CN110426469A - 一种舒筋活血制剂指纹图谱及其在整体质量评价上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种舒筋活血制剂指纹图谱及其在整体质量评价上的应用，属于药物质量控制领域。将供试品溶液和对照混合溶液采用液相色谱检测获得色谱图，构建指纹图谱。结合主成分分析(principal component analysis，PCA)、聚类分析(cluster analysis，CA)以及正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS‑DA)对舒筋活血制剂进行整体质量评价。结果显示所建立的指纹图谱结合化学模式识别方法，稳定、简单，并确定出差异最大的四个共有峰，可用于评价舒筋活血制剂质量。

Description

一种舒筋活血制剂指纹图谱及其在整体质量评价上的应用

技术领域

本发明属于药物质量控制领域，具体地涉及一种舒筋活血制剂指纹图谱及其在整体质量评价上的应用。

背景技术

由红花、香附(制)、狗脊(制)、香加皮、槲寄生、泽兰叶、伸筋草、络石藤、鸡血藤、自然铜(锻)10种单味药组成的舒筋活血制剂，具有活血散瘀，舒筋活络之功效，主要用于筋骨疼痛、跌打损伤、类风湿关节炎等症，其中红花具有活血通经、散瘀止痛的功效，香加皮具有祛风湿、强筋骨的功效，主要用于风寒湿痹、腰膝酸软等症，临床数据显示效果良好。根据剂型的不同，制成舒筋活血片和舒筋活血胶囊。

目前，针对舒筋活血制剂方面的的文献报道以统计和观察临床数据为主，化学成分和物质基础方面的研究非常薄弱，舒筋活血制剂相关的研究共有56篇，其中关于含量测定的仅有15篇，关于指纹图谱方面的研究有且只有一篇。且现行的部颁质量标准存在一定问题，目前仅有薄层色谱法对香附、红花、狗脊和香加皮定性鉴别，HPLC法测定4-甲氧基水杨醛的含量。但该品种组方复杂，成分多样，单一的定量指标难以满足其质量标准的要求。

目前的质量标准只控制中药中的部分成分，忽略了中药中的成分多样性、多种机制的协同作用，难以全面衡量中药的疗效和质量。中药指纹图谱是一种有效控制多组分复杂样品质量的方法，能够体现中药复方制剂的特征性和整体性。化学模式识别分析能深度挖掘中药指纹图谱所蕴含的药效成分信息，根据获得的信息来合理评价中药指纹图谱的整体特征。近年来，指纹图谱结合模式识别方法已广泛应用于中药材的质量控制、来源分析及差异标志物筛选等方面。

发明内容

本发明的目的在于提供一种符合舒筋活血制剂指纹图谱及其标准指纹图谱；并通过筛选出指纹图谱中差异性较大色谱峰，通过对差异性较大的色谱峰的重点关注，实现对舒筋活血制剂整体的质量评价。

为解决以上技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的，一种舒筋活血制剂指纹图谱，所述舒筋活血制剂指纹图谱通过以下方法构建：一种舒筋活血制剂指纹图谱，所述舒筋活血制剂指纹图谱通过以下方法构建：

(1)供试品溶液制备：称取舒筋活血制剂0.5g，70vt％甲醇水溶液50mL，称重，水浴回流1h，3000r·min^-1离心15min，用70vt％甲醇水溶液补足重量，取上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得供试品溶液。

(2)对照混合溶液制备：称取羟基红花黄色素A、迷迭香酸、4-甲氧基水杨醛标准品，加70vt％甲醇水溶液溶解，制成每1mL含30μg的羟基红花黄色素A、37μg的迷迭香酸、25μg的4-甲氧基水杨醛的对照混合溶液。

(3)共有峰标定：将步骤1制备的供试品溶液和步骤2制备的对照混合溶液分别经高效液相色谱检测获得色谱图，标定色谱图中的共有峰。

高效液相色谱检测条件：色谱柱为Agilent Poroshell 120SB-C18，尺寸为4.6mm×150mm，粒径为2.7μm，以乙腈-0.2vt％甲酸水溶液为流动相，进行梯度洗脱，流速0.5mL/min，检测波长277nm，柱温30℃。

