则可初步判定该药材为头花蓼药材正品，否则可判定为伪品。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(d)中，如果药材的第3、4号峰/斑点与芦丁显示的峰/斑点对应，并且第4号峰/斑点与槲皮苷显示的峰/斑点对应，则可初步判定该药材为头花蓼药材正品，否则可判定为伪品。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(d)中，相同取样量、相同点样量的条件下，如果某批次药材的5个共有峰/斑点强度与同时展开的其它批次药材相比更强，则表明该批次药材质量比其它批次药材更好。
由于本发明第一方面的方法中制备供试液时是使用水为溶剂作为提取 液，而现有的头花蓼制剂以及制备该制剂的头花蓼提取物多是使用水或者含水乙醇作为溶剂提取得到，因此本发明第一方面的方法在供试品溶液的制备过程中作微小的变化即可适用于现有的头花蓼制剂以及制备该制剂的头花蓼提取。例如，中国药典2010年版收载的热淋清颗粒，其制备方法中记载了头花蓼的提取方法，使用该方法，由药材提取至获得浸膏(即头花蓼提取物)，加上适量淀粉和/或蔗糖可以进一步制成无糖型或者含糖型的热淋清颗粒。此外，市售的热淋清片、胶囊剂等头花蓼制剂，它们均是用或者类似地用中国药典2010年版收载的热淋清颗粒所记载的头花蓼提取方法获得浸膏，再加入常规药用辅料制备成片剂和胶囊剂，这些常规药用辅料通常在本发明TLC方法下不会显示色谱斑点，因此，在本发明的一个实施方案中，术语“头花蓼制剂”，其在为实现本发明目的的意义方面，其含义与头花蓼提取物、热淋清颗粒、热淋清片、热淋清胶囊等术语等同(即这些样品均适合使用本发明方法来测定薄层色谱指纹图谱)。
因此，本发明第二方面提供了一种头花蓼制剂(例如热淋清颗粒)以及制备该制剂的头花蓼提取物的指纹图谱的测定方法，其是照薄层色谱法测定，包括以下步骤：
(a)薄层点样液制备：称取头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物，用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酸萃取液蒸干，残渣用乙酸乙酯使溶解，作为供试品溶液；以及任选地分别制备芦丁、槲皮苷和没食子酸的对照品溶液；
以及如本发明第一方面任一实施方案所述的步骤(b)、步骤(c)、和任选的步骤(d)。
根据本发明第二方面的方法，其包括以下步骤：
(a)薄层点样液制备：称取头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物，用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酸萃取液蒸干，残渣用乙酸乙酯使溶解，作为供试品溶液；以及任选地分别制备芦丁、槲皮苷和没食子酸的对照品溶液；
(b)薄层层析：采用聚酰胺薄层板，取上述供试品溶液和任选的对照品溶液点样于薄层板上，用体积比为7：6.5∶2.5∶3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作为展开剂进行展开；
(c)显色：向挥干的薄层板上喷以显色液AlCl3试液，挥尽薄层板上的残余溶剂，置320nm的紫外光灯下检视荧光薄层色谱，得到头花蓼制剂或 者制备该制剂的头花蓼提取物的指纹图谱。
根据本发明第二方面的方法，其中所述步骤(a)中还任选地包括在萃取之前用水溶解所述头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物的步骤。在此溶解步骤之后再如步骤(a)所述用乙酸乙酯进行萃取。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(a)中，所述供试品溶液是用如下方法配制的：取头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物，至容量瓶中，加水溶解，用水定容至刻度，滤过，滤液用乙酸乙酯萃取，使乙酸乙酯液蒸干，残渣加乙酸乙酯使溶解，即得供试品溶液。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(a)中，还包括分别制备芦丁、槲皮苷和没食子酸的对照品溶液的操作，其步骤是：分别精密称取干燥至恒重的芦丁、槲皮苷、没食子酸对照品适量，用甲醇制成浓度分别为0.5±0.05mg/mL、0.1±0.02mg/mL、0.1±0.02mg/mL的对照品溶液。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(b)中，点样液的体积为2～10μL，优选2～6μL，例如4μL，例如5μL。