CN102998375A - 一种同时检测养血清脑颗粒中阿魏酸与芍药苷含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药领域，具体涉及一种同时检测养血清脑颗粒中阿魏酸与芍药苷的含量测定方法本发明所述的质量检测方法，本发明的芍药苷与阿魏酸的含量测定方法，包括对照品和供试品溶液的制备步骤和测定步骤，其中，对照品溶液的制备方法如下：取芍药苷对照品，加甲醇溶解即得，取阿魏酸对照品加甲醇溶解即得，其中，养血清脑颗粒供试样品溶液的制备方法如下：取养血清脑颗粒用碱性溶液溶解，溶液通过大孔吸附树脂洗脱收集甲醇洗脱液。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种同时检测养血清脑颗粒中阿魏酸与芍药苷的含量测定方法
背景技术
养血清脑颗粒是天津天士力制药股份有限公司研制的现代中药制剂，并于1996年获得国家新药证书，并于1999年被列入国家基本药物目录，2000年被列入国家医保药品目录。养血清脑颗粒是由当归、川芎、白芍、鸡血藤、决明子、延胡索等11味中药组成，并经现代高科技手段提取后，加入适当辅料，经混合制粒等制剂过程制成的一种颗粒剂。该制剂具有有效成分溶出快，生物利用度高等优点。养血清脑颗粒具有养血平肝，活血通络的功效，可用于血虚肝亢所致的头痛、眩晕眼花、心烦易怒、失眠多梦等病症，在临床上具有显著的疗效。
当归、川芎同为养血清脑颗粒中君药，两者所含化学成分较为相似(如阿魏酸、挥发油等)，《中国药典》2010年版中当归、川芎药材含量测定项中，均以阿魏酸为指标成分，而且阿魏酸有抗血栓、抗血小板凝聚等药理活性，可用于治疗脑血栓，这与本方的功能主治相符，因此以阿魏酸作为指标成分对养血清脑颗粒进行定量分析，可作为养血清脑颗粒质量检测的常规方法。
白芍为方中臣药，其主要成分为白芍总苷，其中芍药苷的活性较强，含量较大，因此对养血清脑颗粒中的芍药苷进行定量分析，亦可以作为养血清脑颗粒质量检测的常规方法。
但现有技术对测定君药的检测方法操作复杂，精度不高，实际操作过程中容易出现差错。
发明内容
所要解决的技术问题
本发明提供了一种同时检测养血清脑颗粒中阿魏酸与芍药苷的含量测定方法，解决了目前质量检测中的一些重要技术问题。
技术方案
本发明的养血清脑颗粒其处方如下：
主药：当归、川芎、白芍、熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、决明子、珍珠母、延胡索、细辛。
辅料为：糊精、甜菊素。
本发明提供一种养血清脑颗粒的质量检测方法，包括芍药苷与阿魏酸的含量测定方法。本发明的含量测定方法采用高效液相色谱法。
本发明的芍药苷与阿魏酸的含量测定方法，包括对照品和供试品溶液的制备步骤和测定步骤。
本发明的芍药苷与阿魏酸的含量测定方法，其中，对照品溶液的制备方法如下：
取芍药苷对照品，加甲醇溶解即得。
取阿魏酸对照品加甲醇溶解即得。
本发明的芍药苷与阿魏酸的含量测定方法，其中，养血清脑颗粒供试样品溶液的制备方法如下：
步骤1，取养血清脑颗粒用碱性溶液溶解，优选碳酸氢钠溶液，碳酸氢钠溶液的浓度优选的为0.1-0.6％，最优选为0.2％，此步骤中还可包括超声处理；
步骤2，溶液通过大孔吸附树脂洗脱，优选先用水洗脱，再用甲醇洗脱；优选采用D101型大孔吸附树脂柱(60～80目)；
步骤3，收集甲醇洗脱液。
本发明的芍药苷与阿魏酸的含量测定方法，其中，测定步骤采用高效液相色谱法，其色谱条件为：填充剂优选十八烷基硅胶键合硅胶，所用流动相优选异丙醇-甲醇-5mmol/L枸橼酸水溶液(2-4∶20-22∶78-80，优选2∶22∶78)，所用检测波长为240nm(芍药苷)、324nm(阿魏酸)；柱温30-35℃，优选30℃。理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于3000，按阿魏酸峰计算应不低于5000。
本发明优选的测定方法见实施例。
上述方法是经过筛选获得的，以下为筛选过程。
1.色谱条件的确定
1.1流动相比例的确定
试验中分别考察了以下流动相配比，见表1。
表1流动相配比考察表
| 流动相组成 | 异丙醇 | 甲醇 | 5mmol/L柠檬酸水溶液 |
| 流动相① | 4 | 20 | 78 |
| 流动相② | 2 | 22 | 78 |
| 流动相③ | 3 | 20 | 80 |
结果可知，使用流动相②时，芍药苷(RT＝16.227min)与阿魏酸(RT＝29.429min)出峰时间较为适中，且两色谱峰附近的基线较为平稳，芍药苷和阿魏酸在此条件下均与相邻峰得到较好的分离，因此最终优选流动相②的配比，即异丙醇-甲醇-5mmol/L柠檬酸水溶液(2∶22∶78)。
1.2柱温的选择
柱温不仅是影响出峰时间的因素，并且柱温升高或者降低，可增加某些化合物的选择性，因此，柱温也是液相色谱中较为关键的参数，需要考察后进行确定。
试验中分别考察了30℃、35℃、40℃的柱温对本品的分离效果。
结果可知，柱温为30℃时，芍药苷和阿魏酸的出峰时间均较适中，且基线较为平稳，最终优选柱温为30℃。
2.供试品溶液制备方法条件的选择
2.1超声时间的确定
取样品适量(批号：2009L19)，研细，取约0.08g，共3份，每份取平行样，精密称定，置10ml容量瓶中，加入0.2％碳酸氢钠溶液5ml，分别超声处理(功率500W，频率30kHz)5分钟、10分钟、15分钟，继续用0.2％碳酸氢钠溶液定容至刻度，摇匀，离心(2000转/分钟)2分钟，取上清液，过0.45μm的滤膜，即得，作为供试品溶液。按照上述色谱条件，进样20μl测定，并对测定结果进行统计，结果见下表2。
表2超声时间的考察
