CN104215701B - 一种测定养血清脑有效成分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种药物检测方法，特别涉及一种测定养血清脑有效成分的方法，包括步骤如下：（1）样品处理：取血浆样品，加入酸溶液和内标溶液中，涡旋混合；之后加入有机溶剂涡旋混合进行液液萃取；上述混合液离心后取有机溶剂层，吹干，然后用流动相复溶后离心，取上清液进样测定；（2）采用液质联用仪进行测定。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物检测方法，特别涉及一种测定养血清脑有效成分的方法。
背景技术
养血清脑颗粒是天士力集团根据中医药传统理论,采用最新的工艺独家研制生产的现代中药,1999年获国家新药发明专利,对慢性脑供血不足(CCCI)及其他原因引起的头晕、头痛、失眠、健忘等有显著疗效，现已成为天士力集团的重点产品。养血清脑颗粒的配方描述在"一种治疗头痛的中药"、专利号为931000505的发明专利中，其组成包括，当归4-9%，川穹4-9%，白芍2-8%，熟地2-8%，勾藤10一15%，鸡血藤10-15%，夏枯草10一15%，决明子10一15%，珍珠母10-15%，元胡4-9%，细辛0.5-2%。"养血清脑颗粒"已经列入国家药品标准，标准号为WS3-258(Z一036)-2001(Z)。
上述配方，根据临床需要也可以制备成片剂，胶囊，口服液等剂型，疗效相同。由于中药物质基础复杂，之前并没有人进行过养血清脑中主要化学成分的药动学实验，因此需要开发一个特异性好、灵敏度高、定量准确的含量测定方法来测定血浆中有效物质的含量。本实验采用液质联用仪器，建立了一种能够同时测定养血清脑中6种有效成分原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、芍药苷的血药浓度测定方法，而且该方法专属性好、灵敏度高、精密度、准确度、提取回收率和稳定性等均达到体内药物分析的要求，之后又利用该方法对6种有效成分在大鼠体内的药动学特征进行了考察。
发明内容
本发明提供一种测定养血清脑有效成分的方法，该方法可用于服药后有效成分的血药浓度的测定，有利于对服用该药物后进行有效成分的吸收利用相关的药物测定。
本发明所述方法是针对养血清脑制剂的，所述制剂包括养血清脑颗粒，也包括用上述配方制备的养血清脑片剂，胶囊，口服液等剂型。养血清脑制剂中包括多种有效成分，目前已知的有效成分包括原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、芍药苷等，本发明根据临床需要，研究出一种同时测定血浆中上述6种有效成分的方法，本发明所述方法，采用液质联用法，所述方法的详细描述如下：
（1）样品处理：取血浆样品（给包括人在内的动物服用养血清脑制剂，一定时间后，取血，分离得到血浆）1-3体积，加入0.2-2体积酸溶液和0.2-1体积内标溶液（配制方法如下：精密称定氯霉素1.0mg置于10Ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得储备液，取储备液适量并用甲醇稀释至所需浓度），涡旋混合；之后加入10-50体积有机溶剂涡旋混合进行液液萃取；上述混合液离心后取有机溶剂层，吹干，然后用1-2体积液相流动相复溶后离心，取上清液进样测定，其中流动相含50%-90%A相，其余为B相；
（2）采用液质联用仪进行测定：
其中液相部分色谱条件：采用反相c18或c8硅胶色谱柱作为分离介质，进样后梯度洗脱，其中，流动相A0.02-5%(甲酸或乙酸)水，B乙腈或甲醇；梯度洗脱条件：0-2.5min(10%B、90%A)；2.51-5min(100%B)；5.1-20min(10%B、90%A)；流速；0.1-0.4ml/min；柱温15-40℃；
质谱检测条件：负离子检测模式；喷雾电压：-2500—-3500v；毛细管温度：250-400℃；鞘气：N2（5-25psi）；辅助气：N2（1-15arb）；碰撞气体压力：Ar1.5mTorr；扫描时间：0.1-1s；
采用选择反应监测模式（SRM）：
原儿茶酸离子对m/z153→109或153→91CE=10-30v;
绿原酸m/z353→191或353→85CE=10-40v;
咖啡酸m/z179→135或179→108CE=10-45v；
阿魏酸m/z193→134或193→178CE=5-30v；
迷迭香酸m/z359→161或359→197或133CE=10-50V；
芍药苷m/z525→449或525→121CE=10-30V；
氯霉素m/z321→152CE=10-40V。
以上检测方法，其中，步骤1中所述的酸溶液选自，盐酸，0.1-10%的甲酸或0.01-0.2%的磷酸。优选1%的甲酸或0.05%的磷酸。步骤1中所述的内标溶液是：
丹参素、酮洛芬、氯霉素、弗比洛芬中的一种。
步骤2中所述的有机溶剂为：乙酸乙酯，二氯甲烷或3：1体积比的三氯甲烷与正己烷的混合溶剂。
根据以上检测方法，得到相应的色谱图，根据标准曲线和相关色谱峰的面积，即可计算出各有效成分的含量。
其中所述的标准曲线是将标准品原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、芍药苷作为样品，配制成不同浓度，用同样的色谱条件进行检测得到的不同浓度标准品的色谱图，得到这些成分的标准曲线。
优选的，本发明的测定方法，步骤如下：
