CN108445125B - 止痛化癥胶囊的hplc指纹图谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种止痛化癥胶囊的HPLC指纹图谱检测方法，属于中成药的指纹图谱分析方法。包括止痛化癥胶囊供试品溶液的制备，混和对照品溶液制备，分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；将获得的止痛化癥胶囊供试品溶液的指纹图谱导出，生成止痛化癥胶囊的对照指纹图谱。本发明所建立的止痛化癥胶囊指纹图谱方法简便、具有相似度高、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。

Description

止痛化癥胶囊的HPLC指纹图谱检测方法

技术领域

本发明涉及一种中成药的指纹图谱分析方法，具体涉及止痛化癥胶囊指纹图谱的建立方法，以及由此方法得到的止痛化癥胶囊指纹图谱。

背景技术

止痛化癥胶囊是由党参、炙黄芪、炒白术、丹参、当归、鸡血藤、三棱、莪术、芡实、山药、延胡索、鱼腥草、北败酱、蜈蚣、全蝎、土鳖虫、泡姜、肉桂等19味中药炮制而成，内容物为棕褐色或黑褐色颗粒；气微香，味苦、微咸。主治益气活血，散结止痛。用于气虚血瘀所致的月经不调、痛经、癓瘕，症见行经后错、经量少、有血块、行经小腹疼痛、腹有癓块；慢性盆腔炎见上述证候者。

目前，止痛化癥胶囊鉴别方法有薄层鉴别一种方法，共鉴别7种物质，含量测定有一种方法，测定丹参素含量；中药指纹图谱是一种综合的,可量化的鉴定手段,它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量,进而对药品质量进行整体描述和评价。因此,建立止痛化癥胶囊的指纹图谱以及建立一种止痛化癥胶囊的高效液相色谱鉴别方法，对于止痛化癥胶囊的质量控制，提高止痛化癥胶囊的质量标准以及用药安全等将具有重要意义。

发明内容

本发明提供一种止痛化癥胶囊的HPLC指纹图谱检测方法。

本发明采取的技术方案是，包括下列步骤：

步骤1、止痛化癥胶囊供试品溶液的制备：

取十批不同号的止痛化癥胶囊，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇溶液，超声提取，滤过后，将滤液蒸干后，取滤渣加入甲醇溶液，超声溶解，定容，得供试品溶液；

步骤2、混和对照品溶液制备

精密丹参素对照品、原儿茶酸对照品、原儿茶醛对照品、迷迭香酸对照品、党参炔苷对照品、紫草酸对照品、丹酚酸B对照品、混合置于10ml量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度线，超声至溶解，摇匀，作为混合对照品备用液；

步骤3、分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

步骤4、将步骤3中获得的止痛化癥胶囊供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择十批不同批号止痛化癥胶囊的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰用平均值计算法，生成止痛化癥胶囊的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并根据对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。

本发明步骤1中止痛化癥胶囊供试品溶液的制备方法为，取十批不同批号的止痛化癥胶囊内容物各3.0g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入30ml甲醇溶液,超声提取45min，过滤，将滤液蒸干后，取残渣加入甲醇溶液，超声溶解，定容5ml，得供试品溶液。

本发明步骤2中混合对照品溶液的制备，精密称定：丹参素对照品0.0016g，原儿茶酸对照品0.0020mg，原儿茶醛对照品0.0032g,迷迭香酸对照品0.0025g，党参炔苷对照品0.0011mg，紫草酸对照品0.0013g,丹酚酸B对照品0.0019g，混合置于10ml量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度线，超声至溶解，摇匀，作为混合对照品备用液。

本发明步骤3中液相色谱条件：色谱柱为5-120C18Ultra色谱柱，其规格为色谱柱内径为4.6mm，色谱柱长度250mm，色谱柱填料颗粒直径5μm，流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.05％的甲酸水溶液，进行梯度洗脱，程序为：0min～15min，流动相为5％A、95％B，15min～30min，5％A上升至10％A、95％B下降至90％B；30min～60min，10％A上升至20％A、90％B下降至80％B；60min～80min，20％A上升至30％A、80％B下降至70％B，80min～100min，30％A，70％B，流速：1.0mL/min，进样量：20μL，柱温：30℃，检测波长：280nm。