为了排除取样量对峰面积的影响，故选用“峰面积/称样量”作为比较的指标。由上表2可知，超声10分钟、超声15分钟的阿魏酸峰面积/称样量与超声5分钟的阿魏酸峰面积/称样量比较，其相对平均偏差分别为-0.22％与0.20％，均小于平行样品测定时的分析误差(2％)，因此，超声各时间下的数据不具有显著性差异，可认为超声5分钟即可将样品中阿魏酸完全提取。故最终优选超声时间为5分钟。
2.2大孔吸附树脂柱洗脱程序
大孔吸附树脂柱洗脱过程主要起纯化供试品溶液，保护色谱柱，并使待分析成分较易分离。但是这一过程也是影响方法准确性的关键步骤，因此需要进行逐步考察。
取样品适量(批号：2009L03)，研细，取约0.08g，精密称定，置10ml容量瓶中，加入0.2％碳酸氢钠溶液5ml，超声处理(功率500W，频率30kHz)5分钟，加在D101型大孔吸附树脂柱(60～80目，内径8～10mm，高约9～10cm)上，分别以3ml、2ml的体积收集流出液，作为供试品(1)～(2)；用水15ml洗脱，分别每3ml为收集一份洗脱液，作为供试品(3)～(7)；再用甲醇10ml洗脱，分别每2ml收集一份洗脱液，作为供试品(8)～(12)。分别精密吸取上述供试品溶液，按照上述液相条件，进样20μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。
经分析可知，芍药苷部分：上样洗脱液和水洗液中均未检出芍药苷，甲醇洗脱液10ml可将芍药苷全部洗脱。阿魏酸部分：上样洗脱液中未检出阿魏酸，水洗液在第三份中可检出阿魏酸，阿魏酸的浓度在此份溶液中处于稍小于检出限状态，因此可认为水洗时水洗量在6ml以上时会将阿魏酸洗脱下来，甲醇10ml可将阿魏酸全部洗脱。综上所述，最终确定供试品处理方法为使用大孔树脂柱的规格为(60～80目，内径8～10mm，高约9～10cm)，除杂用水量为5ml，甲醇洗脱用量为9ml。
3.检测波长的确定
由于供试品溶液中所含成分较为复杂，其它成分对待测成分的最大吸收波长会产生一定影响，因此在确定了供试品溶液的制备方法后，需要对该液相条件下的待测成分的进行DAD全波长扫描，确定其最大吸收波长。
取本品适量(批号：2009L03)，研细，取约0.08g(万分之一天平)，精密称定，置10ml容量瓶中，加入0.2％碳酸氢钠溶液5ml，超声处理(功率500W，频率30kHz)5分钟，加在D101型大孔吸附树脂柱(60～80目，内径8～10mm，高约9～10cm)上，用水5ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇9ml洗脱，收集洗脱液于10ml量瓶中加水至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得，作为供试品溶液。分别精密吸取供试品溶液，按照上述液相条件，进样20μl分析。
由HPLC三维图谱可知，在该色谱条件下分离供试品溶液中的阿魏酸与芍药苷，其最大吸收峰波长分别为324nm、240nm，因此优选324nm作为本品阿魏酸的检测波长，240nm作为本品芍药苷的检测波长。
有益效果
本发明所提供的养血清脑颗粒中芍药苷和阿魏酸含量的检测方法，是通过大量具体创造性试验筛选后得到的，通过对样品、供试品处理方法的筛选，流动相的选择，建立了一种使用同一色谱条件同一份供试品同时测定芍药苷和阿魏酸含量的HPLC分析方法，该方法操作简便，重复性和稳定性好，结果准确可靠，可作为养血清脑颗粒的含量检测方法。
为了进一步说明本发明方法的有益效果，将方法学验证数据汇总如下：
本发明中，检测出养血清脑颗粒中阿魏酸及芍药苷的含量，方法简便，重复性和稳定性好，结果准确可靠，可作为养血清脑颗粒的含量检测方法。
试验中比较不同的流动相系统，发现异丙醇-甲醇-枸橼酸水溶液系统能使本品中阿魏酸，芍药苷得到很好的分离，且经过不同的流动相配比选择，故本发明最终选择了异丙醇-甲醇-5mmol/L枸橼酸水溶液(2-4∶20-22∶78-80)作为流动相。
附图说明
图1，同时检测养血清脑颗粒中阿魏酸与芍药苷的含量的HPLC图谱
具体实施方式
实施例1
色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以异丙醇-甲醇-5mmol/L枸橼酸水溶液(2∶22∶78)为流动相；检测波长为240nm(芍药苷)、324nm(阿魏酸)；柱温30℃。理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于3000，按阿魏酸峰计算应不低于5000。
对照品溶液的制备取芍药苷对照品约10mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加70％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。取阿魏酸对照品约10mg，精密称定，置50ml棕色容量瓶中，加70％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。再精密量取上述芍药苷对照品溶液20ml，及阿魏酸对照品溶液2ml，置同一100ml棕色容量瓶中，加70％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备取本品适量，研细，取约0.08g，精密称定，置10ml容量瓶中，加入0.2％碳酸氢钠溶液5ml，超声处理(功率500W，频率30kHz)5分钟，加在D101型大孔吸附树脂柱(60～80目，内径8～10mm，高约9～10cm)上，用水5ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇9ml洗脱，收集洗脱液于10ml量瓶中加水至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例2