（1）样品处理：取血浆样品1-3体积，加入0.2-2体积0.05-5mol/L的盐酸溶液和0.2-1体积100-300ng/ml浓度的丹参素、酮洛芬、氯霉素或弗比洛芬溶液适量，涡旋混合；之后加入10-50体积乙酸乙酯，二氯甲烷或3：1体积比的三氯甲烷与正己烷的混合溶剂涡旋混合进行液液萃取；上述混合液在3000-7000r/min下离心后取有机层，在30-55℃水浴下氮气吹干，然后用1-2体积液相复溶后离心，取上清液进样测定，其中流动相包含60%-80%A，其余为B；
（2）采用液质联用仪进行测定：
液相分离：液质联用仪的液相部分采用反相c18硅胶色谱柱为作为分离介质，进样后梯度洗脱；
流动相A0.02-5%甲酸水，B乙腈或甲醇，梯度洗脱条件：0-2.5min(10%B、90%A)；2.51-5min(100%B)；5.1-20min(10%B、90%A)；流速：0.1-0.4ml/min；柱温15-40℃。
质谱检测：负离子检测模式；喷雾电压：-2500—-3500v；毛细管温度：250-400℃；鞘气：N2（5-25psi）；辅助气：N2（1-15arb）；碰撞气体压力：Ar1.5mTorr；
扫描时间：0.1-1s；
采用选择反应监测模式（SRM）：
原儿茶酸离子对m/z153→109或153→91CE=10-30v;
绿原酸m/z353→191或353→85CE=10-40v;
咖啡酸m/z179→135或179→108CE=10-45v；
阿魏酸m/z193→134或193→178CE=5-30v；
迷迭香酸m/z359→161或359→197或133CE=10-50V；
芍药苷m/z525→449或525→121CE=10-30V；
氯霉素m/z321→152CE=10-40V。
更优选的，本发明的测定方法，步骤如下：
（1）样品处理：取1体积血浆样品，加入1体积0.05-5mol/L盐酸溶液和0.2-1体积内标100-300ng/L浓度的氯霉素溶液，涡旋混合10s-2min；之后加入10-50体积乙酸乙酯涡旋混合1-8min进行液液萃取；上述混合液在4500r/min离心后取乙酸乙酯层，在，35℃水浴下氮气吹干，然后用，然后用1倍体积的流动相（80%A:20%B）复溶，10000-15000r/min离心1-6min后取上清液进样测定；
（2）采用液质联用仪进行测定：
液相分离：液质联用仪的液相部分采用反相c18硅胶色谱柱作为分离介质，进样后梯度洗脱；
流动相A0.1%甲酸水，B乙腈，梯度洗脱条件：0-2.5min(10%B)；2.51-5min(100%B)；5.1-20min(10%B)；流速：0.2ml/min；柱温30℃。
质谱检测：负离子检测模式；喷雾电压：3000v；毛细管温度：350℃；鞘气：N2（20psi）；辅助气：N2（5arb）；碰撞气体压力：Ar1.5mTorr；扫描时间：0.2s；
采用选择反应监测模式（SRM）：
原儿茶酸m/z153→109CE=19V;
绿原酸m/z353→191CE=18V；
咖啡酸m/z179→135CE=18V；
阿魏酸m/z193→134CE=28V；
迷迭香酸m/z359→161CE=25V；
芍药苷m/z525→449CE=18V；
氯霉素m/z321→152CE=28V。
最优选的，本发明的测定方法，步骤如下：
（1）样品处理：取1体积血浆样品，加入1体积1mol/L盐酸溶液和内标1体积的氯霉素200ng/ml溶液，涡旋混合30s；之后加入30体积乙酸乙酯涡旋混合3min进行液液萃取；上述混合液在4500r/min离心后取乙酸乙酯层，35℃在水浴下氮气吹干，然后用，然后用1体积的流动相80%A:20%B复溶，涡旋30s，12000r/min离心3min后取上清液进样测定；
（2）采用液质联用仪进行测定：
液相分离：液质联用仪的液相部分采用反相c18硅胶色谱柱为作为分离介质，进样后梯度洗脱；
流动相A0.1%甲酸水，B乙腈，梯度洗脱条件：0-2.5min(10%B、90%A)；2.51-5min(100%B)；5.1-20min(10%B、90%A)；流速：0.2ml/min；柱温30℃。
质谱检测：负离子检测模式；喷雾电压：3000v；毛细管温度：350℃；鞘气：N2（20psi）；辅助气：N2（5arb）；碰撞气体压力：Ar1.5mTorr；扫描时间：0.2s；
采用选择反应监测模式（SRM）：
原儿茶酸m/z153→109CE=19V;
绿原酸m/z353→191CE=18V；
咖啡酸m/z179→135CE=18V；
阿魏酸m/z193→134CE=28V；
迷迭香酸m/z359→161CE=25V；
芍药苷m/z525→449CE=18V；
氯霉素m/z321→152CE=28V。
本发明的检测方法，是经过筛选获得的，筛选实验如下：
一、实验目的：
通过液质联用定量方法，建立一种专属性好，灵敏度高的6种有效成分血药浓度同时测定的方法，以满足口服给药养血清脑颗粒后6种有效成分药动学数据测定的要求。
二、材料和方法：
（一）实验材料：
原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、芍药苷和氯霉素（内标）对照品均购自中国食品药品检定研究院（纯度>98%,）；乙酸乙酯（分析纯，康科德公司），盐酸（分析纯，康科德公司），甲酸（色谱纯，天津科密欧公司），乙腈（色谱纯，德国Merck公司），养血清脑颗粒（天津天士力制药股份有限公司提供）。
TSQ quantum液相色谱/质谱联用仪，包括电喷雾离子源（ESI）、Xcalibur1.3数据处理系统（热电公司）；Surveyor液相色谱系统（热电公司）；飞鸽牌台式离心机，METTLER分析天平（瑞士梅特勒公司）；XW-80A涡旋混合器（上海医科大学仪器厂）
SPF级Wistar雌雄大鼠6只，体质量（240±10）g,购于北京维通利华动物中心（动物合格证号：SCXK（京）2012-0001）。大鼠实验前12h禁食不禁水。
（二）实验方法
2.1、血浆样品预处理：
