CN109633035A - 一种山楂破壁饮片的hplc指纹图谱及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及中药制剂质量控制技术领域，具体公开了一种山楂破壁饮片的HPLC指纹图谱及其构建方法和应用。所述构建方法包括供试品溶液制备、对照品溶液制备、HPLC分析色谱条件的确定、指纹图谱的测定等步骤。本发明还通过对10批次山楂破壁饮片样品HPLC指纹图谱的对比，确定其共有峰，得到标准HPLC指纹图谱。本发明所述构建方法具有操作简便、重现性好、特征峰多、准确可靠的优点。本发明所述HPLC指纹图谱可以更全面的反映样品的特征峰信息，利用该HPLC指纹图谱可以对山楂破壁饮片进行质量控制。

Description

一种山楂破壁饮片的HPLC指纹图谱及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及中药制剂质量控制技术领域，具体地，涉及一种山楂破壁饮片的HPLC指纹图谱及其构建方法和应用。
背景技术
山楂为蔷薇科植物山里红Crataegus pimiatificia Bge.var.major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果实，具有消食健胃，行气散瘀，化浊降脂的功效，用于肉食积滞，胃脘胀满，泻痢腹痛，瘀血经闭，产后瘀阻，心腹刺痛，胸痹心痛，疝气疼痛，髙脂血症，焦山楂可增强消食导滞作用。
中药破壁饮片是利用现代超微粉碎技术将传统饮片进行破细胞壁粉碎成粒度分布D90小于45μm的微细颗粒，再制成30～100目的颗粒。相对于传统饮片具有色泽一致，质量均一，稳定性好的特点为创新型中药饮片。由于中药破壁饮片不具传统中药饮片的形态特征，破壁后会带来有效成分或指标成分等化学成分的溶出度变化，使传统饮片的鉴别、质量检测方法不能完全适用。且根据文献调研，目前对于山楂的指纹图谱研究多达20篇。如汤树良等以金丝桃苷作为参照峰，建立了以18个峰为共有峰来鉴别不同种源山楂药材的HPLC指纹图谱方法；又如张俐伟等以金丝桃苷作为参照峰，建立了以12个峰为共有峰来鉴别不同产地山楂药材的HPLC指纹图谱方法，之后将方法优化后，以14个峰作为共有峰，用于鉴别不同炮制方法的山楂药材；又如陈宝龙等以芦丁、金丝桃苷为参照峰，建立了以27个峰为共有峰的山楂黄酮类成分的HPLC指纹图谱方法，等等。但现有的指纹图谱构建方法供试品制备操作耗时长，且专属性、稳定性、重现性和精密度差等缺陷，不能全面反映饮片质量的缺陷，同时尚无针对形态特殊的山楂破壁饮片的质量检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有山楂破壁饮片质量检测方法的缺陷和不足，提供一种山楂破壁饮片的HPLC指纹图谱及其构建方法和应用。
本发明的目的是提供一种山楂破壁饮片的HPLC指纹图谱的构建方法，该构建方法具有操作简便、重现性好、特征峰多、准确可靠的优点。
本发明的另一目的在于提供一种山楂破壁饮片HPLC指纹图谱。
本发明的另一目的在于提供一种山楂破壁饮片标准HPLC指纹图谱。
本发明的另一目的在于提供上述山楂破壁饮片HPLC指纹图谱和/或标准HPLC指纹图谱在检测山楂破壁饮片质量中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种山楂破壁饮片的质量控制方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种山楂破壁饮片的HPLC指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
S1.供试品溶液制备：精密称取山楂破壁饮片，按质量体积比为1:(25～100)加入50～100％甲醇，浸润后于1.2万～1.7万转匀浆处理1～5min，取出冷却至室温，用50～100％甲醇补足失重，摇匀，粗滤后再经0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液即得供试品溶液；
S2.对照品溶液制备：以绿原酸为对照品，加甲醇配制成对照品溶液；
S3.HPLC分析的色谱条件：将S1所得供试品溶液过十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，柱温20～40℃；以乙腈-甲醇-0.1％甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱；流速为0.6～1.2mL/min；检测波长为280nm；
所述流动相乙腈在梯度洗脱过程中体积分数变化为：0～10min，5％～8％；10min～20min，8％～8％；20min～30min，8％～11％；30min～45min，11％～14％；45min～70min，14％～28％；70min～75min，28％～5％；75min～85min，5％～5％；
所述流动相0.1％甲酸溶液在梯度洗脱过程中体积分数变化为：0～10min，95％～90％；10min～20min，90％～90％；20min～30min，90％～87％；30min～45min，87％～84％；45min～70min，84％～70％；70min～75min，70％～95％；75min～85min，95％～95％；