(4)指纹图谱构建：将步骤3获得的供试品溶液的色谱图和对照混合溶液的色谱图通过多点校正法建立指纹图谱。

进一步地，所述舒筋活血制剂由红花、香附、狗脊、槲寄生、伸筋草、泽兰叶、香加皮、鸡血藤、络石藤、自然铜10味药材制成。

进一步地，所述舒筋活血制剂为片剂、胶囊剂等。

进一步地，步骤3中梯度洗脱的方法如下：

0min时，乙腈和0.2wt％甲酸水溶液的体积比为95∶5；

15min时，乙腈和0.2wt％甲酸水溶液的体积比为85∶15；

20min时，乙腈和0.2wt％甲酸水溶液的体积比为83∶17；

25min时，乙腈和0.2wt％甲酸水溶液的体积比为80∶20；

40min时，乙腈和0.2wt％甲酸水溶液的体积比为70∶30；

50min时，乙腈和0.2wt％甲酸水溶液的体积比为65∶35；

60min时，乙腈和0.2wt％甲酸水溶液的体积比为40∶60；

65min时，乙腈和0.2wt％甲酸水溶液的体积比为0∶100；

75min时，乙腈和0.2wt％甲酸水溶液的体积比为0∶100。

一种所述舒筋活血制剂指纹图谱在舒筋活血制剂整体质量评价上的应用。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：本发明针对目前舒筋活血制剂质量控制方面的不足，对舒筋活血制剂构建指纹图谱并将其应用于舒筋活血制剂整体质量评价。当采用70vt％的甲醇水溶液50mL加热回流1h时，峰面积较高，成分提取较为完全，色谱峰之间分离度较好。构建指纹图谱选择的色谱柱为Poroshell 120柱填充2.7μm填料，其中实心内核为1.7μm，多孔外层为0.5μm。这种小粒径颗粒具有柱效高，分离度好，相比于同粒径的其它色谱柱，压力减少40％-50％，不局限于超高效液相色谱仪，可适用于普通液相色谱仪，因此，针对中药复杂体系的分离普适性更广。在波长277nm下，使用AgilentPoroshell 120SB-C18色谱柱获得的指纹图谱，其特征峰的分离度达到要求，总体峰容量较高，且选择的特征峰能够区分不同厂家舒筋活血制剂的特征。通过HPLC指纹图谱经对相似度的评价、主成分分析、聚类分析、正交偏最小二乘判别分析，能更加科学、全面地控制药品的质量。

附图说明

图1为舒筋活血胶囊的HPLC指纹图谱；

图2为混合对照品图谱；

图3为23批舒筋活血制剂的HPLC指纹图谱；

图4为23批舒筋活血制剂PCA得分图；

图5为23批舒筋活血制剂PCA载荷图；

图6为23批次舒筋活血制剂CA图；

图7为23批舒筋活血制剂OPLS-DA分类得分图；

图8为23批舒筋活血制剂差异性标志物的VIP；

图9为OPLS-DA模型的载荷图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详述，但并不局限于此。

实施例1

舒筋活血制剂液相色谱检测条件的优化：

本发明对甲醇-水-乙酸(体积比47:50:3)、乙腈-0.1vt％磷酸水溶液、乙腈-0.2vt％磷酸水溶液、乙腈-0.2vt％甲酸水溶液、甲醇-0.2vt％甲酸水溶液等不同比例和种类的洗脱系统进行筛选，对264nm、270nm、277nm、280nm不同波长进行考察，当波长为277nm，流动相为乙腈-0.2vt％甲酸水溶液时，色谱峰的分离度较高，峰总数较多，峰纯度较好，更多的成分能被分离出来且含量较高。

本发明对舒筋活血制剂不同提取方法：加热回流和超声，进行筛选，并对溶剂的种类：甲醇、水、乙醇；溶剂的浓度：30vt％甲醇水溶液、50vt％甲醇水溶液、70vt％甲醇水溶液；以及溶剂的提取体积和提取时间进行考察，当处理方法为70vt％的甲醇水溶液50mL加热回流1h时，峰面积较高，成分提取较为完全，色谱峰之间分离度较好。