100μL血浆置于塑料离心管中，加入100μL（200ng/mL）的氯霉素标准溶液（内标），涡旋混合，加入100μL（1mol/L）HCl涡旋酸化30s，再加入3mL乙酸乙酯进行液液萃取，涡旋振荡3min,于4500r/min离心10min,取上清液置于另一离心管中，在35℃氮气流下吹干，残渣中加入100μL流动相，涡旋溶解，12000g离心3min，取上清进样20uL。
2.2、方法学验证
2.2.1专属性
分别取6只大鼠的空白血浆100μL，除不加内标外，按“2.1血浆样品预处理”项下操作，进样分析，获得空白血浆样品的色谱图；将一定浓度6种化合物的对照品溶液及内标溶液加入空白血浆中，依同法操作得空白血浆+对照品+内标的色谱图；取大鼠给药后45min的血浆样品，依同法操作，得大鼠血浆样品色谱图。在拟定的分析条件下，得到6种成分的色谱图(见图1-3)。由图可见在本实验条件下，血浆中内源性物质不干扰6种成分和内标化合物的检测，方法专属性良好。
2.2.2标准曲线和线性范围
精密称定原儿茶酸（1.0mg）、绿原酸（1.0mg）咖啡酸（1.0mg）、阿魏酸（5.0mg）、迷迭香酸（1.5mg）、芍药苷（6.0mg）置于10mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得混合储备液。储备液置于4℃冰箱避光保存。临用前用50%甲醇溶解并稀释至所需浓度。精密量取对照品溶液适量，稀释成系列标准溶液，按“2.1”项处理后检测，进样分析，记录色谱图，以样品峰面积与内标峰面积比值为纵坐标（Y），以血药浓度（c）为横坐标（X）绘制标准曲线，相关系数符合要求，见下表。
表1线形关系
2.2.3精密度实验
取大鼠空白血浆，配制低、中、高三不同浓度的质控样品（QC），每种浓度6个样本，连续测定3d，根据当天的标准曲线计算QC样品的测定浓度，根据QC样品结果计算精密度。结果见表2，上述方法测得的日内、日间RSD小于15%，均符合生物分析方法指导原则的要求。
表2精密度
2.2.4提取回收率实验
取空白血浆加入低、中、高三个不同浓度的对照品溶液配制成质控样品（QC），按“2.1”项下操作，每个浓度点平行5个样品，进样分析，得6种成分的峰面积（set1）。同时取另一组空白血浆，按“2.1”项下操作，用低、中、高三个不同浓度的对照品溶液复溶，进样分析记录峰面积（set2），用set1/set2计算得到6种化合物的提取回收率，结果见表3。
表3提取回收率
由上表3可知所有样品的回收率均大于50%，RSD均小于6.0%符合规定。
2.2.5样品稳定性实验
方法学验证过程中，对分析样品的稳定性进行考察，包括‐20℃冷冻条件下保存长期稳定性以及3次冻融循环稳定性，将低、中、高3个浓度的标准生物样品在上述条件下保存后分析测定得到的样品与内标峰面积比值，与初始比值相比，所得结果以百分比表示，结果见表4。
表4稳定性实验
由表4可知RSD均小于6.62%，说明所有样品的稳定性符合要求。
2.3动物实验
取Wistar大鼠6只，实验前禁食12h，自由饮水。按20g/kg剂量灌胃给予养血清脑后，于0、0.083、0.166、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5、7、9、12和24h从眼眶取血0.5mL,置于预先肝素化离心管试管中，离心（4500rpm）10min,分取血浆，置于-20℃保存待测。
2.4测定条件：
液相条件：A0.1%甲酸水，B乙腈：0-2.5min(10%A)；2.51-5min(100%B)；5.1-20min(10%A)；柱温30℃。
质谱条件：电喷雾电离源（ESI）；负离子模式；喷雾电压：3000v；毛细管温度：350℃；鞘气：N2（20psi）；辅助气：N2（5psi）；碰撞气体压力：Ar1.5mTorr；选择反应监测模式（SRM）：原儿茶酸m/z153→109CE=19V;
绿原酸m/z353→191CE=18V；咖啡酸179→135CE=18V；阿魏酸m/z193→134CE=28V；迷迭香酸m/z359→161CE=25V；芍药苷m/z525→449CE=18V；
氯霉素m/z321→152CE=28V；扫描时间：0.2s。
2.5数据处理
采用topfit药动学软件处理血药浓度-时间数据，得到6种化合物的药动学参数，见表5。
三、实验结果
（一）方法学
如上所述（图1，表1-4），方法学验证显示该方法专属性好；精密度：日内RSD小于6.6%，日间RSD小于11.68%；提取回收率：RSD均小于6.0%；稳定性实验：长期稳定性实验RSD均小于5.92%，3次冻融稳定性实验RSD均小于6.62%，以上结果均符合生物样品含量测定的要求。
（二）药动学实验
经实验测定和topfit软件计算，6种化合物在大鼠体内药动学数据如下表
表5养血清脑口服给药后6种化合物大鼠体内药动学参数（n=6mean±SD）
四、结论：
本实验采用液质联用仪器，建立了一种同时测定养血清脑颗粒中6种有效成分的血药浓度测定方法，该方法专属性好，灵敏度高，精密度、准确度、提取回收率和稳定性等均达到体内药物分析的要求。之后又利用该方法对上述6种化合物在大鼠体内的药动学特征进行了考察，药物半衰期和药时曲线下面（AUC）分别为原儿茶酸（5.75±0.45）h、AUC0-∞（789±316）(ng.min/ml)；绿原酸（2.50±0.99）h、AUC0-∞（1243±486）(ng.min/ml)；咖啡酸（2.28±1.02）h、AUC0-∞（2043.3±657.8）(ng.min/ml)；阿魏酸（2.26±0.269）h、AUC0-∞（5258±1535.3）(ng.min/ml)；迷迭香酸（3.43±1.28）h、AUC0-∞（1604±556）；芍药苷（3.43±1.28）h、AUC0-∞（1604±556）。