色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以异丙醇-甲醇-5mmol/L枸橼酸水溶液(4∶20∶78)为流动相；检测波长为240nm(芍药苷)、324nm(阿魏酸)；柱温30℃。理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于3000，按阿魏酸峰计算应不低于5000。
对照品溶液的制备取芍药苷对照品约10mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加70％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。取阿魏酸对照品约20mg，精密称定，置100ml棕色容量瓶中，加70％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。再精密量取上述芍药苷对照品溶液20ml，及阿魏酸对照品溶液2ml，置同一100ml棕色容量瓶中，加70％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备取本品适量，研细，取约0.08g，精密称定，置10ml容量瓶中，加入0.2％碳酸氢钠溶液5ml，超声处理(功率500W，频率30kHz)5分钟，加在D101型大孔吸附树脂柱(60～80目，内径8～10mm，高约9～10cm)上，用水5ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇9ml洗脱，收集洗脱液于10ml量瓶中加水至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例3
色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以异丙醇-甲醇-5mmol/L枸橼酸水溶液(2∶22∶78)为流动相；检测波长为240nm(芍药苷)、324nm(阿魏酸)；柱温35℃。理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于3000，按阿魏酸峰计算应不低于5000。
对照品溶液的制备取芍药苷对照品约10mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加70％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。取阿魏酸对照品约10mg，精密称定，置50ml棕色容量瓶中，加70％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。再精密量取上述芍药苷对照品溶液20ml，及阿魏酸对照品溶液2ml，置同一100ml棕色容量瓶中，加70％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备取本品适量，研细，取约0.08g，精密称定，置10ml容量瓶中，加入0.2％碳酸氢钠溶液5ml，超声处理(功率500W，频率30kHz)10分钟，加在D101型大孔吸附树脂柱(60～80目，内径8～10mm，高约9～10cm)上，用水5ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇9ml洗脱，收集洗脱液于10ml量瓶中加水至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
Claims (10)
1.一种养血清脑颗粒的质量检测方法，其特征在于，包括采用高效液相色谱法测定养血清脑颗粒中芍药苷与阿魏酸的含量，其中操作步骤如下：
步骤1，对照品溶液和养血清脑颗粒供试品溶液的制备；
步骤2，采用高效液相色谱法测定。
2.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，其中，对照品溶液的制备方法如下：取芍药苷对照品，加甲醇溶解即得，取阿魏酸对照品加甲醇溶解即得；
其中，养血清脑颗粒供试样品溶液的制备方法如下：
步骤1，取养血清脑颗粒用碱性溶液溶解，
步骤2，溶液通过大孔吸附树脂洗脱，
步骤3，收集甲醇洗脱液。
3.根据权利要求2的检测方法，其特征在于，其中，步骤1中碱性溶液为浓度为0.1-0.6％的碳酸氢钠溶液，步骤1中还包括溶解过程中用超声处理。
4.根据权利要求3的检测方法，其特征在于，其中步骤1中碳酸氢钠溶液的浓度为0.2％。
5.根据权利要求2的检测方法，其特征在于，其中步骤2中采用D101型大孔吸附树脂柱(60～80目)，先用水洗脱，再用甲醇洗脱。
6.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，其中，测定步骤采用高效液相色谱法，其色谱条件为：填充剂为十八烷基硅胶键合硅胶，流动相为异丙醇-甲醇-5mmol/L枸橼酸水溶液(2-4∶20-22∶78-80，)，所用检测波长为240nm芍药苷、324nm阿魏酸；柱温30-35℃，理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于3000，按阿魏酸峰计算应不低于5000。
7.根据权利要求6的检测方法，其特征在于，所用流动相为异丙醇-甲醇-5mmol/L枸橼酸水溶液＝2：22：78，柱温30℃。
8.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，步骤如下：