实施例2

一种舒筋活血制剂指纹图谱的构建及其在整体质量评价上的应用

舒筋活血制剂是由红花、香附、狗脊、槲寄生、伸筋草、泽兰叶、香加皮、鸡血藤、络石藤、自然铜10味药材制成，其剂型包括：片剂、胶囊剂等药学上常见的剂型。根据指纹图谱的要求，选取十个共有峰的峰面积大于总峰面积90％，经质谱鉴定出6个色谱峰，其中4号峰为黄柏内酯，5号峰为羟基红花黄色素A，6号峰为苯己酸，8号峰为去甲络石苷，9号峰为迷迭香酸，10号峰为4-甲氧基水杨醛。市场上能买到的标准品包括羟基红花黄色素A、迷迭香酸和4-甲氧基水杨醛，因此，采用这三个标准品进行混标验证。

(1)仪器与试药

Agilent Technologies 1260infinity II高效液相色谱仪，电子天平(YP502N,上海菁海仪器有限公司)，玻璃夹套加热装置(自制)，色谱柱为Agilent Poroshell120SB-C18(4.6mm×150mm，2.7μm)。

试剂

4-甲氧基水杨醛标准品(批号110790-201605)购自中国食品药品检定研究院，羟基红花黄色素A(批号17082905)、迷迭香酸(批号17040532)、购自成都曼思特生物科技有限公司，舒筋活血制剂的厂家、批号见表1，乙腈(色谱纯，TEDIA)，甲酸(色谱纯，成都科隆化学试剂有限公司)。在整个研究中所使用的水为娃哈哈饮用纯净水(杭州娃哈哈有限公司)。

表1舒筋活血制剂

(2)供试品溶液的制备

称取舒筋活血胶囊粉末0.5g，70vt％甲醇水溶液50mL，称重，水浴回流1h，离心15min(3000r·min^-1)，用70vt％甲醇水溶液补足重量，取上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得供试品溶液。

(3)对照混合溶液的制备

称取羟基红花黄色素A、迷迭香酸、4-甲氧基水杨醛标准品，加70vt％甲醇溶解，制成每1mL含30μg的羟基红花黄色素A、37μg的迷迭香酸、25μg的4-甲氧基水杨醛的对照混合溶液。

(4)高效液相色谱分离条件

色谱柱:Agilent Poroshell 120SB-C18(4.6mm×150mm，粒径2.7μm)，以乙腈-0.2vt％甲酸溶液为流动相，进行梯度洗脱，洗脱方法见表2；流速0.5mL/min，检测波长277nm，柱温30℃。

表2.梯度洗脱方法

(5)共有峰的标定

取华东药业集团康润药业有限公司舒筋活血胶囊粉末(批号：180111)，按照上述供试品溶液和对照品溶液制备方法制备供试品溶液和对照混合溶液，按照上述色谱条件记录色谱图，确定舒筋活血胶囊10个主要色谱峰为共有峰，通过对照混合溶液与供试品溶液的色谱图对比(如图1和2)，指认出三个成分：5号峰为羟基红花黄色素A、9号峰为迷迭香酸、10号峰为4-甲氧基水杨醛，其中10号峰含量较大，分离度较好，选择10号峰为参照峰。

(6)精密度实验

取同一批舒筋活血胶囊粉末(批号：180111)，按照上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按照上述色谱条件连续进样6次，以10号峰的保留时间和峰面积为参照，计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明共有峰的相对保留时间RSD均不大于0.80％，相对峰面积RSD均不大于2.6％，精密度良好。

(7)稳定性实验

取同一批舒筋活血胶囊粉末(批号：180111)，按照上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24h按照上述色谱条件进样，以10号峰的保留时间和峰面积为参照，计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明共有峰的相对保留时间RSD均不大于1.53％，相对峰面积RSD均不大于3.67％，供试品溶液在24h内稳定性良好。

(8)重复性实验

平行制备六份同一批次舒筋活血胶囊粉末(批号：180111)，按照上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样检测按照上述色谱条件进样，以10号峰的保留时间和峰面积为参照，计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明共有峰的相对保留时间RSD均不大于4.15％，相对峰面积RSD均不大于0.78％，重复性良好。

(9)23批样品重叠指纹图谱建立

取不同厂家的23批舒筋活血制剂，按照上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样检测按照上述色谱条件进样，记录色谱图。分别导入“中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012版)”。其中以样品S1作为参照图谱，利用多点校正法建立指纹图谱，中位数法生成23批对照图谱，详见图3。

