CN104101674B - 一种筛选茵陈蒿汤药效物质基础的方法 - Google Patents

Abstract

一种筛选茵陈蒿汤药效物质基础的方法，它涉及一种筛选中药药效物质基础的方法。本发明要解决现有茵陈蒿汤筛选有效成分时间周期长、耗费大及成本高的问题。本发明方法：一、茵陈蒿汤体内成分峰面积建立；二、基于CCL4肝损伤模型的茵陈蒿汤代谢组学生物标记物建立；三、PCMS研究方法的建立。本发明提供了一种能够快速、简单、准确、耗费小、成本低且通用性较好的筛选中药药效物质基础的方法，该法能够有效确定药效相关成分，并能体现多成分对药效指标综合作用的特点。本发明用于筛选药效物质基础。

Description

一种筛选茵陈蒿汤药效物质基础的方法

技术领域

本发明涉及一种筛选中药药效物质基础的方法，涉及医药领域。

背景技术

中药是中医临床预防及治疗疾病的重要物质基础，具有多组分、多途径、多靶点、多效应整体调节的作用特点，使得研究中药复方物质基础、生物效应及其相互关系相当复杂。挖掘和阐释中药活性物质成分是研发安全有效、质量可控的现代中药的基础，是揭示中药科学内涵、指导临床合理用药的前提。由于中药复方体系的复杂性，使得单纯依赖组分分离或成分分离的传统物质基础研究思路，因研究工作量大而无法穷尽。且中药多组分“谱-效”研究大多局限于多成分的“谱”与复方药理效应单一指标的“效”之间“系统-点”的研究，导致现有的研究报告并不能较好地反映其相关性。中药的复杂性极大地限制了中药药效物质基础的确认及评价。中药的多成分、多靶点及整体性使中药药效物质基础评价研究进展缓慢。中药血清药物化学，即从口服方剂后的含药血清中分离鉴定中药药效物质基础的思路和研究设计，使研究结果体现中药成分的体内治疗状态，获得体现方剂治疗效应的体内直接作用物质，超越体外单味药化学分析难以进行的障碍。中药血清药物化学研究方法为发现中药药效物质基础，解决中药有效性及安全性等质量问题提供了方法学支撑，被国内外广泛应用。利用代谢组学技术解释疾病的生物学本质，利用血清药物化学方法发现方剂的体内直接作用物质；在有效性的前提下将内源性证候的生物标记物与体内的外源性方剂成分相关联阐明方剂药效物质基础及有效性机制，可阐明方剂配伍规律及其科学内涵。

中药入血成分与中药药效之间必然存在关联性，可以利用相关分析将入血成分谱的峰面积(含量)与药效作用强度的动态变化联系起来，通过统计分析并通过生物学实验来确定众多成分中真正的有效成分。鉴于此，基于中药的临床用药形式，以方剂为起点，利用中药血清药物化学方法分析口服方剂后的中药体内直接作用物质及其动态规律，并结合内源性证/病的生物标记物(中药药效标记物)的轨迹变化规律，建立并完善血清中外源性中药成分与内源性标记物两组变量关联度分析方法PlottingofCorrelationbetweenMarkerMetabolitesandSerumConstituents(PCMS)，提取与内源性标记物高度关联的外源性中药成分作为潜在的中药药效物质基础，进行生物学验证，确定中药药效物质基础。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有茵陈蒿汤筛选有效成分时间周期长、耗费大及成本高的问题，提供一种筛选茵陈蒿汤药效物质基础的方法。

本发明的一种筛选茵陈蒿汤药效物质基础的方法，通过以下步骤实现的：

一、茵陈蒿汤体内成分峰面积建立：

(1)供试品的制备：称取18g茵陈蒿加水1400mL煮沸，保持沸腾煎煮至700mL，加入9g栀子和6g大黄，再保持沸腾煎煮10min，煎煮液纱布过滤，滤液浓缩至茵陈蒿浓度为1g/mL，制成冻干粉备用；

(2)体内分析样品的制备：将步骤(1)制备的冻干粉加水配成浓度为0.65g/mL的溶液，以1mL/100g的剂量灌胃给予Wistar雄性大鼠，采用肝门静脉采血法在给药15min后取血，采用固相萃取法纯化后得体内分析样品；

(3)对步骤(2)得到的体内分析样品进行UPLC分离，紫外检测器流出液不经分流直接导入MS/MS质谱系统检测，通过分析各色谱峰的UV、MS、MS/MS数据，鉴定出茵陈蒿汤大鼠血中移行成份21个，测出21个成分的峰面积x_i,j。