本发明指纹图谱中选择32个共有峰作为止痛化癥胶囊指纹图谱的特征峰，以这个特征峰的峰面积作为质量评价的变量指标，32个共有峰中丹参素为1号峰、保留时间11.561为分钟，原儿茶酸为2号峰、保留时间为14.534分钟，原儿茶醛为6号峰、保留时间为23.365分钟，迷迭香酸为23号峰、保留时间为68.808分钟，党参炔苷为24号峰、保留时间为69.455分钟，紫草酸为25号峰、保留时间为70.559，丹酚酸B为28号峰、保留时间为73.988分钟。

有益效果：

本发明筛选出了最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速、检测波长、色谱柱、柱温等分析条件，建立了止痛化癥胶囊的指纹图谱检测方法，可以全面、客观、准确的检测和评价止痛化癥胶囊的质量，为保证临床疗效具有重要意义。

本发明所建立的止痛化癥胶囊指纹图谱方法简便、具有相似度高、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。

用本发明所提供的方法所建立的止痛化癥胶囊指纹图谱，能有效地体现出止痛化癥胶囊指纹特征峰的位置及数目,从整体上控制止痛化癥胶囊的质量及成分，既可避免因测定个别化学成分而判定止痛化癥胶囊质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。

附图说明

图1是甲醇-水流动相色谱图；

图2是甲醇-0.05％甲酸水流动相色谱图；

图3是乙腈-水流动相色谱图；

图4是乙腈-0.25％醋酸水流动相色谱图；

图5是乙腈-0.05％甲酸水流动相色谱图；

图6是流速为0.5ml/min色谱图；

图7是流速为0.8ml/min色谱图；

图8是流速为1.0ml/min色谱图；

图9是对照指纹图谱(R)；

图10是混合对照品(S1)和对照指纹图谱(R)；

图11是十批不同批号止痛化癥胶囊HPLC指纹图谱。

具体实施方式

包括下列步骤：

步骤1、止痛化癥胶囊供试品溶液的制备：

取十批不同号的止痛化癥胶囊，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇溶液，超声提取，滤过后，将滤液蒸干后，取滤渣加入甲醇溶液，超声溶解，定容，得供试品溶液；

步骤2、混和对照品溶液制备

精密丹参素对照品、原儿茶酸对照品、原儿茶醛对照品、迷迭香酸对照品、党参炔苷对照品、紫草酸对照品、丹酚酸B对照品、混合置于10ml量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度线，超声至溶解，摇匀，作为混合对照品备用液；

步骤3、分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

步骤4、将步骤3中获得的止痛化癥胶囊供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择十批不同批号止痛化癥胶囊的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰用平均值计算法，生成止痛化癥胶囊的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并根据对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。

本发明步骤1中止痛化癥胶囊供试品溶液的制备方法为，取十批不同批号的止痛化癥胶囊内容物各3.0g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入30ml甲醇溶液,超声提取45min，过滤，将滤液蒸干后，取残渣加入甲醇溶液，超声溶解，定容5ml，得供试品溶液。

本发明步骤2中混合对照品溶液的制备，精密称定：丹参素对照品0.0016g，原儿茶酸对照品0.0020mg，原儿茶醛对照品0.0032g,迷迭香酸对照品0.0025g，党参炔苷对照品0.0011mg，紫草酸对照品0.0013g,丹酚酸B对照品0.0019g，混合置于10ml量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度线，超声至溶解，摇匀，作为混合对照品备用液。

本发明步骤3中液相色谱条件：色谱柱为5-120C18Ultra色谱柱，其规格为色谱柱内径为4.6mm，色谱柱长度250mm，色谱柱填料颗粒直径5μm，流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.05％的甲酸水溶液，进行梯度洗脱，程序为：0min～15min，流动相为5％A、95％B，15min～30min，5％A上升至10％A、95％B下降至90％B；30min～60min，10％A上升至20％A、90％B下降至80％B；60min～80min，20％A上升至30％A、80％B下降至70％B，80min～100min，30％A，70％B，流速：1.0mL/min，进样量：20μL，柱温：30℃，检测波长：280nm。