(10)23批样品的相对保留时间和相对峰面积

以10号峰4-甲氧基水杨醛为参照峰，分别计算23批舒筋活血制剂指纹图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。实验结果如表3和表4所示，23批舒筋活血制剂中各共有峰相对保留时间的RSD为0.75％～2.64％，表明所有批次中10个共有峰的出峰时间相对稳定。23批舒筋活血制剂中各共有峰相对峰面积的RSD为26.31％～81.35％，表明23批来自不同厂家的舒筋活血制剂相对峰面积差异较大，且3号峰和8号峰的RSD值差异最大。

表3.23批舒筋活血制剂HPLC图谱共有峰的相对保留时间

表4.23批舒筋活血制剂HPLC图谱共有峰的相对峰面积分析

(11)23批样品的相似度计算

将23批舒筋活血制剂指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)，将S1设为参照图谱，生成对照图谱，计算各批次样品与标准参照图谱之间的相似度，相似度结果为0.994、0.992、0.995、0.997、0.994、0.968、0.997、0.989、0.997、0.997、0.994、0.992、0.997、0.987、0.983、0.989、0.967、0.835、0.855、0.797、0.899、0.853、0.949。

结果表明S1～S16来自同一个厂家，相似度均大于0.960；S17～S23来自7个不同的厂家，其中S17和S23相似度大于0.949，剩余四批相似度为0.797～0.899，表明不同厂家之间的生产工艺和原料来源存在差异，导致相似度存在差异，同一厂家的样品相似度较为接近，质量的稳定性也较好。

实施例3

舒筋活血制剂化学模式识别分析，包括以下步骤：

(1)主成分分析(PCA)

对23批舒筋活血制剂进行PCA分析，以10个共有峰峰面积为变量，使用SIMCA 13.0统计软件选出贡献率最大的前三个主成分，前三个主成分的总贡献率是71.08％，即前三个主成分能反映舒筋活血制剂的基本特征。计算23批舒筋活血制剂的主成分得分，23批样品的主成分得分如图4所示，23批样品里10个指标的载荷图如图5所示。

由图4可见，可以分为3类，S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15、S16为一类；S23和S17可以分为一类；S18、S19、S20、S21和S22可以分为一类，同一厂家16批样品分为一类，不同厂家的七批样品中，S17和S23可以分为一类，其余四批分为一类。结果表明主成分分析结果与相似度结果结果一致，华东康润药业有限公司的16舒筋活血胶囊制备工艺稳定，红芍集团的舒筋活血胶囊和太极集团的舒筋活血片为一类，不同的剂型对舒筋活血制剂并无太大差异。

图5主要说明样品中10个原始变量与主成分1和主成分2的相关程度，由图5可知，与主成分1影响最大的成分是色谱峰1和色谱峰10，与主成分2影响最大的是色谱峰3，结果表明10个共有峰中，色谱峰1、色谱峰3和色谱峰10能比较明显反映出样品的整体信息，其中10号色谱峰经鉴定出为4-甲氧基水杨醛，主成分分析结果反映可以通过三个色谱峰主要反映不同厂家和批次间的差异性。

(2)聚类分析(CA)

以不同厂家23批舒筋活血制剂中10个共有峰的峰面积为变量，输入SPSS18.0统计分析软件系统聚类方法，采用组间平均连锁法，以平方欧式距离为分类依据，见图6。可见，当阈值为5-10时，可以聚为3类，第1类为是S1～S16；第2类为S17、S23；第3类为S18、S19、S20、S21、S22，聚类分析的结果与相似度分析结果和主成分分析结果一致。

(3)正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)

为了更好分析样品组之间的差异，使用统计数据分析软件SIMCA13.0对23批舒筋活血制剂进行判别分析，根据主成分分析和聚类分析得到的分类结果，使用监督模式识别方法OPLS-DA建模分析，OPLS-DA得分矩阵图见图7。

由图7可明显地分成3类。得到三个关键指标可评价OPLS-DA模型的质量(R2Xcum，概括X矩阵结实率；R2Ycum，反映模型的稳定性；Q2cum反映模型的预测性；其中R2Ycum和Q2cum越接近1说明模型的稳定性和预测性越好)，结果得到R2Xcum＝0.920，R2Ycum＝0.942，Q2cum＝0.759。R2Ycum＝0.942说明该模型中这些共有峰的变化能够解释引起不同分类发生的94.2％；Q2cum＝0.759＞0.5，揭示模型的预测能力较强。为确定各共有峰为差异产生提供的帮助，采用变量重要性投影(variable importance in the projection,VIP)，当VIP值大于1时为有意义变量，选取VIP≥1.0为标准，筛选得到四个影响较大的峰，从大到小依次为1号峰、3号峰、6号峰和10号峰，如图8。从载荷图(图9)中也能看出这4个峰离原点较远，表示这四个峰的差异对分类引起的影响较大。其中10号峰是已知的，是对照品中的4-甲氧基水杨醛。