附图说明
图1：空白血浆；
图2：空白血浆加入对照品和内标；其中峰的编号分别代表以下成分：1.原儿茶酸2.咖啡酸3.阿魏酸4.内标氯霉素5.绿原酸6.迷迭香酸7.芍药苷
图3：给药后45min的血浆样品；其中峰的编号分别代表以下成分：1.原儿茶酸2.咖啡酸3.阿魏酸4.内标氯霉素5.绿原酸6.迷迭香酸7.芍药苷
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
本发明的测定方法，步骤如下：
（1）样品处理：取1体积血浆样品加入1体积1mol/L盐酸溶液和内标1体积的氯霉素200ng/ml溶液，涡旋混合30s；之后加入30倍体积乙酸乙酯涡旋混合3min进行液液萃取；上述混合液在4500r/min离心后取乙酸乙酯层，35℃在水浴下氮气吹干，然后用，然后用1体积的流动相80%A:20%B复溶，涡旋30s，12000r/min离心3min后取上清液进样测定；
（2）采用液质联用仪进行测定：
液相分离：液质联用仪的液相部分采用反相c18硅胶色谱柱为作为分离介质，进样后梯度洗脱；
流动相A0.1%甲酸水，B乙腈，梯度洗脱条件：0-2.5min(10%B、90%A)；2.51-5min(100%B)；5.1-20min(10%B、90%A)；流速：0.2ml/min；柱温30℃。
质谱检测：负离子检测模式；喷雾电压：3000v；毛细管温度：350℃；鞘气：N2（20psi）；辅助气：N2（5arb）；碰撞气体压力：Ar1.5mTorr；扫描时间：0.2s；
采用选择反应监测模式（SRM）：
原儿茶酸m/z153→109CE=19V;
绿原酸m/z353→191CE=18V；
咖啡酸m/z179→135CE=18V；
阿魏酸m/z193→134CE=28V；
迷迭香酸m/z359→161CE=25V；
芍药苷m/z525→449CE=18V；
氯霉素m/z321→152CE=28V。
得出检测结果
实施例2
一种测定养血清脑有效成分的方法，步骤如下：
（1）样品处理：取血浆样品1体积，加入0.2体积盐酸溶液和0.2体积酮洛芬内标溶液，涡旋混合；之后加入10体积乙酸乙酯有机溶剂涡旋混合进行液液萃取；上述混合液离心后取有机溶剂层，吹干，然后用1体积液相（流动相60%A，其余为B）复溶后离心，取上清液进样测定；
（2）采用液质联用仪进行测定：
其中液相部分色谱条件：采用反相c18或c8硅胶色谱柱作为分离介质，进样后梯度洗脱，其中，流动相A0.02%甲酸、乙酸或水，B乙腈或甲醇；梯度洗脱条件：
0-2.5min10%B、90%A；
2.51-5min100%B；
5.1-20min10%B、90%A；
流速；0.1ml/min；柱温15℃；
质谱检测条件：负离子检测模式；喷雾电压：-2500v；毛细管温度：250℃；鞘气：N25psi；辅助气：N2 1arb；碰撞气体压力：Ar1.5mTorr；扫描时间：0.1s；
采用选择反应监测模式：
原儿茶酸离子对m/z153→109或153→91CE=10-30v;
绿原酸m/z353→191或353→85CE=10-40v;
咖啡酸m/z179→135或179→108CE=10-45v；
阿魏酸m/z193→134或193→178CE=5-30v；
迷迭香酸m/z359→161或359→197或133CE=10-50V；
芍药苷m/z525→449或525→121CE=10-30V；
实施例3
一种测定养血清脑有效成分的方法，步骤如下：
（1）样品处理：取血浆样品3体积，加入2体积甲酸溶液和1体积丹参素内标溶液，涡旋混合；之后加入50体积有机溶剂涡旋混合进行液液萃取；上述混合液离心后取有机溶剂层，吹干，然后用2体积液相(流动相80%A,其余为B)复溶后离心，取上清液进样测定；
（2）采用液质联用仪进行测定：
其中液相部分色谱条件：采用反相c18或c8硅胶色谱柱作为分离介质，进样后梯度洗脱，其中，流动相A5%甲酸、乙酸或水，B乙腈或甲醇；梯度洗脱条件：
0-2.5min10%B、90%A；
2.51-5min100%B；
5.1-20min10%B、90%A；
流速；0.4ml/min；柱温40℃；
质谱检测条件：负离子检测模式；喷雾电压：-3500v；毛细管温度：400℃；鞘气：N225psi；辅助气：N2 15arb；碰撞气体压力：Ar1.5mTorr；扫描时间：1s；
采用选择反应监测模式：
原儿茶酸离子对m/z153→109或153→91CE=10-30v;
绿原酸m/z353→191或353→85CE=10-40v;
咖啡酸m/z179→135或179→108CE=10-45v；
阿魏酸m/z193→134或193→178CE=5-30v；
迷迭香酸m/z359→161或359→197或133CE=10-50V；
芍药苷m/z525→449或525→121CE=10-30V；
实施例4
一种测定养血清脑有效成分的方法，步骤如下：
（1）样品处理：取血浆样品3体积，加入2体积0.1%的甲酸溶液和1体积丹参素内标溶液，涡旋混合；之后加入50体积3：1体积比的三氯甲烷与正己烷的混合溶剂有机溶剂涡旋混合进行液液萃取；上述混合液离心后取有机溶剂层，吹干，然后用2体积液相(流动相90%A，其余为B)复溶后离心，取上清液进样测定；
（2）采用液质联用仪进行测定：
其中液相部分色谱条件：采用反相c18或c8硅胶色谱柱作为分离介质，进样后梯度洗脱，其中，流动相A5%甲酸、乙酸或水，B乙腈或甲醇；梯度洗脱条件：
0-2.5min10%B、90%A；
2.51-5min100%B；
5.1-20min10%B、90%A；
流速；0.4ml/min；柱温40℃；