S4.在步骤S3的色谱条件下分析供试品溶液，即得山楂破壁饮片的HPLC指纹图谱。
在指纹图谱的建立方法中，为了使操作更为简便，耗时更短，并使指纹图谱中的各特征峰具有较好的分离度、峰形，同时需要合理的控制指纹图谱的检测时间，对于供试品的制备方法和梯度洗脱条件的选择至关重要，本领域技术人员在选择供试品的制备方法和梯度洗脱条件的时候都需要付出大量的实验，不断对供试品的制备方法和梯度洗脱条件进行优化，因为对于不同的中药材及制剂，其中的化学成分千差万别，不同的药材及制剂的提取条件及指纹图谱的洗脱条件并无参考价值，供试品制备条件的选择，不仅影响着指纹图谱的峰的多少，同时一般也是整个指纹图谱操作过程中耗时较长的一个步骤，且流动相比例的微小变化将会对指纹图谱造成很大的影响，如将会影响特征峰的分离度和峰形。
本申请的发明人通过大量的实验，对供试品制备方法和梯度洗脱条件进行摸索，最终确定了上述供试品制备方法和梯度洗脱条件。如本发明考察了对供试品不同的提取方法及采用匀浆方法的不同的提取条件的考察，同时还考察了许多不同的流动相对指纹图谱的影响，结果表明，采用上述供试品制备方法和上述流动相，指纹图谱中所得峰的信息较多；基线较平稳，分离度、峰形和柱效最佳。还考察了不同的检测波长、柱温对指纹图谱的影响，结果在上述波长和柱温下得到的指纹图谱，其成分相对较多、各峰高比例适中、基线比较平稳。
综上，本发明所述构建方法可快速、准确地鉴别产品的质量优劣，具有操作简便、耗时短、稳定、精密度高、重现性好等优点。利用该构建方法检测到的山楂破壁饮片HPLC指纹图谱化学成分峰相对较多、各特征峰高度比例适中，基线较平稳，分离度、峰形和柱效好。
优选地，所述步骤S1中所述山楂破壁饮片与甲醇的质量体积比为1：25。
优选地，步骤S1中所述甲醇的体积分数为70％。
优选地，步骤S1中所述匀浆处理的条件为1.2万转，处理的时间为2min。
优选地，步骤S2中所述的对照品溶液通过以下步骤制备得到：精密称取绿原酸对照品，加甲醇配制成浓度为0.5mg/mL的对照品溶液。
优选地，步骤S3中所述色谱条件的柱温为30℃，进行梯度洗脱的流速为0.7mL/min。
优选地，进行色谱分析时，所述供试品溶液进样量为20μL，对照品溶液进样量为10μL。
本发明还请求保护一种山楂破壁饮片HPLC指纹图谱，是通过上述构建方法构建得到。
本发明还请求保护一种山楂破壁饮片标准HPLC指纹图谱，是通过上述构建方法，构建得到10批次山楂破壁饮片样品的HPLC指纹图谱，将得到的HPLC指纹图谱导入指纹图谱分析软件，生成指纹图谱共有模式即得；所述标准HPLC指纹图谱有11个共有峰。以6号峰的保留时间为参照，其余10个共有峰的相对保留时间分别为0.278、0.295、0.393、0.746、0.888、1.130、1.180、1.423、1.438、1.456。
由上述构建方法测得的山楂破壁饮片HPLC指纹图谱，可以更全面的反映样品的特征峰信息，利用该HPLC指纹图谱可以对山楂破壁饮片进行质量控制。因此，上述山楂破壁饮片HPLC指纹图谱和/或标准HPLC指纹图谱在检测山楂破壁饮片质量中的应用亦在本发明保护范围之内。
本发明还请求保护一种山楂破壁饮片的质量控制方法，包括如下步骤：取山楂破壁饮片待检样品，按照上述构建方法构建待检样品的HPLC指纹图谱；然后与上述山楂破壁饮片标准HPLC指纹图谱进行比较；若待检样品的HPLC指纹图谱中，呈现11个对应特征峰，且按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，待检样品的HPLC指纹图谱与标准HPLC指纹图谱的相似度不低于0.85，以6号峰为参照峰，其余各峰相对保留时间在±5％的范围内，则判断为合格样品。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所提供的构建方法具有操作简便、供试品溶液制备耗时短、重现性好、特征峰多、准确可靠的优点，可以全面监控山楂破壁饮片产品的质量，为药品生产及检测提供了质量控制的高标准，以确保产品质量的稳定性，保证药品使用的安全有效。
(2)利用本发明的构建方法得到的山楂破壁饮片HPLC指纹图谱化学成分峰相对较多、各特征峰高度比例适中，基线较平稳，分离度、峰形和柱效好，可以更全面的反映样品的特征峰信息，可应用于山楂破壁饮片产品的质量控制。
附图说明
图1为绿原酸对照品的HPLC指纹图谱。其中，4号峰为绿原酸。
图2为10批山楂破壁饮片的HPLC指纹图谱。
图3为山楂破壁饮片的标准HPLC指纹图谱。
图4为山楂破壁饮片HPLC指纹图谱分析方法专属性考察色谱图。
图5为山楂破壁饮片HPLC指纹图谱精密度分析图谱。
图6为山楂破壁饮片HPLC指纹图谱重复性分析图谱。
图7为山楂破壁饮片HPLC指纹图谱稳定性分析图谱。
图8为山楂破壁饮片指纹图谱不同色谱柱分析图谱。
图9为山楂破壁饮片指纹图谱不同仪器分析图谱。
图10为山楂破壁饮片供试品制备提取溶剂考察色谱图。
图11为山楂破壁饮片供试品制备提取溶剂浓度考察色谱图。
图12为山楂破壁饮片供试品制备提取方式考察色谱图。
图13为山楂破壁饮片供试品制备匀浆转速考察色谱图。
图14为山楂破壁饮片供试品制备匀浆提取时间考察色谱图。
图15为山楂破壁饮片供试品料液比考察色谱图。