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(b)中，点样液点样于距薄层板底边10mm处。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(b)中，展开距离为7～15cm，例如7～12cm，例如7～10cm，优选8cm。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(b)中，使用体积比为7∶6.5∶2.5∶3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液进行二次展开。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(b)中，所述展开是在双槽展开箱的一侧加入上述展开溶剂进行预平衡，温度20℃，相对湿度至小于88％(优选小于72％，更优选小于50％)的条件下进行的。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(b)是以如下方式操作的：采用聚酰胺薄层板，取供试品溶液、对照品溶液各4μL，用半自动点样仪点于距薄层板底边10mm处；用体积比为7∶6.5∶2.5∶3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作为展开剂；在温度20℃、相对湿度至小于88％的条件下于双槽展开箱的一侧加入上述展开溶剂预平衡15min，上行展开，展距8cm；用体积比为7∶6.5∶2.5∶3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作为展开剂进行二次展开，即可。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(c)中，所述检视可以是肉眼观察、照相处理和/或扫描仪扫描。照相处理和/或扫描仪扫描可以容易获得展开的薄层板上的斑点和色谱峰，对于进一步对结果进行评价是有益的。
根据本发明第二方面的方法，其中还包括步骤(d)对薄层色谱图进行分析：包括5个共有峰/斑点的薄层色谱指纹图谱所对应的药材可初步判定为该头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物正常，无5个共有峰/斑点则可判定为该头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物异常。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(d)中，如果该头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物的第3、4号峰/斑点与芦丁显示的峰/斑点对应，则可初步判定该头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物正常，否则可判定异常。基于此方法的结果可采用其它方法作进一步验证产品内在质量。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(d)中，如果该头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物的第4号峰/斑点与槲皮苷显示的峰/斑点对应，则可初步判定该头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物正常，否则可判定异常。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(d)中，如果该头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物的第3、4号峰/斑点与芦丁显示的峰/斑点对应，并且第4号峰/斑点与槲皮苷显示的峰/斑点对应，则可初步判定该头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物正常，否则可判定异常。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(d)中，如果某批次头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物的在相同取样量、相同点样量的条件下，5个共有峰/斑点强度与同时展开的其它批次头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物相比更强，则表明该批次头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物质量比其它批次头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物更好。
