CN108267516B

CN108267516B - 一种结肠宁制剂的检测方法

Info

Publication number: CN108267516B
Application number: CN201611266367.3A
Authority: CN
Inventors: 王炜; 谷陟欣; 谢安; 叶惠煊; 邓芸; 陈秧; 彭彩云; 张妮瑜
Original assignee: Jiuzhitang Co Ltd
Current assignee: Jiuzhitang Co Ltd
Priority date: 2016-12-31
Filing date: 2016-12-31
Publication date: 2023-05-30
Anticipated expiration: 2036-12-31
Also published as: CN108267516A

Abstract

本发明公开了一种结肠宁的检测方法。方法包含：1)对照品溶液的制备；2)供试品溶液的制备；3)HPLC检测。本发明方法精密度高，重现性好，回收率高，测量结果准确，提高了结肠宁的质量可控性和稳定性，确保人们用药的安全性和有效性。

Description

一种结肠宁制剂的检测方法

技术领域

本发明属于药物检测技术领域，特别涉及测定结肠宁制剂的检测方法。

背景技术

结肠宁是九芝堂股份有限公司的独家产品，具有活血化瘀，清肠止泻的功效，是治疗慢性结肠炎、结肠炎、溃疡性结肠炎、细菌性痢疾的特色灌肠剂。自问市以来，其质量标准一直在提升。结肠宁制剂是由蒲黄和丁香蓼两味药组成的处方制剂，目前企业内部标准主要是对其蒲黄、丁香蓼的定性鉴别以及丁香蓼中没食子酸的定量鉴别；然而处方中，蒲黄用量是丁香蓼的数倍，作为用料最多的原料，其定量方法一直是公司内部探索的重点难题。蒲黄在中国药典中的质量控制成分为香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷，二者属于黄酮苷类成分；结肠宁工艺中有水煎煮过程，加热过程中对该类成分有一定的破坏，在前期的研究中，以药典的方法对其进行检测均显示含量低于0.02％；因此在不影响结肠宁总体质量的前提下，目前建立了一种合适的检测方法。

发明内容

本发明的目的就是针对结肠宁目前对于蒲黄的含量控制的缺少简便经济的方法而开发的检测方法。此方法包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备：

称取异鼠李素-3-O-新橙皮苷、香蒲新苷对照品，置于容量瓶中，加25％～75％乙醇或甲醇，超声溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：

结肠宁供试品溶液的制备：取结肠宁样品置于容量瓶中，精密称定，加25％～75％甲醇醇或乙醇至近刻度，超声30～90min，冷却至室温，定容至刻度，过滤；以0.45μm滤膜过滤即得。

(3)HPLC检测：

分别吸取步骤(1)和(2)所得的对照品溶液和结肠宁制剂供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪中进行测定；

其中，色谱条件为：色谱柱为C₁₈反相色谱柱；紫外检测器；柱温为30～40℃；检测波长为254nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.05～0.2％磷酸溶液，流速为0.8～1.2ml/min；分析时间85分钟；梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1：

表1梯度洗脱程序表

所述步骤(1)对照品溶液的制备优选为下述方法进行：

称取异鼠李素-3-O-新橙皮苷、香蒲新苷2mg置于10ml容量瓶中，加25～75％乙醇或甲醇，超声溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液。

所述步骤(2)供试品溶液的制备优选为下述方法进行：

取结肠宁样品约3～5g置于10ml容量瓶中，精密称定，加30～70％甲醇或乙醇至近刻度，超声30～90min，冷却至室温，定容至10ml，过滤；以0.45μm滤膜过滤即得。

所述步骤(3)中的色谱柱优选柱长为250mm的C₁₈反相色谱柱。

所述步骤(3)中流动相B优选为0.1％磷酸溶液。

所述步骤(3)中流速优选为1ml/min。

所述步骤(1)和(2)中乙醇或甲醇浓度优选为50％。

所述步骤(2)中超声处理时间优选为30分钟。

所述步骤(3)中柱温为35℃。

为更好的表明本发明的实质，将本发明的方法学考察详述如下：

1仪器与试药

仪器：Waters e2695-2998型高效液相色谱仪(美国Waters公司)，AY220分析天平(日本岛津公司)，CP225D天平(sartorius公司)、KQ300DE型数控超声波清洗器、AgilentZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6×250mm，5μm)。