本发明指纹图谱中选择32个共有峰作为止痛化癥胶囊指纹图谱的特征峰，以这个特征峰的峰面积作为质量评价的变量指标，32个共有峰中丹参素为1号峰、保留时间11.561为分钟，原儿茶酸为2号峰、保留时间为14.534分钟，原儿茶醛为6号峰、保留时间为23.365分钟，迷迭香酸为23号峰、保留时间为68.808分钟，党参炔苷为24号峰、保留时间为69.455分钟，紫草酸为25号峰、保留时间为70.559，丹酚酸B为28号峰、保留时间为73.988分钟。

下面将结合实验例对本发明的实施方案进行详细描述，实验例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

1.实验材料与仪器设备：

1.1样品

止痛化癥胶囊由吉林金宝药业股份有限公司提供，10批药品批号依次为160303、161002、160905、161001、160502、160501、160503、160904、161003、160701。

1.2试剂与标准品

乙腈、甲醇(色谱级，美国Fisher试剂公司)；水为纯净水(娃哈哈)；其他试剂均为分析纯。

丹参素(151106)，原儿茶酸(171109)，党参炔苷(17062207)，紫草酸(171220)，丹酚酸B(150927)均购买自北京普天同创生物科技有限公司。迷迭香酸(11871-2001102)，原儿茶醛(110810-200205)购买自中国食品药品检定研究院(中国，北京)。

1.3仪器设备

Waters 1525型HPLC、Waters 2998二极管阵列检测器(American Waters公司)；FA1104N型万分之一电子分析天平(上海菁华科技仪器有限公司)；R201D恒温水浴锅、旋转蒸发器(上海豫康科教仪器设备有限公司)；KQ3200V型超声波清洗仪(150W，40KHz，昆山市超声仪器有限公司)。

实验例、一种止痛化癥胶囊的HPLC指纹图谱检测方法，包括下列步骤：

步骤1、止痛化癥胶囊供试品溶液制备方法为，取十批不同批号的止痛化癥胶囊内容物各3.0g，精密称定,置锥形瓶中,精密加入30ml甲醇溶液,超声提取45min，过滤，将滤液蒸干后，取残渣加入甲醇溶液,超声溶解,定容5ml，得供试品溶液。

步骤2、混合对照品溶液的制备，精密丹参素对照品0.0016g，原儿茶酸对照品0.0020mg，原儿茶醛对照品0.0032g,迷迭香酸对照品0.0025g，党参炔苷对照品0.0011mg，紫草酸对照品0.0013g,丹酚酸B对照品0.0019g,混合置于10ml量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度线，超声至溶解，摇匀，作为混合对照品备用液。

步骤3、分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液,注入高效液相色谱仪,记录色谱图，液相色谱条件：色谱柱为5-120C18Ultra色谱柱，其规格为色谱柱内径为4.6mm，色谱柱长度250mm，色谱柱填料颗粒直径5μm，流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.05％的甲酸水溶液，进行梯度洗脱，程序为：0min～15min，流动相为5％A，95％B；15min～30min，5％A上升至10％A,95％B下降至90％B；30min～60min，10％A上升至20％A，90％B下降至80％B；60min～80min，20％A上升至30％A，80％B下降至70％B，80min～100min，30％A，70％B；流速：1.0mL﹒min-1；进样量：20μL；柱温：30℃；检测波长：280nm。

运用国家药典委员会发布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”分别对步骤3得到的10批药品色谱图进行指纹图谱分析,采用多点校正后进行自动匹配(时间窗为0.15)，提取吸收信号较强、峰形明显、稳定性较好的32个共有色谱峰生成对照图谱R,以6号峰原儿茶醛为S峰，保留时间和峰面积为1,计算其他各特征峰的相对保留时间和相对峰面积值,结果见表2和表3。将32个共有色谱峰生成对照图谱R，见图1。与对照品溶液图谱对照可知：1号峰为丹参素,2号峰为原儿茶酸,6号峰为原儿茶醛(S)，23号峰为迷迭香酸，24号峰为党参炔苷，25号峰为紫草酸，28号峰为丹酚酸B，见图2。10批止痛化癥胶囊HPLC叠加指纹图谱见图3。将10批止痛化癥胶囊样品所得指纹图谱分别导入相似度价系统计算各个批次指纹图谱与生成的对照图谱的相似性系数,结果显示,10批止痛化癥胶囊样品与生成的对照图谱的相似度分别为：0.981、0.976、0.990、0.982、0.991、0.981、0.978、0.983、0.973、0.981，见表1。