本发明任一方面的任一实施方案所具有的特征同样适用于该方面的其它任一实施方案以及其它方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾；当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用 的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
在本发明中，提及％时，如未另外说明，是指重量/重量百分数。
在本发明中，提及展开剂混合液时，它们的比率是以体积比表示的。
使用本发明的方法，表明头花蓼药材薄层色谱由5个共有峰构成了薄层色谱指纹图谱的基本骨架，通过对照品实验，确定3、4号峰为芦丁，4号峰为槲皮苷；由于以上共有峰各批药材均含有，因此上述共有峰应作为头花蓼药材鉴定的特征性成分。同一产地不同批次和不同产地头花蓼样品的药材质量的差异，可以从这几个峰的斑点颜色深度得到反映。贵州施秉产12批头花蓼药材样品中这几个斑点深度相似及峰面积大小相当，说明这12批样品相似性较大，品质差异小；不同产地样品相似性较大，但斑点深度略浅及峰面积差异较大，表明品质差异较大；头花蓼的伪品赤惊散没有上述5个共有峰，表明本发明的色谱条件和方法可以将伪品区别。
因此头花蓼药材和热淋清颗粒的五个峰可以作为特征峰用于头花蓼药材的真伪鉴别以及制剂质量控制。各样品在峰高上存在差异，反映了样品中某些化学成分上有量的差异；但峰形一致，体现了它们在质上没有大的差别。
在本发明的一个实施方案中，头花蓼药材薄层色谱指纹图谱测定条件确定为：以水为提取溶剂，超声处理，乙酸乙酯萃取后为提取溶剂；以正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸(7∶6.5∶2.5∶3)作为展开剂，二次展开，预平衡15min，上行展开；展距：8cm；温度20℃，控制相对湿度至32％～72％。用三氯化铝试液显色。挥尽溶剂后置紫外光灯(320nm)下检视荧光薄层色谱。本发明的结果显示，贵州施秉产的12批头花蓼药材的薄层色谱图和轮廓图十分相似，均有5个斑点和对应的5个峰；对于不同产地的药材而言，各峰在峰强度上有差异，体现了不同产地头花蓼所含化学成分在量上有差别。此外，头花蓼的伪品赤惊散没有上述特征，说明本发明方法可以很好的区分头花蓼伪品，可以用于头花蓼药材的真伪鉴别。
本发明的薄层色谱指纹图谱法不仅能反映头花蓼药材的特征性成分，也能反映不同来源药材之间的差异，还可以用于鉴别药材的真伪；同时该 方法简单易于操作，便于推广应用。可用于采购及生产中的快速检验。
附图说明
图1描绘的是头花蓼药材不同提取溶剂、不同展开系统薄层色谱图(320nm)，S1至S7的七个薄层色谱图中，从左至右显示的八个试样展开带分别为：1～6.头花蓼不同溶剂提取液(1.乙酸乙酯；2.乙醇；3.甲醇；4.丙酮；5.正丁醇；6.水提乙酸乙酯萃取)；7.芦丁；8.槲皮苷。展开剂运行方向：上行(在开发明中，如未另外说明，展开剂运行方向均为上行)。
图2描绘了点样时的相对湿度(RH，32％和88％)对头花蓼药材和热淋清颗粒薄层层析行为的影响(320nm)，图中四条展开带中从左至右依次是：1.头花蓼样品；2。热淋清颗粒样品；3.芦丁；4.槲皮苷。
图3描绘了展开温度对头花蓼药材和热淋清颗粒薄层层析行为的影响(320nm)，图中四条展开带从左至右所对应的检品分别为：1.头花蓼样品；2.热淋清颗粒样品；3.芦丁；4.槲皮苷。
图4描绘了预饱和时间对头花蓼药材和热淋清颗粒薄层色谱行为的影响(320nm)，图中四个色谱展开带从左至右依次代表的检品是：1.头花蓼样品；2.热淋清颗粒样品；3.芦丁；4.槲皮苷。
图5描绘了不同显色剂对头花蓼药材和热淋清颗粒薄层色谱行为的影响(320nm)，图中四个色谱带从左至右依次表示：1.头花蓼样品；2.热淋清颗粒样品；3.芦丁；4.槲皮苷。
图6描绘了标准品及头花蓼药材和热淋清颗粒薄层色谱轮廓扫描图(320nm)，图中的薄层展开图是从左向右展开的。
图7描绘了12批贵州施秉出产的头花蓼药材薄层色谱图及轮廓扫描叠加图(320nm)，薄层色谱图中14个色谱带从左至右依次是：12.编号为1～12的12批施秉头花蓼样品，13.芦丁；14.槲皮苷。
图9描绘了施秉头花蓼药材及头花蓼伪品薄层色谱图及轮廓扫描图(320nm)，薄层色谱图中四个色谱带从左至右依次表示的检品为：1.施秉头花蓼样品；2.赤胫散；3.芦丁；4.槲皮苷。