试药：结肠宁(5g/支，批号为20160801、20160802、20160803，由九芝堂股份有限公司提供)；异鼠李素-3-O-新橙皮苷(111573-201405，中国食品药品检定研究院)、香蒲新苷(111571-201205，中国食品药品检定研究院)。

试剂：甲醇(AR/色谱纯)、乙醇(AR)、磷酸(AR)、乙腈(色谱纯)，水为超纯水。

2方法与结果

2.1检测波长的选择、提取方式、提取溶剂、提取时间选择。

用DAD检测器测定香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷的紫外吸收光谱，由图1、图2可知，在近254nm处，二者有较大吸收，故选择254nm作为HPLC法测定二者含量时的检测波长。

通过用不同的提取溶剂(乙醇、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇)提取同一批次的结肠宁样品(20160802)，测定其HPLC图谱，得到香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷的相对峰面积，然后进行比较，结果显示乙醇提取效率低，甲醇提取率略低于含水的甲醇提取率，而30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇提取率之间差异性不大，因此，选用50％甲醇作为提取溶剂。

对其按超声和回流两种方式进行对比，发现二者提取效率相差不大，故而采用超声提取。

分别对不同的提取时间(20min，30min，60min)进行了比较。通过比较，发现15min提取率较低，30min和60min没有显著性差别，因此选用30min作为提取时间。

2.2色谱条件：

考察了不同比例的甲醇-磷酸溶液，乙腈-磷酸溶液等流动相对样品的洗脱效果，综合考虑图谱分离度、柱效、对称因子等结果，最后选择乙腈-0.1％磷酸为流动相。又根据样品的检测结果(见图3至图4)，发现异鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷色谱峰在检测85min之内全部出峰且回至起始梯度，从而确定检测时间为85min。

确定了梯度条件(见表1)。

表1梯度条件

比较不同柱温(25℃、30℃和35℃)对待测色谱峰分离度的影响。结果表明柱温在35℃时，在该色谱条件下，待测色谱峰的分离度良好，受杂峰影响小，因此选择35℃作为实验柱温，见图5至图7。

以同一供试品溶液(批号：20160802)，选择3种不同品牌色谱柱进行考察，包括Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250×4.6mm,5μm)、Hypersil ODS-2(250×4.6mm,5μm)和Kromasil 100-C18(250×4.6mm,5μm)。结果(见图3-4，8-11)可知，Agilent ZORBAXEclipse XDB-C18色谱柱的分离度较其他两种品牌色谱柱好，实现了待测色谱峰和杂质峰的完全分离，且更适应酸性流动相。综合考虑，本研究选取了Agilent ZORBAX EclipseXDB-C18色谱柱完成结肠宁中蒲黄的含量测定方法学考察。

通过考察检测器、流动相体系、检测波长、色谱柱、柱温和流速，经过反复优化，得到最佳的色谱条件为：紫外检测器，乙腈-0.1％磷酸梯度洗脱，ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm，美国安捷伦公司)，柱温为35℃，流速为1ml/min，进样量为10μl，检测波长为254nm，检测时间85min。

2.3供试液制备：

通过考察提取时间、提取溶剂、提取方式的考察，确定供试液制备方法为：取本品4.5g，精密称定，置10ml容量瓶中，加50％甲醇8ml，超声处理(250W，频率20KHz)30分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，以0.45μm滤膜过滤即得供试品溶液。

2.4专属性考察

以结肠宁工艺同法制备缺蒲黄的阴性样品，供试品、对照品溶液制备及测定方法同上，阴性样品无干扰。见附图12。

2.5线性考察

配制合适浓度的对照品溶液，精密吸取浓度分别为0.03925mg/ml、0.09812mg/ml、0.1962mg/ml、0.3925mg/ml、0.9812mg/ml、1.962mg/ml的香蒲新苷和0.01944mg/ml、0.04860mg/ml、0.09721mg/ml、0.1944mg/ml、0.4860mg/ml、0.9720mg/ml异鼠李素-3-O-新橙皮苷的混合标准品溶液各10μl进样，测定其峰面积积分值，以浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，制得标准曲线，香蒲新苷的回归方程为y＝17435331.9x+159195.1891，r²＝0.9994。表明香蒲新苷在0.3925μg～19.62μg范围内具有良好的线性关系。异鼠李素-3-O-新橙皮苷的回归方程为y＝24878947.77x+89804.42875，r²＝0.9994。表明异鼠李素-3-O-新橙皮苷在0.1944μg～9.72μg范围内具有良好的线性关系。结果见表2、3。见附图13、14。