质谱检测条件：负离子检测模式；喷雾电压：-3500v；毛细管温度：400℃；鞘气：N225psi；辅助气：N2 15arb；碰撞气体压力：Ar1.5mTorr；扫描时间：1s；
采用选择反应监测模式：
原儿茶酸离子对m/z153→109或153→91CE=10-30v;
绿原酸m/z353→191或353→85CE=10-40v;
咖啡酸m/z179→135或179→108CE=10-45v；
阿魏酸m/z193→134或193→178CE=5-30v；
迷迭香酸m/z359→161或359→197或133CE=10-50V；
芍药苷m/z525→449或525→121CE=10-30V；
实施例5
一种测定养血清脑有效成分的方法，步骤如下：
（1）样品处理：取血浆样品3体积，加入2体积10%的甲酸溶液和1体积丹参素内标溶液，涡旋混合；之后加入50体积3：1体积比的三氯甲烷与正己烷的混合溶剂有机溶剂涡旋混合进行液液萃取；上述混合液离心后取有机溶剂层，吹干，然后用2体积液相（流动相50%A，其余为B）复溶后离心，取上清液进样测定；
（2）采用液质联用仪进行测定：
其中液相部分色谱条件：采用反相c18或c8硅胶色谱柱作为分离介质，进样后梯度洗脱，其中，流动相A5%甲酸、乙酸或水，B乙腈或甲醇；梯度洗脱条件：
0-2.5min10%B、90%A；
2.51-5min100%B；
5.1-20min10%B、90%A；
流速；0.4ml/min；柱温40℃；
质谱检测条件：负离子检测模式；喷雾电压：-3500v；毛细管温度：400℃；鞘气：N225psi；辅助气：N2 15arb；碰撞气体压力：Ar1.5mTorr；扫描时间：1s；
采用选择反应监测模式：
原儿茶酸离子对m/z153→109或153→91CE=10-30v;
绿原酸m/z353→191或353→85CE=10-40v;
咖啡酸m/z179→135或179→108CE=10-45v；
阿魏酸m/z193→134或193→178CE=5-30v；
迷迭香酸m/z359→161或359→197或133CE=10-50V；
芍药苷m/z525→449或525→121CE=10-30V；
实施例6
一种测定养血清脑有效成分的方法，步骤如下：
（1）样品处理：取血浆样品3体积，加入2体积0.01%的磷酸溶液和1体积弗比洛芬内标溶液，涡旋混合；之后加入50体积3：1体积比的三氯甲烷与正己烷的混合溶剂有机溶剂涡旋混合进行液液萃取；上述混合液离心后取有机溶剂层，吹干，然后用2体积液相流动相80%A复溶后离心，取上清液进样测定；
（2）采用液质联用仪进行测定：
其中液相部分色谱条件：采用反相c18或c8硅胶色谱柱作为分离介质，进样后梯度洗脱，其中，流动相A5%甲酸、乙酸或水，B乙腈或甲醇；梯度洗脱条件：
0-2.5min10%B、90%A；
2.51-5min100%B；
5.1-20min10%B、90%A；
流速；0.4ml/min；柱温40℃；
质谱检测条件：负离子检测模式；喷雾电压：-3500v；毛细管温度：400℃；鞘气：N225psi；辅助气：N2 15arb；碰撞气体压力：Ar1.5mTorr；扫描时间：1s；
采用选择反应监测模式：
原儿茶酸离子对m/z153→109或153→91CE=10-30v;
绿原酸m/z353→191或353→85CE=10-40v;
咖啡酸m/z179→135或179→108CE=10-45v；
阿魏酸m/z193→134或193→178CE=5-30v；
迷迭香酸m/z359→161或359→197或133CE=10-50V；
芍药苷m/z525→449或525→121CE=10-30V；
实施例7
一种测定养血清脑有效成分的方法，步骤如下：
（1）样品处理：取血浆样品3体积，加入2体积0.2%的磷酸溶液和1体积氯霉素内标溶液，涡旋混合；之后加入50体积3：1体积比的三氯甲烷与正己烷的混合溶剂有机溶剂涡旋混合进行液液萃取；上述混合液离心后取有机溶剂层，吹干，然后用2体积液相流动相80%A复溶后离心，取上清液进样测定；
（2）采用液质联用仪进行测定：
其中液相部分色谱条件：采用反相c18或c8硅胶色谱柱作为分离介质，进样后梯度洗脱，其中，流动相A5%甲酸、乙酸或水，B乙腈或甲醇；梯度洗脱条件：
0-2.5min10%B、90%A；
2.51-5min100%B；
5.1-20min10%B、90%A；
流速；0.4ml/min；柱温40℃；
质谱检测条件：负离子检测模式；喷雾电压：-3500v；毛细管温度：400℃；鞘气：N225psi；辅助气：N2 15arb；碰撞气体压力：Ar1.5mTorr；扫描时间：1s；
采用选择反应监测模式：
原儿茶酸离子对m/z153→109或153→91CE=10-30v;
绿原酸m/z353→191或353→85CE=10-40v;
咖啡酸m/z179→135或179→108CE=10-45v；
阿魏酸m/z193→134或193→178CE=5-30v；
迷迭香酸m/z359→161或359→197或133CE=10-50V；
芍药苷m/z525→449或525→121CE=10-30V；
实施例8
（1）样品处理：取血浆样品1体积，加入0.2体积0.05mol/L浓度的盐酸溶液和0.2体积100ng/ml浓度的丹参素、酮洛芬、氯霉素或弗比洛芬溶液适量，涡旋混合；之后加入10体积乙酸乙酯溶剂涡旋混合进行液液萃取；上述混合液在3000r/min下离心后取有机层，在30℃水浴下氮气吹干，然后用1体积液相流动相60%A复溶后离心，取上清液进样测定；
（2）采用液质联用仪进行测定：
液相分离：液质联用仪的液相部分采用反相c18硅胶色谱柱为作为分离介质，进样后梯度洗脱；