图10显示了12批含糖热淋清颗粒薄层色谱图(a)及轮廓扫描叠加图(b)。
图11显示了12批无糖热淋清颗粒薄层色谱图(a)及轮廓扫描叠加图(b)。
图12显示了12批热淋清片薄层色谱图(a)及轮廓扫描叠加图(b)。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
A、测试仪器与试药
仪器：LINOMAT V半自动点样仪(瑞士卡玛公司)、CAMAGReprostar3薄层色谱成像系统(瑞士卡玛公司)、CS-9301PC双波长飞点薄层色谱扫描仪(日本岛津公司)、AB204-S型电子天平(梅特勒-托利多公司)、CH-250型超声波清洗机(天津恒奥科技公司，功率250W，频率33kHz)、CZX-GF101-4-S-II型电热恒温鼓风干燥箱(上海贺德实验设备有限公司)，双槽展开箱，Chromafinger色谱指纹图谱解决方案软件(珠海科曼中药研究有限公司)。
试剂、试药：甲醇、乙醇、氯仿、石油醚、环己烷、乙酸乙酯、丙酮、甲酸、正己烷、丁酮等均为分析纯，可作为展开试剂可提取溶剂使用。芦丁(批号：110725-200513，含量测定用)、槲皮苷(批号：111538-200403，含量测定用)、没食子酸对照品(批号：110831-200302，含量测定用)，均购于中国药品生物制品检定所。甲醇、四氢呋喃、乙腈为色谱纯；水为纯净水；其它试剂均为分析纯。
药材：12批头花蓼药材采自贵州施秉头花蓼规范化种植研究与GAP试验示范基地(表1中编号1～12)，其他头花蓼药材为各地野生(表1中编号 13～23)。经贵阳中医学院鉴定为蓼科植物头花蓼Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don的干燥全草或地上部分；伪品赤胫散为蓼科植物赤胫散Polygonum runcinatum Buch.-Ham.var.sinense Hemsl.的干燥全草或地上部分，样品来源详见表1。
表1：药材样品的来源及编号
| 编号 | 来源 | 编号 | 来源 |
| 1 | 贵州施秉 | 2 | 贵州施秉 |
| 3 | 贵州施秉 | 4 | 贵州施秉 |
| 5 | 贵州施秉 | 6 | 贵州施秉 |
| 7 | 贵州施秉 | 8 | 贵州施秉 |
| 9 | 贵州施秉 | 10 | 贵州施秉 |
| 11 | 贵州施秉 | 12 | 贵州施秉 |
| 13 | 贵州兴义 | 14 | 贵州晴隆 |
| 15 | 贵州盘县 | 16 | 贵州毕节 |
| 17 | 贵州水城 | 18 | 贵州罗甸 |
| 19 | 湖南古丈 | 20 | 云南师宗 |
| 21 | 广西田林 | 22 | 重庆南川 |
| 23 | 四川南川 | 24 | 赤胫散(伪品) |
在下文中，使用到以上编号1～24的各药材，如果未特别提及其药材编号，是指使用编号为1号的药材进行处理。
B、药材试验例部分
在本药材试验例部分，必要时使用到热淋清颗粒样品作为比较用的考察对象，如未另外说明，所用热淋清颗粒是照中国药典2010年版一部“热淋清颗粒”项下的方法以施秉出产头花蓼为药材的制备得到的含糖型热淋清颗粒。
试验例1、本发明确定的最优选的薄层色谱分析条件
根据本发明上下文，可以确定最优选的薄层色谱分析条件和操作方法，具体如下。
(1)对照品溶液的制备：
分别精密称取干燥至恒重的芦丁、槲皮苷、没食子酸对照品适量，用甲醇制成浓度分别为0.5200mg/mL、0.1005mg/mL、0.1042mg/mL的对照品溶液。
(2)供试品溶液的制备：
对于头花蓼药材：取头花蓼药材粉末2g，至25mL容量瓶中，加水25mL，超声处理(功率250W，频率33kHz)30min，放冷，用水定容至刻度，滤过，滤液用乙酸乙酯萃取3次，每次25mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加5mL乙酸乙酯使溶解，作为供试品溶液。
对于头花蓼提取物或者热淋清制剂如热淋清颗粒：取头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物(相当于2克药材量的提取物或制剂)，至容量瓶中，加水25mL溶解或混悬，用水定容至刻度，滤过，滤液用乙酸乙酯萃取3次，每次25mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加5mL乙酸乙酯使溶解，作为供试品溶液。
(3)薄层色谱条件：