图16为山楂破壁饮片指纹图谱分析流动相系统考察色谱图。其中，S1为甲醇-0.1％醋酸，S2为甲醇-0.1％甲酸，S3为甲醇-0.1％磷酸，S4为甲醇-0.1％乙酸，S5为甲醇-水，S6为乙腈-0.1％醋酸，S7为乙腈-0.1％甲酸，S8为乙腈-0.1％磷酸，S9为乙腈-0.1％乙酸，S10为乙腈-水，S11为乙腈-甲醇-0.1％甲酸。
图17为山楂破壁饮片指纹图谱分析流动相梯度优化色谱图；其中A为梯度1-6，B为梯度7-11。
图18为山楂破壁饮片指纹图谱分析流速考察色谱图。
图19为山楂破壁饮片指纹图谱分析不同柱温考察色谱图。
图20为山楂破壁饮片指纹图谱分析进样体积考察色谱图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
1、仪器
电热恒温水浴锅HWS 24(上海一恒科技有限公司)、电子天平ME204(万分之一，METTLER TOLEOD)、电子天平MS105(十万分之一，METTLER TOLEOD)、高效液相色谱仪(安捷伦1200RRLC，安捷伦科技(中国)有限公司)、高效液相色谱仪(Waters 2695/2988，沃特世科技(上海)有限公司)、高效液相色谱仪(Thermo U3000，赛默飞世尔科技公司)、数控超声波清洗器(KQ-700DE型，昆山市超声仪器有限公司)、超纯水机(明澈D24UV型，美国Milipore公司)、可调高速匀浆机(FSH-2A常州普天仪器制造有限公司)、Phenomenex C18(5μm，250mm×4.6mm)、Agilent Zorbax SB-Aq C18(5μm，250mm×4.6mm)、Shiseido PAK C18(5μm，250mm×4.6mm)、YMC-Triart C18(5μm，250mm×4.6mm)。
2、试剂
乙腈(色谱纯，安徽时联特种溶剂股份有限公司)、甲醇(色谱纯，安徽时联特种溶剂股份有限公司)、磷酸(广州化学试剂厂)、甲酸(广州化学试剂厂)、乙酸(广州化学试剂厂)、冰醋酸(广州化学试剂厂)、甲醇(分析纯，广州化学试剂厂)、重蒸水(自制)。
3、样品
山楂破壁饮片UGP20180505、UGP20181201、UGP20181202、UGP20181203、UGP20181204、UGP20181205、UGP20181206、UGP20181207、UGP20181208、UGP20181209、UGP20181210共11批样品，均由中山市中智中药饮片有限公司提供。
4、对照品
绿原酸(购自中国食品药品检定研究院，110753-201405)。
本发明数据处理采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行色谱相似度评价。
实施例1山楂破壁饮片的HPLC指纹图谱的构建方法
一种山楂破壁饮片的HPLC指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
S1.供试品溶液制备：精密称取山楂破壁饮片，按质量体积比为1:25加入70％甲醇，浸润后于1.2万转匀浆处理2min，取出冷却至室温，用70％甲醇补足失重，摇匀，粗滤后再经0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液即得供试品溶液；
S2.对照品溶液制备：以绿原酸为对照品，加甲醇配制成对照品溶液；
S3.HPLC分析的色谱条件：将S1所得供试品溶液过十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，柱温30℃；以乙腈-甲醇-0.1％甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱；流速为0.7mL/min；供试品溶液进样量为20μL，对照品溶液进样量为10μL；检测波长为280nm；
所述流动相乙腈在梯度洗脱过程中体积分数变化为：0～10min，5％～8％；10min～20min，8％～8％；20min～30min，8％～11％；30min～45min，11％～14％；45min～70min，14％～28％；70min～75min，28％～5％；75min～85min，5％～5％；
所述流动相0.1％甲酸溶液在梯度洗脱过程中体积分数变化为：0～10min，95％～90％；10min～20min，90％～90％；20min～30min，90％～87％；30min～45min，87％～84％；45min～70min，84％～70％；70min～75min，70％～95％；75min～85min，95％～95％；
S4.在步骤S3的色谱条件下分析供试品溶液，即得山楂破壁饮片的HPLC指纹图谱。
实施例2山楂破壁饮片指纹图谱共有模式的建立
1、参照峰的指认
按照实施例1的构建方法，测定对照品溶液绿原酸的HPLC指纹图谱，记录色谱图，并将其与山楂破壁饮片HPLC指纹图谱进行比较，分析相对应峰的保留时间与紫外吸收情况，如图1所示。
指认出：4号峰为绿原酸。其中6号峰高度适中，分离度好，保留时间适中，选择为参照峰。
2、指纹图谱的建立及共有峰的确认