流动相A0.02%甲酸水，B乙腈或甲醇，梯度洗脱条件：0-2.5min(10%B、90%A)；2.51-5min(100%B)；5.1-20min(10%B、90%A)；流速：0.1ml/min；柱温15℃。
质谱检测：负离子检测模式；喷雾电压：-2500v；毛细管温度：250℃；鞘气：N2（5psi）；辅助气：N2（1arb）；碰撞气体压力：Ar1.5mTorr；扫描时间：0.1s；
采用选择反应监测模式（SRM）：
原儿茶酸离子对m/z153→109或153→91CE=10-30v;
绿原酸m/z353→191或353→85CE=10-40v;
咖啡酸m/z179→135或179→108CE=10-45v；
阿魏酸m/z193→134或193→178CE=5-30v；
迷迭香酸m/z359→161或359→197或133CE=10-50V；
芍药苷m/z525→449或525→121CE=10-30V；
实施例9
一种测定养血清脑有效成分的方法，步骤如下：（1）样品处理：取血浆样品3体积，加入2体积5mol/L浓度的盐酸溶液和1体积300ng/ml浓度的丹参素、酮洛芬、氯霉素或弗比洛芬溶液适量，涡旋混合；之后加入50体积3：1体积比的三氯甲烷与正己烷的混合溶剂涡旋混合进行液液萃取；上述混合液在7000r/min下离心后取有机层，在55℃水浴下氮气吹干，然后用2体积液相流动相80%A复溶后离心，取上清液进样测定；
（2）采用液质联用仪进行测定：
液相分离：液质联用仪的液相部分采用反相c18硅胶色谱柱为作为分离介质，进样后梯度洗脱；
流动相A5%甲酸水，B乙腈或甲醇，梯度洗脱条件：0-2.5min(10%B、90%A)；2.51-5min(100%B)；5.1-20min(10%B、90%A)；流速：0.1-0.4ml/min；柱温15-40℃。
质谱检测：负离子检测模式；喷雾电压：-3500v；毛细管温度：400℃；鞘气：N2（25psi）；辅助气：N2（15arb）；碰撞气体压力：Ar1.5mTorr；扫描时间：1s；
采用选择反应监测模式（SRM）：
原儿茶酸离子对m/z153→109或153→91CE=10-30v;
绿原酸m/z353→191或353→85CE=10-40v;
咖啡酸m/z179→135或179→108CE=10-45v；
阿魏酸m/z193→134或193→178CE=5-30v；
迷迭香酸m/z359→161或359→197或133CE=10-50V；
芍药苷m/z525→449或525→121CE=10-30V；
实施例10
一种测定养血清脑有效成分的方法，步骤如下：
（1）样品处理：取1体积血浆样品，加入1体积0.05mol/L盐酸溶液和0.2体积内标100ng/L的氯霉素溶液，涡旋混合10smin；之后加入10体积乙酸乙酯涡旋混合1min进行液液萃取；上述混合液在4500r/min离心后取乙酸乙酯层，在，35℃水浴下氮气吹干，然后用，然后用1倍体积的流动相（80%A:20%B）复溶，10000r/min离心1min后取上清液进样测定；
（2）采用液质联用仪进行测定：
液相分离：液质联用仪的液相部分采用反相c18硅胶色谱柱作为分离介质，进样后梯度洗脱；
流动相A0.1%甲酸水，B乙腈，梯度洗脱条件：0-2.5min(10%B)；2.51-5min(100%B)；5.1-20min(10%B)；流速：0.2ml/min；柱温30℃。
质谱检测：负离子检测模式；喷雾电压：3000v；毛细管温度：350℃；鞘气：N2（20psi）；辅助气：N2（5arb）；碰撞气体压力：Ar1.5mTorr；扫描时间：0.2s；
采用选择反应监测模式（SRM）：
原儿茶酸m/z153→109CE=19V;
绿原酸m/z353→191CE=18V；
咖啡酸m/z179→135CE=18V；
阿魏酸m/z193→134CE=28V；
迷迭香酸m/z359→161CE=25V；
芍药苷m/z525→449CE=18V；
氯霉素m/z321→152CE=28V。
实施例11
一种测定养血清脑有效成分的方法，步骤如下：
（1）样品处理：取1体积血浆样品，加入1体积5mol/L盐酸溶液和1体积内标300ng/L的氯霉素溶液，涡旋混合2min；之后加入50体积乙酸乙酯涡旋混合8min进行液液萃取；上述混合液在4500r/min离心后取乙酸乙酯层，在，35℃水浴下氮气吹干，然后用，然后用1倍体积的流动相（80%A:20%B）复溶，15000r/min离心6min后取上清液进样测定；
（2）采用液质联用仪进行测定：
液相分离：液质联用仪的液相部分采用反相c18硅胶色谱柱作为分离介质，进样后梯度洗脱；
流动相A0.1%甲酸水，B乙腈，梯度洗脱条件：0-2.5min(10%B)；2.51-5min(100%B)；5.1-20min(10%B)；流速：0.2ml/min；柱温30℃。
质谱检测：负离子检测模式；喷雾电压：3000v；毛细管温度：350℃；鞘气：N2（20psi）；辅助气：N2（5arb）；碰撞气体压力：Ar1.5mTorr；扫描时间：0.2s；
采用选择反应监测模式（SRM）：
原儿茶酸m/z153→109CE=19V;
绿原酸m/z353→191CE=18V；
咖啡酸m/z179→135CE=18V；
阿魏酸m/z193→134CE=28V；
迷迭香酸m/z359→161CE=25V；
芍药苷m/z525→449CE=18V；
实施例12
一种测定养血清脑有效成分的方法，步骤如下：
（1）样品处理：取1体积血浆样品，加入1体积5mol/L盐酸溶液和1体积内标300ng/L的氯霉素溶液，涡旋混合2min；之后加入50体积乙酸乙酯涡旋混合8min进行液液萃取；上述混合液在4500r/min离心后取乙酸乙酯层，在，35℃水浴下氮气吹干，然后用，然后用1倍体积的流动相（80%A:20%B）复溶，15000r/min离心6min后取上清液进样测定；