表1指纹图谱相似度评价

表2共有指纹峰相对保留时间

表3共有指纹峰相对峰面积

2.供试品制备方法考察

2.1供试品制备

本实验采用50％、70％和100％甲醇分别对3g止痛化癥胶囊内容物进行超声波提取30min，经考察，100％甲醇提取物液相色谱图基线平稳，响应值较高；以100％甲醇为提取溶剂，考察了超生波提取30min、45min、60min，观察其色谱峰的数目及其响应值，结果其45min和60min色谱峰数目及响应值基本一致，表明45min超声波提取基本完全。

2.2波长的选择

将供试品溶液进行190-400nm紫外-可见光全波长扫描发现在230nm和280nm处下各色谱峰的数目及丰度较好,经考察，当检测波长为230nm时，色谱峰基线不平稳，峰形差，检测波长为280nm时，基线平稳，分离度较好，适合指纹图谱研究,故本研究选择280nm为检测波长。

2.3流动相的考察

(1)以甲醇为流动相A-水溶液为流动相B,梯度洗脱:0min～90min，10％A上升至100％A，90％B下降至0％B；90min～100min,100％A，0％B。(2)甲醇为流动相A-0.05％甲酸水溶液为流动相B，梯度洗脱:0min～40min，10％A上升至30％A，90％B下降至70％B；40min～90min,30％A上升至68％，70％B下降至32％B，90min～95min,68％A上升至85％A，32％B下降至15％B，95min～105min,85％A上升至90％A，15％B下降至10％B,105min～125min,90％A上升至100％A,10％B下降至0％。(3)乙睛为流动相A-水溶液为流动相B,梯度洗脱：梯度洗脱:0min～20min，10％A，90％B；20min～50min,10％A上升至20％，90％B下降至80％B，50min～70min,20％A上升至30％A，80％B下降至70％B，70min～100min,30％A，70％B。(4)乙睛为流动相A-0.25％醋酸水溶液为流动相B,梯度洗脱：梯度洗脱:0min～20min，2％A，98％B；20min～30min,2％A上升至5％，98％B下降至95％B，30min～45min,5％A上升至10％A，95％B下降至90％B，45min～75min,10％A上升至20％，90％B下降至80％B，75min～95min,20％A上升至30％A，80％B下降至70％B，95min～115min，30％A，70％B。(5)乙睛为流动相A-0.05％甲酸水溶液为流动相B,0min～15min，流动相为5％A，95％B；15min～30min，5％A上升至10％A,95％B下降至90％B；30min～60min，10％A上升至20％A，90％B下降至80％B；60min～80min，20％A上升至30％A，80％B下降至70％B，80min～100min，30％A，70％B；上述百分含量均为体积百分比,其它色谱条件相同。结果见图1、图2、图3、图4、图5。

从上述结果可见,采用(5)流动相系统谱图上各主要色谱峰分离度好,保留时间适中,且能保证所有成分色谱峰在分钟内全部出完,因此确定(5)为本法流动相。

2.4流速的选择

在其他色谱条件一致的情况下，对流速条件进行了考察，分别设定流动相流速为0.5ml/min、0.8ml/min及1ml/min时，经考察，流速为1ml/min时，色谱图整体分离效果较好，适合指纹图谱研究，见图6、图7、图8。

2.5进样量的考察

分别取同一供试品溶液5μl、10μl及20μl进样，记录其色谱图，经比较5μl及10μl进样量，其色谱峰响应值较低，20μl进样量响应值较好，故选择20μl进样量。

2.6柱温的考察

在其他色谱条件一致的情况下，对其柱温进行考察，分别设定柱温30℃、35℃、40℃对其色谱图进行分析，结果表明，柱温30℃时，色谱峰基线平稳、分离度较好、响应值较好，适合指纹图谱研究。