取10个批次山楂破壁饮片(批号为UGP20181201、UGP20181202、UGP20181203、UGP20181204、UGP20181205、UGP20181206、UGP20181207、UGP20181208、UGP20181209、UGP20181210)，按照实施例1的构建方法制备供试品溶液，并测定10批供试品溶液，记录色谱图。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对所得10张图谱进行相似度分析，确定了11个色谱峰为山楂破壁饮片共有指纹峰，见图2和图3，10批样品的相似度均在0.9以上，结果见表1。
其中，6号峰高度适中，分离度好，保留时间适中，可作为参照峰。其余10个共有色谱峰与参照峰的平均相对保留时间分别为：0.278、0.295、0.393、0.746、0.888、1.130、1.180、1.423、1.438、1.456，结果见表2。
表1山楂破壁饮片指纹图谱相似度
表2山楂破壁饮片指纹图谱共有峰的相对保留时间
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
UGP20181201 0.278 0.295 0.393 0.747 0.889 1.000 1.130 1.179 1.422 1.437 1.455
UGP20181202 0.278 0.295 0.392 0.747 0.888 1.000 1.129 1.179 1.422 1.437 1.454
UGP20181203 0.278 0.295 0.393 0.748 0.889 1.000 1.129 1.178 1.421 1.436 1.454
UGP20181204 0.278 0.295 0.393 0.747 0.888 1.000 1.129 1.179 1.423 1.438 1.456
UGP20181205 0.278 0.295 0.393 0.746 0.888 1.000 1.131 1.180 1.423 1.438 1.456
UGP20181206 0.278 0.295 0.393 0.746 0.887 1.000 1.131 1.181 1.424 1.439 1.457
UGP20181207 0.277 0.295 0.392 0.745 0.887 1.000 1.131 1.180 1.423 1.439 1.456
UGP20181208 0.278 0.296 0.393 0.747 0.888 1.000 1.131 1.180 1.423 1.438 1.456
UGP20181209 0.278 0.295 0.393 0.746 0.887 1.000 1.131 1.180 1.423 1.438 1.456
相对平均保留时间 0.278 0.295 0.393 0.746 0.888 1.000 1.130 1.180 1.423 1.438 1.456
相对平均保留时间RSD值 0.101 0.084 0.073 0.122 0.057 0.000 0.079 0.090 0.063 0.059 0.069
实施例3方法学验证
1、专属性考察
取批号为UGP20180505的山楂破壁饮片，按照实施例1步骤S1的方法制备供试品溶液及空白供试品溶液，进样，按照实施例1步骤S3的色谱条件测定，记录色谱图，如图4所示。结果显示溶剂在色谱条件下基本无吸收，对样品的色谱图影响较小。表明建立的方法专属性好。
2、仪器精密度
取批号为UGP20180505的山楂破壁饮片，按照实施例1步骤S1的方法制备供试品溶液，连续进样6次，按照实施例1步骤S3的色谱条件测定，记录色谱图(见图5)。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对所得6份图谱进行全谱相似度分析，相似度分析结果见表3，相似度均达1.000。以6号峰为参照，其余峰的相对保留时间RSD值均小于1.0％，相对峰面积RSD值小于3.0％。考察结果表明仪器精密度符合要求。
表3山楂破壁饮片指纹精密度相似度分析
谱图 1 2 3 4 5 6
1 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
2 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
3 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
4 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
5 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
6 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
3、重复性试验
取批号为UGP20180505的山楂破壁饮片，按照实施例1步骤S1的方法制备供试品溶液，重复制备6个样品，按照实施例1步骤S3的色谱条件测定，记录色谱图(见图6)。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对所得6份图谱进行全谱相似度分析，相似度分析结果见表4，相似度均达0.997以上。以6号峰为参照，其余峰的相对保留时间RSD值均小于1.0％，相对峰面积RSD值小于3.0％。考察结果表明方法的重复性符合要求。