（2）采用液质联用仪进行测定：
液相分离：液质联用仪的液相部分采用反相c18硅胶色谱柱作为分离介质，进样后梯度洗脱；
流动相A0.1%甲酸水，B乙腈，梯度洗脱条件：0-2.5min(10%B)；2.51-5min(100%B)；5.1-20min(10%B)；流速：0.2ml/min；柱温30℃。
质谱检测：负离子检测模式；喷雾电压：3000v；毛细管温度：350℃；鞘气：N2（20psi）；辅助气：N2（5arb）；碰撞气体压力：Ar1.5mTorr；扫描时间：0.2s；
采用选择反应监测模式（SRM）：
原儿茶酸m/z153→109CE=19V;
绿原酸m/z353→191CE=18V；
咖啡酸m/z179→135CE=18V；
阿魏酸m/z193→134CE=28V；
迷迭香酸m/z359→161CE=25V；
芍药苷m/z525→449CE=18V；
实施例13
一种测定养血清脑有效成分的方法，步骤如下：
（1）样品处理：取1体积血浆样品，加入1体积0.05%的磷酸溶液和1体积内标300ng/L的氯霉素溶液，涡旋混合2min；之后加入50体积乙酸乙酯涡旋混合8min进行液液萃取；上述混合液在4500r/min离心后取乙酸乙酯层，在，35℃水浴下氮气吹干，然后用，然后用1倍体积的流动相（80%A:20%B）复溶，15000r/min离心6min后取上清液进样测定；
（2）采用液质联用仪进行测定：
液相分离：液质联用仪的液相部分采用反相c18硅胶色谱柱作为分离介质，进样后梯度洗脱；
流动相A0.1%甲酸水，B乙腈，梯度洗脱条件：0-2.5min(10%B)；2.51-5min(100%B)；5.1-20min(10%B)；流速：0.2ml/min；柱温30℃。
质谱检测：负离子检测模式；喷雾电压：3000v；毛细管温度：350℃；鞘气：N2（20psi）；辅助气：N2（5arb）；碰撞气体压力：Ar1.5mTorr；扫描时间：0.2s；
采用选择反应监测模式（SRM）：
原儿茶酸m/z153→109CE=19V;
绿原酸m/z353→191CE=18V；
咖啡酸m/z179→135CE=18V；
阿魏酸m/z193→134CE=28V；
迷迭香酸m/z359→161CE=25V；
芍药苷m/z525→449CE=18V；
实施例14
一种测定养血清脑有效成分的方法，步骤如下：
（1）样品处理：取1体积血浆样品，加入1体积1%的甲酸溶液和1体积内标300ng/L的氯霉素溶液，涡旋混合2min；之后加入50体积二氯甲烷或3：1的三氯甲烷与正己烷涡旋混合8min进行液液萃取；上述混合液在4500r/min离心后取二氯甲烷或3：1的三氯甲烷与正己烷层，在，35℃水浴下氮气吹干，然后用，然后用1倍体积的流动相（80%A:20%B）复溶，15000r/min离心6min后取上清液进样测定；
（2）采用液质联用仪进行测定：
液相分离：液质联用仪的液相部分采用反相c18硅胶色谱柱作为分离介质，进样后梯度洗脱；
流动相A0.1%甲酸水，B乙腈，梯度洗脱条件：0-2.5min(10%B)；2.51-5min(100%B)；5.1-20min(10%B)；流速：0.2ml/min；柱温30℃。
质谱检测：负离子检测模式；喷雾电压：3000v；毛细管温度：350℃；鞘气：N2（20psi）；辅助气：N2（5arb）；碰撞气体压力：Ar1.5mTorr；扫描时间：0.2s；
采用选择反应监测模式（SRM）：
原儿茶酸m/z153→109CE=19V;
绿原酸m/z353→191CE=18V；
咖啡酸m/z179→135CE=18V；
阿魏酸m/z193→134CE=28V；
迷迭香酸m/z359→161CE=25V；
芍药苷m/z525→449CE=18V。
Claims (5)
1.一种测定血浆中养血清脑有效成分的方法，其中有效成分为原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、芍药苷6种，其特征在于，步骤如下：
(1)样品处理：取血浆样品1-3体积，加入0.2-2体积酸溶液和0.2-1体积内标溶液，涡旋混合；之后加入10-50体积有机溶剂涡旋混合进行液液萃取；上述混合液离心后取有机溶剂层，吹干，然后用1-2体积液相流动相复溶后离心，取上清液进样测定，其中流动相含50％-90％A相；其中，所述的酸溶液选自，盐酸，0.1-10％的甲酸或0.01-0.2％的磷酸；所述的内标溶液是：丹参素、酮洛芬、氯霉素、弗比洛芬中的一种；所述的有机溶剂为：乙酸乙酯，二氯甲烷或3：1体积比的三氯甲烷与正己烷的混合溶剂；
(2)采用液质联用仪进行测定：
其中液相部分色谱条件：采用反相c18或c8硅胶色谱柱作为分离介质，进样后梯度洗脱，其中，流动相A 0.02-5％甲酸水、0.02-5％乙酸水或水，B乙腈或甲醇；梯度洗脱条件：
0-2.5min 10％B、90％A；
2.51-5min 100％B；
5.1-20min 10％B、90％A；
流速；0.1-0.4ml/min；柱温15-40℃；
质谱检测条件：负离子检测模式；喷雾电压：-2500—-3500v；毛细管温度：250-400℃；鞘气：N2 5-25psi；辅助气：N2 1-15arb；碰撞气体压力：Ar1.5mTorr；扫描时间：0.1-1s；
采用选择反应监测模式：
原儿茶酸离子对m/z153→109或153→91 CE＝10-30v；
绿原酸m/z353→191或353→85 CE＝10-40v；
咖啡酸m/z179→135或179→108 CE＝10-45v；
阿魏酸m/z193→134或193→178 CE＝5-30v；