3.方法学考察

3.1精密度试验

取同一供试品溶液(批号160501)，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，记录色谱图。以重现性和分离度都较好的6号峰原儿茶醛峰为参照峰S，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果显示，各特征峰相对保留时间RSD为0.09％～0.40％，相对峰面积RSD为0.76％～2.94％，表明方法精密度良好。数据见表4和5。

表4指纹图谱精密度相对保留时间数据(批号：160501)

表5指纹图谱精密度相对峰面积数据(批号：160501)

3.2重现性试验

精密称取同一供试品溶液(批号160501)5份，按“2.2”项下平行制备5份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，进样，记录色谱图。以重现性和分离度都较好的6号峰原儿茶醛峰为参照峰S，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果显示，各特征峰相对保留时间RSD为0.08％～0.95％，相对峰面积RSD为0.10％～2.87％，表明方法重复性良好。数据见表6和表7。

表6指纹图谱重复性相对保留时间数据(批号：160501)

表7指纹图谱重复性相对峰面积数据(批号：160501)

3.3稳定性试验

精密称取同一供试品溶液(批号160501)，按“2.1”项下色谱条件，分别于0h，2h，4h，8h，12h、24h进样，记录色谱图。以重现性和分离度都较好的6号峰原儿茶醛峰为参照峰S，,计算各主要色谱峰相对峰面积和相对保留时间结果显示，各特征峰相对保留时间RSD为0.09％～1.30％，相对峰面积RSD为0.89％～2.83％，表明方法在24h内稳定性良好。数据见表8和9。

表8指纹图谱稳定性相对保留时间数据(批号：160501)

表9指纹图谱稳定性相对峰面积数据(批号：160501)

以上实验结果表明,本发明提供的止痛化癥胶囊指纹图谱检测方法,稳定性好,精密度高,重复性好,能全面客观评价止痛化癥胶囊的质量,为保证临床疗效具有重要的意义。以上实施例仅为本发明的示例性实施例,不用于限制本发明,本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内,对本发明做出各种修改或等同替换,这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种止痛化癥胶囊的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于，包括下列步骤：

步骤1、止痛化癥胶囊供试品溶液的制备：

取十批不同批号的止痛化癥胶囊内容物各3.0g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入30ml甲醇溶液,超声提取45min，过滤，将滤液蒸干后，取残渣加入甲醇溶液，超声溶解，定容5ml，得供试品溶液；

步骤2、混和对照品溶液制备

精密称定：丹参素对照品0.0016g，原儿茶酸对照品0.0020mg，原儿茶醛对照品0.0032g, 迷迭香酸对照品0.0025g，党参炔苷对照品0.0011 mg，紫草酸对照品0.0013g,丹酚酸B对照品0.0019g，混合置于10 ml 量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度线，超声至溶解，摇匀，作为混合对照品备用液；

步骤3、分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，其中：液相色谱条件：色谱柱为UniSil^®5-120 C18 Ultra色谱柱，其规格为色谱柱内径为4.6mm，色谱柱长度250 mm，色谱柱填料颗粒直径5 μm，流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.05%的甲酸水溶液，进行梯度洗脱，程序为：0min～15min，流动相为5%A、95%B，15min～30min，5%A上升至10%A、95%B下降至90%B；30min～60min，10%A上升至20%A、90%B下降至80%B；60min～80min，20%A上升至30%A、80%B下降至70%B，80min～100min，30%A，70%B，流速：1.0mL/min，进样量：20μL，柱温：30 ℃，检测波长：280 nm；

步骤4、将步骤3中获得的止痛化癥胶囊供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择十批不同批号止痛化癥胶囊的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰， 用平均值计算法，生成止痛化癥胶囊的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并根据对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。

2.根据权利要求1所述的一种止痛化癥胶囊的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：指纹图谱中选择32个共有峰作为止痛化癥胶囊指纹图谱的特征峰，以这些特征峰作为质量评价的变量指标，32个共有峰中丹参素为1号峰、保留时间11.561为分钟，原儿茶酸为2号峰、保留时间为14.534分钟，原儿茶醛为6号峰、保留时间为23.365分钟，迷迭香酸为23号峰、保留时间为68.808分钟，党参炔苷为24号峰、保留时间为69.455分钟，紫草酸为25号峰、保留时间为70.559，丹酚酸B为28号峰、保留时间为73.988分钟。