表4山楂破壁饮片指纹图谱重复性相似度分析
谱图 1 2 3 4 5 6
1 1.000 0.999 1.000 0.999 0.998 0.997
2 0.999 1.000 0.999 0.998 0.998 0.998
3 1.000 0.999 1.000 0.999 0.998 0.998
4 0.999 0.998 0.999 1.000 0.999 0.999
5 0.998 0.998 0.998 0.999 1.000 1.000
6 0.997 0.998 0.998 0.999 1.000 1.000
4、耐用性试验
(1)供试品溶液的稳定性试验
取批号为UGP20180505的山楂破壁饮片，按照实施例1步骤S1的方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24小时进样，按照实施例1步骤S3的色谱条件测定，记录色谱图(见图7)。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对所得6份图谱进行全谱相似度分析，相似度分析结果见表5，相似度均达0.998以上。以6号峰为参照，其余峰的相对保留时间RSD值均小于1.0％，相对峰面积RSD值小于3.0％。考察结果表明仪器精密度符合要求。考察结果表明方法的稳定性符合要求。
表5山楂破壁饮片指纹图谱稳定性相似度分析
谱图 0h 2h 4h 8h 12h 24h
0h 1.000 1.000 1.000 0.998 0.999 1.000
2h 1.000 1.000 1.000 0.999 0.999 1.000
4h 1.000 1.000 1.000 0.998 0.998 1.000
8h 0.998 0.999 0.998 1.000 1.000 0.998
12h 0.999 0.999 0.998 1.000 1.000 0.998
24h 1.000 1.000 1.000 0.998 0.998 1.000
(2)不同色谱柱比较
取批号为UGP20180505的山楂破壁饮片，按照实施例1步骤S1的方法制备供试品溶液，分别采用Phenomenex C18(5μm，250mm×4.6mm)、YMC-Triart C18(5μm，250mm×4.6mm)、Agilent Zorbax SB-Aq C18(5μm，250mm×4.6mm)和Shiseido PAK C18(5μm，250mm×4.6mm)四根不同的色谱柱，按照实施例1步骤S3的色谱条件测定，记录色谱图(见图8)，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对所得4份图谱进行全谱相似度分析，相似度分析结果见表6，相似度均在0.986以上。表明本方法基本适用于不同的色谱柱。
表6山楂破壁饮片指纹图谱不同色谱柱相似度分析
(3)不同仪器比较
取批号为UGP20180505的山楂破壁饮片，按照实施例1步骤S1的方法制备供试品溶液，分别在Waters 2695/2998和Thermo U3000液相色谱仪上采用Shiseido PAK C18(5μm，250mm×4.6mm)色谱柱，按照实施例1步骤S3的色谱条件测定，记录色谱图(见图9)，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对所得3份图谱进行全谱相似度分析，相似度达0.999，满足方法学要求。
表7山楂破壁饮片指纹图谱不同仪器相似度分析
综上，方法学考察结果表明，所建立的山楂破壁饮片HPLC指纹图谱分析方法能满足方法学考察要求，且操作简便，可应用于山楂破壁饮片的HPLC指纹图谱分析。
实施例4供试品溶液制备方法的优化
在色谱条件固定的条件下，优化供试品溶液的制备方法。固定的色谱条件如下：
色谱柱：Shiseido PAK C18(5μm，250mm×4.6mm)；
流动相：乙腈-0.01％甲酸水溶液；梯度洗脱：0min-20min-55min-75min-80min-90min，乙腈变化5％-10％-14％-17％-5％-5％；
流速：1mL/min；柱温：30℃；检测波长：280nm；样品进样量10μL；对照品进样量10μL。
1、提取溶剂的考察
考察乙醇和甲醇2种溶剂对山楂破壁饮片提取效率的影响，具体步骤如下。
样品处理：取山楂破壁饮片2.0g，精密称定2份，置具塞锥形瓶中，其中一份加入70％乙醇50mL，另外一份加入70％甲醇50mL，称定重量，超声提取30min，取出后放冷，用提取溶剂补重，粗滤，0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得供试品。
采用上述固定的色谱条件，分析上述2份样品，比较不同溶剂提取差异。以样品谱图出峰数目多、峰分布均匀且绿原酸含量高为选择标准，筛选出最佳提取溶剂。结果见图10。
由上述结果可知，70％甲醇提取的色谱图与70％乙醇提取的色谱图无异，主峰种类基本一致，相似度较高，但70％甲醇提取的绿原酸的含量略高于70％乙醇提取。综合上述数据，选择甲醇作为山楂供试品的提取溶剂。
2、甲醇提取浓度的考察