迷迭香酸m/z 359→161或359→197或133 CE＝10-50V；
芍药苷m/z525→449或525→121 CE＝10-30V；
氯霉素m/z321→152 CE＝10-40V。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤如下：
(1)样品处理：取血浆样品1-3体积，加入0.2-2体积0.05-5mol/L浓度的盐酸溶液和0.2-1体积100-300ng/ml浓度的丹参素、酮洛芬、氯霉素或弗比洛芬溶液适量，涡旋混合；之后加入10-50体积乙酸乙酯，二氯甲烷或3：1体积比的三氯甲烷与正己烷的混合溶剂涡旋混合进行液液萃取；上述混合液在3000-7000r/min下离心后取有机层，在30-55℃水浴下氮气吹干，然后用1-2体积液相流动相复溶后离心，取上清液进样测定，其中流动相含60％-80％A相；
(2)采用液质联用仪进行测定：
液相分离：液质联用仪的液相部分采用反相c18硅胶色谱柱为作为分离介质，进样后梯度洗脱；
流动相A 0.02-5％甲酸水，B乙腈或甲醇，梯度洗脱条件：0-2.5min 10％B、90％A；2.51-5min 100％B；5.1-20min 10％B、90％A；流速：0.1-0.4ml/min；柱温15-40℃；质谱检测：负离子检测模式；喷雾电压：-2500—-3500v；毛细管温度：250-400℃；鞘气：N2 5-25psi；辅助气：N2 1-15arb；碰撞气体压力：Ar 1.5mTorr；扫描时间：0.1-1s；
采用选择反应监测模式：
原儿茶酸离子对m/z153→109或153→91 CE＝10-30v；
绿原酸m/z353→191或353→85 CE＝10-40v；
咖啡酸m/z179→135或179→108 CE＝10-45v；
阿魏酸m/z193→134或193→178 CE＝5-30v；
迷迭香酸m/z 359→161或359→197或133 CE＝10-50V；
芍药苷m/z525→449或525→121 CE＝10-30V；
氯霉素m/z321→152 CE＝10-40V。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤如下：
(1)样品处理：取1体积血浆样品，加入1体积0.05-5mol/L盐酸溶液和0.2-1体积内标100-300ng/L的氯霉素溶液，涡旋混合10s-2min；之后加入10-50体积乙酸乙酯涡旋混合1-8min进行液液萃取；上述混合液在4500r/min离心后取乙酸乙酯层，在，35℃水浴下氮气吹干，然后用，然后用1倍体积的流动相80％A:20％B复溶，10000-15000r/min离心1-6min后取上清液进样测定；
(2)采用液质联用仪进行测定：
液相分离：液质联用仪的液相部分采用反相c18硅胶色谱柱作为分离介质，进样后梯度洗脱；
流动相A 0.1％甲酸水，B乙腈，梯度洗脱条件：0-2.5min 10％B；2.51-5min 100％B；5.1-20min 10％B；流速：0.2ml/min；柱温30℃；
质谱检测：负离子检测模式；喷雾电压：3000v；毛细管温度：350℃；鞘气：N220psi；辅助气：N2 5arb；碰撞气体压力：Ar 1.5mTorr；扫描时间：0.2s；
采用选择反应监测模式：
原儿茶酸m/z153→109 CE＝19V；
绿原酸m/z353→191 CE＝18V；
咖啡酸m/z179→135 CE＝18V；
阿魏酸m/z193→134 CE＝28V；
迷迭香酸m/z 359→161 CE＝25V；
芍药苷m/z525→449 CE＝18V；
氯霉素m/z321→152 CE＝28V。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤如下：
(1)样品处理：取1体积血浆样品，加入1体积1mol/L盐酸溶液和内标1体积的氯霉素200ng/ml溶液，涡旋混合30s；之后加入30体积乙酸乙酯涡旋混合3min进行液液萃取；上述混合液在4500r/min离心后取乙酸乙酯层，35℃在水浴下氮气吹干，然后用，然后用1体积的流动相80％A:20％B复溶，涡旋30s，12000r/min离心3min后取上清液进样测定；
(2)采用液质联用仪进行测定：
液相分离：液质联用仪的液相部分采用反相c18硅胶色谱柱为作为分离介质，进样后梯度洗脱；
流动相A 0.1％甲酸水，B乙腈，梯度洗脱条件：0-2.5min 10％B、90％A；2.51-5min100％B；5.1-20min 10％B、90％A；流速：0.2ml/min；柱温30℃；
质谱检测：负离子检测模式；喷雾电压：3000v；毛细管温度：350℃；鞘气：N220psi；辅助气：N2 5arb；碰撞气体压力：Ar 1.5mTorr；扫描时间：0.2s；
采用选择反应监测模式：
原儿茶酸m/z153→109 CE＝19V；
绿原酸m/z353→191 CE＝18V；
咖啡酸m/z179→135 CE＝18V；
阿魏酸m/z193→134 CE＝28V；
迷迭香酸m/z 359→161 CE＝25V；
芍药苷m/z525→449 CE＝18V；
氯霉素m/z321→152 CE＝28V。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述的酸溶液为1％的甲酸或0.05％的磷酸。
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|---|---|---|---|
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