采用舒筋活血制剂指纹图谱结合化学模式识别，得出不同厂家生产的舒筋活血制剂的质量存在显著差异，一个厂家生产的不同批次的制剂存在微小的差异。结合聚类分析(CA)、主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别法(OPLS-DA)可将上述23批制剂分成3类，筛选得到4个差异性质量标志物，分别为1号峰，3号峰，6号峰和10号峰。此结果可以帮助厂家在生产过程中可以对这四个标志物进行重点关注，加强跟踪这些标志物在各个生产环节中的变化，更加科学全面地控制药品质量，是中药现代化发展过程中非常有意义的环节。

本发明中主成分分析、聚类分析和正交偏最小二乘法结果基本一致，与相似度评价结果相互证明。指纹图谱结合化学模式分析方法为中药质量控制提供合适的方法，能有效的弥补现有标准的不足，可供企业在原药材来源，炮制方法，运输储存，提取加工和剂型选择等各个阶段进行监控，更科学的，系统的控制药品的质量。

Claims (5)

1.一种舒筋活血制剂指纹图谱，其特征在于，所述舒筋活血制剂指纹图谱通过以下方法构建：

(1)供试品溶液制备：称取舒筋活血制剂0.5g，70vt％甲醇水溶液50mL，称重，水浴回流1h，3000r·min^-1离心15min，用70vt％甲醇水溶液补足重量，取上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得供试品溶液。

(2)对照混合溶液制备：称取羟基红花黄色素A、迷迭香酸、4-甲氧基水杨醛标准品，加70vt％甲醇水溶液溶解，制成每1mL含30μg的羟基红花黄色素A、37μg的迷迭香酸、25μg的4-甲氧基水杨醛的对照混合溶液。

(3)共有峰标定：将步骤1制备的供试品溶液和步骤2制备的对照混合溶液分别经高效液相色谱检测获得色谱图，标定色谱图中的共有峰。

高效液相色谱检测条件：色谱柱为Agilent Poroshell 120 SB-C18，尺寸为4.6mm×150mm，粒径为2.7μm，以乙腈-0.2vt％甲酸水溶液为流动相，进行梯度洗脱，流速0.5mL/min，检测波长277nm，柱温30℃。

(4)指纹图谱构建：将步骤3获得的供试品溶液的色谱图和对照混合溶液的色谱图通过多点校正法建立指纹图谱。

2.根据权利要求1所述舒筋活血制剂指纹图谱，其特征在于，所述舒筋活血制剂由红花、香附、狗脊、槲寄生、伸筋草、泽兰叶、香加皮、鸡血藤、络石藤、自然铜10味药材制成。

3.根据权利要求1所述舒筋活血制剂指纹图谱，其特征在于，所述舒筋活血制剂为片剂、胶囊剂等。

4.根据权利要求1所述舒筋活血制剂指纹图谱，其特征在于，步骤3中梯度洗脱的方法如下：

0min时，乙腈和0.2wt％甲酸水溶液的体积比为95∶5；

15min时，乙腈和0.2wt％甲酸水溶液的体积比为85∶15；

20min时，乙腈和0.2wt％甲酸水溶液的体积比为83∶17；

25min时，乙腈和0.2wt％甲酸水溶液的体积比为80∶20；

40min时，乙腈和0.2wt％甲酸水溶液的体积比为70∶30；

50min时，乙腈和0.2wt％甲酸水溶液的体积比为65∶35；

60min时，乙腈和0.2wt％甲酸水溶液的体积比为40∶60；

65min时，乙腈和0.2wt％甲酸水溶液的体积比为0∶100；

75min时，乙腈和0.2wt％甲酸水溶液的体积比为0∶100。

5.一种权利要求1所述舒筋活血制剂指纹图谱在舒筋活血制剂整体质量评价上的应用。