分别考察50％甲醇、70％甲醇、80％甲醇、甲醇4种不同浓度的甲醇溶液对山楂破壁饮片样品化学成分提取的影响，具体步骤如下。
样品处理：取山楂破壁饮片2.0g，精密称定4份，置具塞锥形瓶中，1号加入50mL50％甲醇，2号加入50mL 70％甲醇，3号加入50mL 80％甲醇，4号加入50mL甲醇，称定重量，超声提取30min，取出，冷却至室温，用提取溶剂补足失重，摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得供试品。
采用上述固定的色谱条件，分析上述4份样品，比较不同溶剂提取差异。以样品谱图出峰数目多、峰分布均匀且以绿原酸含量高为选择标准，筛选出最佳提取溶剂。结果见图11。
由结果可知，4种浓度甲醇提取的供试品色谱图出峰数目基本无异，主峰种类一致，主成分峰的响应值70％甲醇提取略高。从节约溶剂成本考虑，筛除高浓度的甲醇提取，最终选取70％甲醇作为山楂破壁饮片的提取溶剂。
3、提取方式的考察
(1)超声提取：取山楂破壁饮片2.0g，样品放置具塞锥形瓶中，加入50mL 70％甲醇，称定重量，超声提取40min，取出，冷却至室温，用提取溶剂补足失重，摇匀，粗滤后再经0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液。
(2)水浴加热回流提取：取山楂破壁饮片2.0g，样品放置具塞锥形瓶中，加入50mL70％甲醇，称定重量，水浴加热回流30min，取出，冷却后补足失重，摇匀，粗滤后再经0.22μm微孔滤膜滤过，取滤液。
(3)匀浆提取：取山楂破壁饮片2.0g，样品放置具塞锥形瓶中，加入50mL 70％甲醇，称定重量，转速1.2万转匀浆提取5min，取出，冷却至室温，用提取溶剂补足失重，摇匀，粗滤后再经0.22μm微孔滤膜滤过，取滤液。
(4)索氏提取：取山楂破壁饮片2.0g，样品放置具塞锥形瓶中，加入50mL 70％甲醇，称定重量，水浴加热回流30min，取出，冷却后补足失重，摇匀，粗滤后再经0.22μm微孔滤膜滤过，取滤液。
采用上述固定的色谱条件，分析上述4份样品，比较不同提取方法的提取效果。以样品谱图出峰数目多、峰分布均匀且绿原酸等含量高为选择标准，筛选提取方式。结果如图12。
由结果可知，4种提取方式所得供试品色谱图出峰数目基本无异，主峰种类一致，主成分峰的响应值也无明显差异。考虑到匀浆提取耗时短、简便，故选择匀浆提取作为最终提取方式。
4、提取转速的考察
考察不同转速提取(1.2万转、1.3万转、1.4万转、1.5万转、1.7万转)对山楂破壁饮片提取效果的影响，具体步骤如下。
取精密称定5份山楂破壁饮片，每份2g，置具塞锥形瓶中，分别加入50mL 70％甲醇，称定重量，1号1.2万转提取5min，2号1.3万转提取5min，3号1.4万转提取5min，4号1.5万转提取5min，5号1.7万转提取5min，取出，冷却至室温，用70％甲醇补足失重，摇匀，粗滤后再经0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液。
采用上述固定的色谱条件，分析上述5份样品，比较不同提取方法的提取效果。以样品谱图出峰数目多、峰分布均匀且绿原酸含量高为选择标准，筛选提取转速。结果如图13。
由结果可知，转速对提取效果的影响不明显。最终选择转速1.2万转作为供试品溶液制备的提取转速。
5、提取时间的考察
考察不同匀浆提取时间(1min、2min、3min、4min、5min)对山楂破壁饮片提取效果的影响，具体步骤如下。
取精密称定山楂破壁饮片5份，每份2g，置具塞锥形瓶中，分别加入50mL 70％甲醇，称定重量，1号1.2万转匀浆提取1min，2号1.2万转匀浆提取2min，3号1.2万转匀浆提取3min，4号1.2万转匀浆提取4min，5号1.2万转匀浆提取5min，取出，冷却至室温，用70％甲醇补足失重，摇匀，粗滤后再经0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液。
采用上述固定的色谱条件，分析上述5份样品，比较不同提取方法的提取效果。以样品谱图出峰数目多、峰分布均匀且绿原酸等含量高为选择标准，筛选提取时间。结果如图14。
由结果可知，匀浆时间对提取效果的影响不明显。但随着时间的延长，提取效率有小幅度提高(主成分峰的峰面积略有提高)，所以最终选择主成分提取相对充分的2min作为供试品溶液制备的提取时间。
6、考察样品提取中料液比的影响
考察不同提取料液比(0.5g-25mL、0.5g-50mL、1g-25mL、1g-50mL)对山楂破壁饮片提取效果的影响，具体步骤如下。
取山楂破壁饮片，各精密称定2份0.5g和2份1g，置具塞锥形瓶中，1加入70％甲醇25mL，2号加入70％甲醇50mL，3号加入70％甲醇25mL，4号加入70％甲醇50mL称定重量，1.2万转匀浆2min，取出，冷却至室温，用70％甲醇补足失重，摇匀，粗滤后再经0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液。
采用上述固定的色谱条件，分析上述4份样品，比较不同提取方法的提取效果。以样品谱图出峰数目多、峰分布均匀且绿原酸含量高为选择标准，筛选料液比。结果如图15。