薄层板：聚酰胺薄层板(青岛海洋化工厂)。点样取上述供试品溶液、对照品溶液各4μL，用半自动点样仪点于距薄层板底边10mm处。展开系统：正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸(7∶6.5∶2.5∶3)。展开方式：于双槽展开箱的一侧加入上述展开溶剂预平衡15min，上行展开；展距8cm；温度20℃，控制相对湿度至小于72％。用展开剂正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸(7∶6.5∶2.5∶3)二次展开。检测条件：喷以AlCl3试液显色，挥尽薄层板上的残留溶剂后置紫外光灯(320nm)下检视荧光薄层色谱。
下面的试验对本发明方法作进一步验证，并且在下面的试验例中，如未另外说明，可以采用本试验例1的方法进行试验。
试验例2：不同提取溶剂、不同展开系统对头花蓼药材薄层色谱的影响
用编号为1号的头花蓼药材进行测试。
分别以乙酸乙酯、乙醇、甲醇、丙酮、正丁醇、水6种溶剂为提取溶剂，采用超声(功率250W，频率33kHz)30min的方式处理，对于水处理的试样，超声处理后用乙酸乙酯萃取3次，处理之后(必要时)浓缩到每ml供试液中含 有0.4g药材的浓度，得到不同提取方法获得的6个供试品溶液。另照试验例1所记载的方法分别制备芦丁、槲皮苷的对照品溶液。
将以上6个供试品溶液和2个对照品溶液点于同一聚酰胺薄层板上，共制备7个点样板，分别用以下7种溶剂系统(S1至S7)作为展开剂进行展开：
S1：正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸(7∶6.5∶2.5∶3)，二次展开；
S2：甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶11∶3.1)；
S3：环己烷-醋酸乙酯-甲酸(8∶4∶0.4)；
S4：水-乙醇-丁酮-乙酰丙酮(65∶15∶15∶5)；
S5：氯仿-甲醇-甲酸(15∶4∶0.5)；
S6：环己烷-乙酸乙酯-甲酸《5∶5∶1)；
S7：乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)，二次展开。
头花蓼药材不同提取溶剂、不同展开系统薄层色谱图(320nm)见图1。以薄层色谱图直观的清晰度和有效信息量为考察指标，对6种不同提取溶剂、7种不同展开系统进行比较，结果表明：不同提取溶剂对头花蓼药材薄层色谱影响较大，其中以水提取，乙酸乙酯萃取效果最好，斑点容量大(见图1中的S1)；S2～S7展开溶剂系统分离效果较差，拖尾较严重，斑点容量较小，S1得到的头花蓼药材薄层色谱分离度较好、斑点容量大，故选择正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸(7∶6.5∶2.5∶3)二次展开，作为展开溶剂系统是优选的。发明人还发现，对于S1展开条件，改用一次展开或者展开剂中不含有丁酮，则展开效果远比S1的差，无法分出5个明显的斑点。
另外，尽管乙酸乙酯、丙酮、正丁醇三种溶剂提取所得的提取试样亦能显示出5个明显的斑点，但重复性差，不具有可操作性，作为常规检测是不恰当的。
此外，对于先用水提取，然后用乙酸乙酯萃取制备供试液的情况，本领域技术人员清楚，现有的头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物，多是使用水提取或者含水乙醇提取头花蓼药材，除溶剂后得到的。因此，对于现有的头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物，亦可以使用本发明第一方面的方法进行指纹图谱的测定。即，只要在本发明第一方面方法步骤(a)中，进行薄层点样液制备时，直接用乙酸乙酯萃取头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物(或者必要时，可以在萃取之前用水溶解所述头 花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物)，将乙酸乙酸萃取液蒸干，残渣用乙酸乙酯溶解，即作为头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物的供试品溶液，即可，其它步骤与本发明第一方面方法的其它步骤相同。为此，本发明第二方面提供了一种头花蓼制剂以及制备该制剂的头花蓼提取的指纹图谱的测定方法，其是照薄层色谱法测定，包括以下步骤：(a)薄层点样液制备：称取头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物，用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酸萃取液蒸干，残渣用乙酸乙酯使溶解，作为头花蓼供试品溶液；以及任选地分别制备芦丁、槲皮苷和没食子酸的对照品溶液；以及如本发明第一方面任一实施方案所述的步骤(b)、步骤(c)、和步骤(d)。在本发明第二方面的方法中，其中所述步骤(a)中还任选地包括在萃取之前用水溶解所述头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物，然后用乙酸乙酯进行萃取的步骤。