表2香蒲新苷线性关系考察结果表

表3异鼠李素-3-O-新橙皮苷线性关系考察结果表

2.6检测限与定量限考察

通过仪器给出已知浓度的信噪比，计算得到香蒲新苷的检测限为3.5ng，定量限为9.4ng；异鼠李素-3-O-新橙皮苷的检测限为1.2ng，定量限为5.8ng。

2.7精密度、重复性与稳定性实验

取对照品溶液(10μl)于同1d内重复进样连续进样6次，计算异鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷峰面积RSD％，考察仪器日内精密度。结果见表4。

取批号为20160802样品，分别制备6份，进行测定，计算含量及其RSD％，考察方法的重现性。结果见表5。

分别在0，2，4，6，12，24h对同一供试品溶液进行测定，记录峰面积，计算出相对保留时间和相对峰面积RSD％，以考察样品的稳定性。结果显示，异鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷在24小时内具有稳定性。结果见表6。

表4精密度试验结果(n＝6)

表5稳定性试验结果(n＝6)

表6重复性试验结果

2.8加样回收率

精密称定已知含量香蒲新苷为0.6059mg/g、异鼠李素-3-O-新橙皮苷为0.2807mg/g的样品(批号：20160802)2.25g共六份，分别精密加入香蒲新苷对照品1.3633mg，异鼠李素-3-O-新橙皮苷对照品0.6316mg，按上述含量测定项下的方法平行测定6份样品含量，通过实测量减去已知量与加入对照品量的比值计算回收率，结果见表7、表8。

表7香蒲新苷回收率测定结果表

表8异鼠李素-3-O-新橙皮苷回收率测定结果表

结果表明：本方法加样回收率结果较好。

2.9耐用性考察

以同一份供试品溶液，在同一色谱条件下，分别在不同实验室的两台Waters2695高效液相色谱仪进行考察，结果表明(见表9)，该方法在不同实验室间同一品牌型号的高效液相色谱仪上能够实现方法转移。

表9不同实验室间同一品牌型号的高效液相色谱仪考察结果(n＝2)

2.10 10批样品含量测定：

按拟定的企业内控标准中含量测定方法，测定10批结肠宁灌肠剂中香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷的总量，测定结果见表10。

表10 10批结肠宁含量测定结果表(n＝2)

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由表10可知，10批样品中香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷的总量均值为0.4867mg/g。考虑到二者均为黄酮苷类化合物，在制剂过程中易受高温破坏分解；同时我们随机抽取3批样品测定其pH值(批号20160801的pH＝3.64、批号20160802的pH＝3.72、批号20161002的pH＝3.63)，表明该制剂呈酸性，在贮存过程也可能造成二者的分解，故按60％折算得0.2920mg/g，暂时拟定本品每1g含蒲黄以香蒲新苷(C₃₄H₄₂O₂₀)和异鼠李素-3-O-新橙皮苷(C₂₈H₃₂O₁₆)的总量不得少于0.29mg。

本发明的有益效果：本发明方法不同于药典中蒲黄药材浸泡过夜加超声的前处理方式，其直接应用超声30min的提取方法，操作更为简便。本发明方法的操作简便、准确度高、专属性好、精密度较高、重现性良好，有利于保障结肠宁制剂的质量稳定和临床疗效。

附图说明

图1为香蒲新苷紫外吸收光谱图

图2为异鼠李素-3-O-新橙皮苷紫外吸收光谱图

图3为混合标准品溶液HPLC图(Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18)；

图4为实施例结肠宁HPLC色谱图(Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18)；

图5为25℃柱温时HPLC图；

图6为30℃柱温时HPLC图；

图7为35℃柱温时HPLC图；

图8为Kromasil 100-C18色谱柱混合标准品HPLC图谱；

图9为Kromasil 100-C18色谱柱结肠宁供试品HPLC图谱；

图10为Hypersil ODS-2色谱柱混合标准品HPLC图谱；

图11为Hypersil ODS-2色谱柱结肠宁供试HPLC图谱；

图12为缺蒲黄的结肠宁阴性HPLC色谱图；

图13为香蒲新苷标准曲线图；

图14为异鼠李素-3-O-新橙皮苷标准曲线图；

图15为异鼠李素标准品溶液HPLC图；

图16为对比例1结肠宁HPLC图；

图17为对比例2对照品(香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷)和结肠宁HPLC图。

具体实施方式

实施例1

1、一种结肠宁制剂的检测方法，包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备：

分别称取异鼠李素-3-O-新橙皮苷、香蒲新苷对照品20mg，置于100ml容量瓶中，加50％甲醇，超声溶解并定容至刻度，摇匀，制成每1ml含0.2mg的对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：