色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以异丙醇-甲醇-5mmol/L枸橼酸水溶液(2∶22∶78)为流动相；检测波长为240nm芍药)、324nm阿魏酸；柱温30℃，理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于3000，按阿魏酸峰计算应不低于5000，
对照品溶液的制备取芍药苷对照品约10mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加70％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，取阿魏酸对照品约10mg，精密称定，置50ml棕色容量瓶中，加70％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取上述芍药苷对照品溶液20ml，及阿魏酸对照品溶液2ml，置同一100ml棕色容量瓶中，加70％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，
供试品溶液的制备取本品适量，研细，取约0.08g，精密称定，置10ml容量瓶中，加入0.2％碳酸氢钠溶液5ml，超声处理5分钟，加在D101型大孔吸附树脂柱上，用水5ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇9ml洗脱，收集洗脱液于10ml量瓶中加水至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得，
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
9.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，步骤如下：
色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以异丙醇-甲醇-5mmol/L枸橼酸水溶液(4∶20∶78)为流动相；检测波长为240nm(芍药苷)、324nm(阿魏酸)；柱温30℃，理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于3000，按阿魏酸峰计算应不低于5000，
对照品溶液的制备取芍药苷对照品约10mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加70％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，取阿魏酸对照品约20mg，精密称定，置100ml棕色容量瓶中，加70％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取上述芍药苷对照品溶液20ml，及阿魏酸对照品溶液2ml，置同一100ml棕色容量瓶中，加70％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，
供试品溶液的制备取本品适量，研细，取约0.08g，精密称定，置10ml容量瓶中，加入0.2％碳酸氢钠溶液5ml，超声处理5分钟，加在D101型大孔吸附树脂柱上，用水5ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇9ml洗脱，收集洗脱液于10ml量瓶中加水至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得，
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
10.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，步骤如下：
色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以异丙醇-甲醇-5mmol/L枸橼酸水溶液(2∶22∶78)为流动相；检测波长为240nm芍药苷、324nm阿魏酸；柱温35℃，理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于3000，按阿魏酸峰计算应不低于5000，
对照品溶液的制备取芍药苷对照品约10mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加70％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，取阿魏酸对照品约10mg，精密称定，置50ml棕色容量瓶中，加70％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取上述芍药苷对照品溶液20ml，及阿魏酸对照品溶液2ml，置同一100ml棕色容量瓶中，加70％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，
供试品溶液的制备取本品适量，研细，取约0.08g，精密称定，置10ml容量瓶中，加入0.2％碳酸氢钠溶液5ml，超声处理10分钟，加在D101型大孔吸附树脂柱上，用水5ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇9ml洗脱，收集洗脱液于10ml量瓶中加水至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得，
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
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