试验例3：相对湿度(RH)对头花蓼药材薄层色谱行为的影响
在点样过程中，吸附剂表面能可逆地吸收水分，如空气湿度过大，薄层活度会降低，影响分离效果，因此，本实验以S1为溶剂系统展开，以药材编号为1号的样品所得溶液为供试品溶液，考察了相对湿度对头花蓼药材薄层色谱行为的影响，同时与热淋清颗粒的薄层色谱行为作比较，结果见图2。不同相对湿度可按表2配置设置。
表2：相对湿度控制表
| 相对湿度 | 硫酸(mL) | 水(mL) |
| 32％ | 68 | 100 |
| 88％ | 10.8 | 100 |
图2描绘了点样时的相对湿度(RH，32％和88％)对头花蓼药材薄层层析行为的影响(320nm)，图中四条展开带中从左至右依次是：1.头花蓼样品；2.热淋清颗粒样品；3.芦丁；4.槲皮苷。在另外的试验中，还使用了RH72％、RH50％两种点样条件，结果显示这两种条件下对头花蓼药材薄层层析行为与RH32％相似。可见：相对湿度(RH)小于88％时，对头花蓼药材薄层色 谱行为影响不明显，当相对湿度(RH)为88％或更高时，对头花蓼药材薄层色谱行为有显著影响，分离度降低，斑点减少，色谱无法辨认，故相对湿度(RH)小于88％为宜，特别是在32％～72％条件下是优选的。热淋清颗粒亦显示出与药材类似的结果。
试验例4：温度对头花蓼药材薄层色谱行为的影响
为考察温度对头花蓼薄层色谱行为的影响，本实验以S1为溶剂系统展开，以药材编号为1号的样品所得溶液为供试品溶液，同时与热淋清颗粒的薄层色谱行为作比较，将展开槽放在恒温干燥箱中，设置温度为10℃、20℃、30℃，结果见图3。
结果表明：温度对头花蓼药材薄层色谱行为影响很明显，当温度为20℃时，头花蓼药材薄层色谱分离度较好、斑点清晰可见，故环境温度应控制在20℃左右。本领域技术人员理解，在本发明的一个实施方案中，一般而言在20±2℃是有利的。热淋清颗粒亦显示出与药材类似的结果。
试验例5：预饱和时间对头花蓼药材薄层色谱行为的影响
薄层板和展开剂蒸汽间的平衡主要表现在从展开开始至结束过程中薄层对展开剂蒸汽的预吸附，而薄层各个部分吸附的程度是不同的。当用多元展开剂时，又将发生选择性吸附现象，这些都会影响色谱分离。因此在用多元展开剂时，经常将薄层及展开室进行预饱和，以便得到重现性较好的色谱图。本实验以S1为溶剂系统，以药材编号为1号的样品所得溶液为供试品溶液，同时与热淋清颗粒的薄层色谱行为作比较，分别对饱和15min、30min、45min进行了对比，结果见图4。
结果表明：饱和15min、30min、45min薄层色谱效果基本相同，饱和时间增加，分离度并未明显提高，因此饱和时间确定为15min即可。热淋清颗粒亦显示出与药材类似的结果。
试验例6：显色对头花蓼药材薄层色谱的影响
为比较显色剂对头花蓼药材薄层色谱的影响，本实验以S1为溶剂系统，以药材编号为1号的样品所得溶液为供试品溶液，同时与热淋清颗粒的薄层 色谱行为作比较，对分别使用AlCl3试液、1％三氯化铁试液、AlCl3乙醇试液作为显色剂显色进行了考察。结果见图5。
结果表明：用1％三氯化铁显色后无荧光，AlCl3试液喷雾显色后，斑点荧光颜色明显，斑点数清晰；而用AlCl3乙醇试液的显色效果并未明显改善。因此，可以选择用AlCl3试液喷雾显色。热淋清颗粒亦显示出与药材类似的结果。
试验例7：头花蓼药材薄层色谱扫描轮廓图分析
使用编号为1的药材进行测试，在挥尽薄层板上的残留溶剂后，置紫外光灯320nm下检视荧光薄层色谱。将荧光薄层色谱图导入Chromafinger色谱指纹图谱解决方案软件，生成灰度扫描图并积分，得芦丁、槲皮苷和头花蓼药材样品扫描轮廓图，见图6。从图中结果可见，编号为1的药材的5个主峰中，第3、4号主峰与芦丁的两个主峰对应，第4号主峰还与槲皮苷的主峰对应。对于其它批次的药材，以及市售热淋清颗粒(无糖型)，其薄层扫描图与1号药材和两个对照品在峰位上对应，仅在峰强上有差别。
结果表明，头花蓼药材及其制剂的薄层色谱图像，以320nm下的荧光色谱信息最丰富，头花蓼药材可以明显观察到5个荧光斑点，头花蓼制剂可以明显观察到5个荧光斑点。扫描轮廓图中的特征峰与斑点相对应。
试验例8：12批贵州施秉头花蓼药材薄层色谱图及轮廓扫描叠加图
采用表1中记载的编号为1至12的12批贵州施秉出产的头花蓼药材，参考试验例6的方法进行薄层色谱分析，结果见图7。