由结果可知，4组料液比的提取效果无明显差异，主峰种类一致。其中，料液比1g-25mL所得样品谱图主成分峰的响应值略高，另从节约物料、提取溶剂及保护环境的角度出发，最终选择1g-25mL的料液比。
7、供试品溶液最终制备方法
根据以上各项考察内容，最终确定山楂破壁饮片HPLC指纹图谱分析用供试品溶液的制备方法为：
取山楂破壁饮1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25mL，称定重量，1.2万转匀浆2min，取出，冷却至室温，用70％甲醇补足失重，摇匀，粗滤后再经0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液即得。
实施例5色谱条件优化
1、检测波长的选择
对供试品进行全波长扫描，从其3D图中选择最佳检测波长。考察指标为：该波长下分析信号响应值大，峰信息量多，峰分布均匀且基线平稳，各峰分离度较好。
通过调用3D谱图分析发现，在280nm处，山楂破壁饮片中色谱峰信息量大，且响应值较高，最终选择280nm作为山楂破壁饮片指纹图谱分析的波长。
2、流动相系统的选择
考察下列流动相系统：(1)甲醇-水；(2)乙腈-水；(3)甲醇-0.1％磷酸溶液；(4)甲醇-0.1％甲酸溶液；(5)甲醇-0.1％醋酸(36％乙酸)溶液；(6)甲醇-0.1％冰醋酸溶液；(7)乙腈-0.1％的磷酸溶液；(8)乙腈-0.1％甲酸溶液；(9)乙腈-0.1％醋酸(36％乙酸)溶液；(10)乙腈-0.1％冰醋酸溶液、(11)乙腈-甲醇-0.1％甲酸溶液。
采用最终确定的供试品溶液制备方法制备山楂破壁饮片供试品溶液。
其他固定色谱条件为：Shiseido CAP Cell MGIII C18(5μm，250mm×4.6mm)色谱柱；流速1mL/min；柱温30℃；检测波长280nm；供试品进样量10μL。
比较不同洗脱系统对山楂破壁饮片样品成分的分离效果，以分析谱图的出峰数目多、峰分布均匀、基线平稳，且4号峰能基本分开为选择标准。
结果表明：二元流动相洗脱系统不能把4、5、6号成分峰很好地分离，而采用流动相系统11(乙腈-甲醇-0.1％甲酸水溶液三元流动相)分析得到的供试品谱图的峰信息较多，基线较平稳，分离度、峰形和柱效较好(见图16)，故最终确定流动相为乙腈-甲醇-0.1％甲酸溶液。
3、梯度优化
采用最终确定的供试品溶液制备方法制备山楂破壁饮片供试品溶液。
色谱条件：Shiseido CAP Cell MGIII C18(5μm，250mm×4.6mm)色谱柱；流速1mL/min；柱温30℃；检测波长280nm；供试品进样量10μL；对照品进样量10μL；以乙腈为流动相A，0.1％甲酸水溶液为流动相B，按表8所示梯度洗脱，记录色谱图。按以上色谱条件分析供试品溶液，比较不同洗脱梯度对山楂破壁饮片分离效果的差异，以样品谱图出峰数目多、峰分布均匀，且4号峰能基本分开为选择标准。
表8流动相梯度表
结果如图17所示，各梯度的出峰数目基本一致；梯度1-8洗脱所得谱图的4、5、6号成分峰分离度较差；梯度11的基线平稳，峰分布均匀，且4、5、6号成分峰分离效果好，故选择梯度11。
4、流速的选择
考察供试品溶液洗脱流速分别为0.6mL/min、0.7mL/min、0.8mL/min、0.9mL/min、1mL/min、1.1mL/min、1.2mL/min的分析效果。
采用最终确定的供试品溶液制备方法制备山楂破壁饮片供试品溶液。
其它色谱条件：Shiseido CAP Cell MGIII C18(5μm，250mm×4.6mm)色谱柱；流动相为乙腈-甲醇-0.1％甲酸水溶液；采用上述梯度11洗脱；柱温30℃；检测波长280nm；供试品进样量10μL。考察不同洗脱流速对山楂破壁饮片分离效果的影响，以样品谱图出峰时间适中，主成分峰分离度高、分布均匀作为选择标准。
结果如图18所示：与其他流速相比，当流动相的流速为0.7mL/min时，供试品的谱图出峰时间适中，峰分离度较高、分布均匀，选择为最佳流速。
5、色谱柱柱温的选择
考察柱温分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃时的样品分析效果，以期通过柱温优化进一步提高峰分离度。
其它色谱条件：Shiseido CAP Cell MGIII C18(5μm，250mm×4.6mm)色谱柱；流动相为乙腈-甲醇-0.1％甲酸水溶液；采用上述梯度11洗脱；检测波长280nm；流速为0.7mL/min；供试品进样量10μL。
结果如图19所示：柱温为20～40℃时，各主要色谱峰的分离度差异不大；结合实验实际环境，最终选择30℃作为最终的色谱柱温。
7、供试品溶液进样体积的考察
考察供试品溶液进样体积分别为5μL、10μL、15μL、20μL的分析效果。
其它色谱条件：Shiseido CAP Cell MGIII C18(5μm，250mm×4.6mm)色谱柱；流动相为乙腈—甲醇—0.1％甲酸水溶液；采用上述梯度11洗脱；流速为0.7mL/min；柱温30℃；检测波长280nm。考察供试品不同进样体积对山楂破壁饮片分离效果的影响，以样品色谱图中峰的响应度高且分离度好作为选择标准。
结果如图20所示：4组进样体积色谱图无明显差异，最终选择进样体积为20μL。
7、最终色谱条件