精密称取结肠宁样品4.5g置于容量瓶中，加50％甲醇于10ml容量瓶中至近刻度，超声30min，冷却至室温，定容至刻度，过滤；以0.45μm滤膜过滤即可；

(3)HPLC检测：

其中，色谱条件为：色谱柱为C₁₈反相色谱柱；紫外检测器；柱温为35℃；检测波长为254nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液，流速为1.0ml/min；分析时间85分钟；梯度洗脱，梯度洗脱程序表见表11。

表11梯度条件

(4)样品含量测定

3批样品含量测定数据。结果见表12：

表12含量测定数据

对比例1

1、一种结肠宁制剂的检测方法，包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备：

称取异鼠李素对照品5mg，置于100ml容量瓶中，加50％甲醇，超声溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液。

(2)供试品溶液的制备：

取结肠宁样品3g，精密称定，置50ml容量瓶中，加50％甲醇45ml，超声处理(250W，频率20KHz)30分钟，放冷，加50％甲醇至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣加水20ml转移至100ml三角锥形瓶中，加1ml盐酸。置于水浴锅中加热回流60min，冷却至室温后以水饱合正丁醇萃取3次，每次20ml，合并萃取液，将萃取液蒸干后转移定容至10ml容量瓶，即得。

(3)HPLC检测：

分别吸取步骤(1)和(2)所得的对照品溶液和结肠宁制剂供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪中进行测定；其中，色谱条件为：

紫外检测器，乙腈-1％磷酸(57:43)等度洗脱，ODS2C-18色谱柱(4.6×250mm,5μm)，柱温为35℃，流速为1ml/min，进样量为10μl，检测波长为370nm，检测时间30min。

(4)样品含量测定

3批样品含量测定数据。结果见表13，见附图15、16。

表13 3批样品含量测定数据累积

对比例2

以中国药典蒲黄含量测定方法对结肠宁进行检测，包含如下步骤：

(1)对照品溶液的制备：取香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.05mg的对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：取本品约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，冷浸12小时后加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(3)HPLC检测：分别精密吸取上述两种对照品溶液与供试品溶液各10μ1，注入液相色谱仪,测定；检测条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.05％磷酸溶液(15:85)为流动相；检测波长为254nm。

(4)样品含量测定：3批样品含量测定数据。三批均不含香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷，结果见附图17。

Claims

1.一种结肠宁制剂的检测方法，包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备：

分别称取异鼠李素-3-O-新橙皮苷、香蒲新苷对照品，置于容量瓶中，加25～75％乙醇或25～75％甲醇，超声溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：

结肠宁供试品溶液的制备：取结肠宁样品置于容量瓶中，精密称定，加25～75％甲醇或25～75％乙醇，超声30～90min，冷却至室温，定容至刻度，过滤；以0.45μm滤膜过滤即可；(3)HPLC检测：

表1梯度洗脱程序表

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)对照品溶液的制备按照下述方法进行：

称取异鼠李素-3-O-新橙皮苷、香蒲新苷对照品2mg，置于10ml容量瓶中，加25～75％乙醇或25～75％甲醇，超声溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)供试品溶液的制备按照下述方法进行：

结肠宁供试品溶液的制备：

取结肠宁样品约3～5g置于10ml容量瓶中，精密称定，加30～70％甲醇或30～70％乙醇至近刻度，超声30～90min，冷却至室温，定容至10ml，过滤；以0.45μm滤膜过滤即得。

4.根据权利要求1-3任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的色谱柱是柱长为250mm的C₁₈反相色谱柱。

5.根据权利要求1-3任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中流动相B为0.1％磷酸溶液。

6.根据权利要求1-3任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中流速为1.0ml/min。

7.根据权利要求1-3任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)和(2)中甲醇或乙醇浓度为50％。

8.根据权利要求1-3任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中超声处理时间为30分钟。

9.根据权利要求1-3任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中柱温为35℃。