图7描绘了12批贵州施秉出产的头花蓼药材薄层色谱图及轮廓扫描叠加图(320nm)，薄层色谱图(图中a)中14个色谱带从左至右依次是：1～12.编号为1～12的12批施秉头花蓼样品，13.芦丁；14.槲皮苷。其中显示12个批次的同一地出产的药材，5个特征峰的位置和强度基本上相同，显示在轮廓扫描叠加图(图中b)中亦相当吻合。
试验例9：12批不同产地头花蓼药材薄层色谱图及轮廓扫描叠加图
采用表1中记载的编号为12至23的12批不同产地出产的头花蓼药材，参 考试验例6的方法进行薄层色谱分析，结果见图8。图8描绘了12批不同产地头花蓼药材薄层色谱图及轮廓扫描叠加图(320nm)，薄层色谱图(图中a)中14个色谱带从左至右依次是：1.贵州施秉头花蓼样品；2.贵州兴义；3.贵州晴隆；4.贵州盘县；5.贵州毕节；6.贵州水城；7.贵州罗甸；8.湖南古丈；9.云南师宗；10.广西田林；11.重庆南川；12.四川南川；13.芦丁；14.槲皮苷。其中显示12个批次的不同产地出产的药材，5个特征峰的位置基本上相同，但强度差异大，峰位置显示在轮廓扫描叠加图(图中b)中比较吻合，但强度变化较明显。
试验例10：头花蓼药材及其伪品赤胫散薄层色谱图及轮廓扫描图
采用表1中记载的编号为1的头花蓼药材和编号为24的伪品赤胫散，参考试验例6的方法进行薄层色谱分析，结果见图9。图9描绘了施秉头花蓼药材及头花蓼伪品薄层色谱图及轮廓扫描图(320nm)，薄层色谱图(a)中四个色谱带从左至右依次表示的检品为：1.施秉头花蓼样品；2.赤胫散；3.芦丁；4.槲皮苷。施秉头花蓼药材轮廓扫描图(b)显示出5个典型的特征峰，而伪品赤胫散在相应位置未显示特征峰。
在以上试验例1-10中，使用热淋清颗粒的薄层色谱行为进行对照时，该热淋清颗粒在各种试验条件下与制备它的头花蓼药材显示出相同的试验结果。
C、提取物或制剂实施例部分
参照中国药典2010年版一部“热淋清颗粒”项下的方法，取头花蓼12.5kg，加水煎煮二次，每次1.5小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩至适量，滤过，喷雾干燥，得浸膏粉A。取相当于1000克药材得到的浸膏粉A，加适量淀粉至总量成400克，混匀，制粒，干燥，制成无糖型热淋清颗粒，包装，每袋4克。另取相当于1000克药材得到的浸膏粉A，加适量蔗糖粉至总量成800克，混匀，制粒，干燥，制成含糖型热淋清颗粒，包装，每袋8克。另取相当于1000克药材得到的浸膏粉A，加淀粉、乳糖、微晶纤维素三者以重量比1∶1∶1配得的混合物适量，至总量成200克，混匀，制粒，干燥，加入适量硬脂酸镁，压片，制成热淋清片，每片重0.5g。以上方法各制备12批的制 剂样品。
照上文“B、药材试验例部分”试验例1所述的方法，对以上分别由浸膏粉A制备得到的无糖型热淋清颗粒、含糖型热淋清颗粒、和热淋清片，对其进行薄层色谱分析。
将薄层板置于CS-9301PC双波长飞点薄层色谱扫描仪上在320nm波长，以锯齿方式扫描得芦丁、槲皮苷、没食子酸和头花蓼制剂样品扫描轮廓叠加图，并照相。
图10显示了12批含糖热淋清颗粒薄层色谱图(a)及轮廓扫描叠加图(b)，薄层照片显示的层析带中，从左至右1～12分别是12批热淋清颗粒样品，13为芦丁，14为槲皮苷，15为没食子酸。图11显示了12批无糖热淋清颗粒薄层色谱图(a)及轮廓扫描叠加图(b)，薄层照片显示的层析带中，从左至右1～12分别是12批热淋清颗粒样品，13为芦丁，14为槲皮苷，15为没食子酸。图12显示了12批热淋清片薄层色谱图(a)及轮廓扫描叠加图(b)，薄层照片显示的层析带中，从左至右1～12分别是12批热淋清颗粒样品。另外，用浸膏粉A为试药进行测试，结果显示与图10基本相同的薄层结果。
结果表明，不同配方、不同批次制剂的薄层扫描结果一致。
本发明引入下列文献作为参考，其全部内容通过引用并入本文：
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Claims (11)
1.头花蓼药材指纹图谱的测定方法，其是照薄层色谱法测定，包括以下步骤：
(a)薄层点样液制备：称取头花蓼药材粉末，加水超声处理，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酸萃取液蒸干，残渣用乙酸乙酯使溶解，作为头花蓼供试品溶液；以及任选地分别制备芦丁、槲皮苷和没食子酸的对照品溶液；
(b)薄层层析：采用聚酰胺薄层板，取上述供试品溶液和任选的对照品溶液点样于薄层板上，用体积比为7:6.5:2.5:3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作为展开剂进行二次展开，该展开是在双槽展开箱的一侧加入上述展开溶剂进行预平衡，温度20℃，相对湿度至小于88%的条件下进行的；