根据以上各项考察内容，最终确定山楂指纹图谱的色谱条件为：
色谱柱：资生堂CAP Cell色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；流速：0.7mL/min；检测波长：280nm；柱温：30℃；进样体积：供试品溶液20μL；对照品溶液10μL；流动相及梯度如下表9所示。
表9梯度洗脱过程中各流动相的体积分数
时间(min) 甲醇(体积分数/％) 乙腈(体积分数/％) 0.1％甲酸水溶液(体积分数/％)
0 0 5 95
10 2 8 90
20 2 8 90
30 2 11 87
45 2 14 84
70 2 28 70
75 0 5 95
85 0 5 95
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种山楂破壁饮片的HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.供试品溶液制备：精密称取山楂破壁饮片，按质量体积比为1:（25～100）加入50～100%甲醇，浸润后于1.2万～1.7万转匀浆处理1～5 min，取出冷却至室温，用50～100%甲醇补足失重，摇匀，粗滤后再经0.22 μm微孔滤膜过滤，取滤液即得供试品溶液；
S2.对照品溶液制备：以绿原酸为对照品，加甲醇配制成对照品溶液；
S3.HPLC分析的色谱条件：将S1所得供试品溶液过十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，柱温20～40℃；以乙腈-甲醇-0.1%甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱；流速为0.6～1.2 mL/min；检测波长为280 nm；
所述流动相乙腈在梯度洗脱过程中体积分数变化为：0～10 min，5%～8%；10 min～20min，8%～8%；20 min～30 min，8%～11%；30 min～45 min，11%～14%；45 min～70 min，14%～28%；70 min～75 min，28%～5%；75 min～85 min，5%～5%；
所述流动相0.1%甲酸溶液在梯度洗脱过程中体积分数变化为：0～10 min，95%～90%；10 min～20 min，90%～90%；20 min～30 min，90%～87%；30 min～45 min，87%～84%；45min～70 min，84%～70%；70 min～75 min，70%～95%；75 min～85 min，95%～95%；
S4.在步骤S3的色谱条件下分析供试品溶液，即得山楂破壁饮片的HPLC指纹图谱。
2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤S1中所述山楂破壁饮片与甲醇的质量体积比为1：25。
3.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤S1中所述甲醇的体积分数为70%。
4. 根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤S1中所述匀浆处理的条件为1.2万转，处理的时间为2 min。
5. 根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤S2中所述的对照品溶液通过以下步骤制备得到：精密称取绿原酸对照品，加甲醇配制成浓度为0.5 mg/mL对照品溶液。
6.一种山楂破壁饮片HPLC指纹图谱，其特征在于，通过权利要求1至5任一项所述构建方法构建得到。
7.一种山楂破壁饮片标准HPLC指纹图谱，其特征在于，是通过权利要求1至5任一项所述构建方法，构建得到10批次山楂破壁饮片样品的HPLC指纹图谱，将得到的HPLC指纹图谱导入指纹图谱分析软件，生成指纹图谱共有模式即得；所述标准HPLC指纹图谱有11个共有峰。
8.根据权利要求7所述山楂破壁饮片标准HPLC指纹图谱，其特征在于，所述标准HPLC指纹图谱有11个共有峰，以6号峰的保留时间为参照，其余10个共有峰的相对保留时间分别为0.278、0.295、0.393、0.746、0.888、1.130、1.180、1.423、1.438、1.456。
9.权利要求6所述山楂破壁饮片HPLC指纹图谱、权利要求7所述山楂破壁饮片标准HPLC指纹图谱和/或权利要求8所述山楂破壁饮片标准HPLC指纹图谱在检测山楂破壁饮片质量中的应用。
10.一种山楂破壁饮片的质量控制方法，其特征在于，包括如下步骤：取山楂破壁饮片待检样品，按照权利要求1至5任一项所述构建方法构建待检样品的HPLC指纹图谱；然后与权利要求7或8所述山楂破壁饮片标准HPLC指纹图谱进行比较；若待检样品的HPLC指纹图谱中，呈现11个对应特征峰，且按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，待检样品的HPLC指纹图谱与标准HPLC指纹图谱的相似度不低于0.85，以6号峰为参照峰，其余各峰相对保留时间在±5%的范围内，则判断为合格样品。
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