(c)显色：向挥干的薄层板上喷以显色液AlCl3试液，挥尽薄层板上的残余溶剂，置320nm的紫外光灯下检视荧光薄层色谱，得到头花蓼药材的指纹图谱。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)中，所述头花蓼供试品溶液是用如下方法配制的：取头花蓼药材粉末，至容量瓶中，加水适量，超声处理，放冷，用水定容至刻度，滤过，滤液用乙酸乙酯萃取，使乙酸乙酯液蒸干，残渣加乙酸乙酯使溶解，即得供试品溶液。
3.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)中超声处理是以功率250W、频率33kHz的条件超声处理15～60min。
4.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)中，所述头花蓼供试品溶液是用如下方法配制的：取头花蓼药材粉末2g，至25mL容量瓶中，加水25mL，以功率250W、频率33kHz超声处理30min，放冷，用水定容至刻度，滤过，滤液用乙酸乙酯萃取3次，每次25mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加5mL乙酸乙酯使溶解，即得供试品溶液。
5.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)中，还包括分别制备芦丁、槲皮苷和没食子酸的对照品溶液的操作，其步骤是：分别精密称取干燥至恒重的芦丁、槲皮苷、没食子酸对照品适量，用甲醇制成浓度分别为0.5±0.05mg/mL、0.1±0.02mg/mL、0.1±0.02mg/mL的对照品溶液。
6.根据权利要求1的方法，其中步骤(b)中，点样液的体积为2～10μL、点样液点样于距薄层板底边10mm处、和/或展开距离为7～15cm。
7.根据权利要求1的方法，其中步骤(b)中，所述展开是在双槽展开箱的一侧加入上述展开溶剂进行预平衡，温度20℃，相对湿度至小于72%的条件下进行的。
8.根据权利要求1的方法，其中步骤(b)是以如下方式操作的：采用聚酰胺薄层板，取供试品溶液、对照品溶液各4μL，用半自动点样仪点于距薄层板底边10mm处；用体积比为7:6.5:2.5:3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作为展开剂；在温度20℃、相对湿度至小于88%的条件下于双槽展开箱的一侧加入上述展开溶剂预平衡15min，上行展开，展距8cm；用体积比为7:6.5:2.5:3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作为展开剂进行二次展开，即可。
9.根据权利要求1的方法，其中步骤(c)中，所述检视可以是肉眼观察、照相处理和/或扫描仪扫描。
10.头花蓼制剂以及制备该制剂的头花蓼提取物的指纹图谱的测定方法，其是照薄层色谱法测定，包括以下步骤：
(a)薄层点样液制备：称取头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物，用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酸萃取液蒸干，残渣用乙酸乙酯使溶解，作为头花蓼供试品溶液；以及任选地分别制备芦丁、槲皮苷和没食子酸的对照品溶液；
以及进行如权利要求1至9任一项所述的步骤(b)、步骤(c)的处理。
11.根据权利要求10的方法，其包括以下步骤：
(a)薄层点样液制备：称取头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物，用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酸萃取液蒸干，残渣用乙酸乙酯使溶解，作为头花蓼供试品溶液；以及任选地分别制备芦丁、槲皮苷和没食子酸的对照品溶液；
(b)薄层层析：采用聚酰胺薄层板，取上述供试品溶液和任选的对照品溶液点样于薄层板上，用体积比为7:6.5:2.5:3的正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸混合液作为展开剂进行二次展开，该展开是在双槽展开箱的一侧加入上述展开溶剂进行预平衡，温度20℃，相对湿度至小于50%的条件下进行的；(c)显色：向挥干的薄层板上喷以显色液AlCl3试液，挥尽薄层板上的残余溶剂，置320nm的紫外光灯下检视荧光薄层色谱，得到头花蓼制剂或者制备该制剂的头花蓼提取物的指纹图谱。
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