二、基于CCL4肝损伤模型的茵陈蒿汤代谢组学生物标记物建立：

(1)样品采集与制备：取大鼠分三组，分别为空白组、模型组和给药组，其中模型组口服体积百分含量为20％的CCL₄油溶液，剂量为1mL/kg，给药组口服给予茵陈蒿汤，茵陈蒿汤剂量为1mL溶液/100g大鼠体重，空白组给予同体积生理盐水，各组每日灌胃给药1次，连续8d，用代谢笼收集12h尿液，尿液收集过程中置于冰中保存，并且各组均肝门静脉采血制备血液样品保存；

(2)样品分析：将尿液和血液样品均于4℃、8000rpm～12000rpm条件下离心5min～10min，取上清液，供UPLC-Q-TOF/MS分析；

其中，该步骤的UPLC条件为：

色谱柱填料ACQUITYUPLC^TMBEHC₁₈，规格为50mm×2.1mm，1.7μm；柱温为35℃；流动相为B相0.1％甲酸乙腈和A相质量百分含量为0.1％甲酸溶液，流速为0.40mL/min～0.60mL/min，检测波长245nm，进样量2.0μL；

其中，质谱条件为：

尿液样品：电喷雾离子源，采用正离子及Tof/MS模式检测；扫描参数：脱溶剂气流量为500L/h～600L/h，温度为300℃，锥孔气流量为50L/h，离子源温度为110℃，毛细管电压为2.5KV，锥孔电压为35V，萃取电压为3.0V，微通道板电压为1600V；每0.1s采集一次；采用亮氨酸-脑啡肽溶液为锁定质量溶液，质量扫描范围为m/z100～1000；

血液样品：脱溶剂气流量为450L/h～650L/h，其余参数与尿液样品参数相同；

(3)CCL₄诱导大鼠肝损伤模型生物标记物的确定：将各组生化指标的数值用SPSS17.0分析，确定相应数据组的生物标记物，在尿液代谢组中确定20个具有显著贡献率的生物标记物，在血液代谢组中确定12个具有显著贡献率的生物标记物；其中尿液代谢组中20个生物标记物为C₁₀H₂₂O₈、C₁₄H₁₈O₅、C₁₄H₁₈N₂O₄、C₉H₇NO₂、C₁₆H₃₁NO₂、C₁₆H₁₂O₅、C₁₂H₁₆N₂O₃、C₁₂H₁₈N₂O₃、C₁₆H₃₁NO₅、C₁₂H₂₀N₄O₅、C₂₄H₃₄O₂、C₂₆H₄₃NO₆、C₁₀H₇NO₃、C₂₄H₃₄O₂、C₂₄H₃₆O₃、C₆H₇N₅O、C₅H₉NO₃、C₂₄H₃₂O₂、C₁₁H₂₀N₂O₃和C₁₅H₂₂O₃；血液代谢组中12个生物标记物为C₃H₅NO₃、C₁₆H₁₈N₃O₃、C₈H₁₀O₆、C₂₀H₃₆N₆O₂、C₁₀H₈O、C₂₆H₃₇NO₃、C₂₄H₃₄O₂、C₃₃H₄₉NO₄、C₈H₄O₃、C₁₂H₁₃NO₂、C₂₄H₃₆O₃和C₂₂H₄₀O₄；

三、PCMS研究方法的建立：

(1)血清中外源性中药化学成分信息数据的标准化：

设有i个评价对象，j个评价指标，通过下述公式得到峰面积标准化y_i,j，

$y_{i,j}=(x_{i,j}-{\stackrel{\‾}{x}}_j)/{\mathrm{\δ}}_j;$

其中为指标j的平均值，δ_j为指标j的标准差，x_i,j为步骤一得到的茵陈蒿汤大鼠血中移行成份的21个峰面积。

(2)代谢生物标记物的相对强度的数据标准化：

设对于步骤二中的生物标记物指标k，给药组治疗前后指标值分别为X_n,k、X_m,k，将这两个治疗前后代谢物指标值进行标准化计算：

${\mathrm{\Δ}}_K=\[\left(X_{m,k}-X_{n,k}\right)-\stackrel{\‾}{X}\]/{\mathrm{\δ}}_k$

其中△_K为步骤二中的生物标记物标准化处理之后数据；X_m,k为步骤二中的生物标记物指标k治疗后的相对强度；X_n,k为步骤二中的生物标记物指标k治疗前的相对强度；为步骤二中的生物标记物指标k的平均值；δ_k为指标k的标准差。

(3)变量相关分析：

$|y_{i,j}=(x_{i,j}-{\stackrel{\‾}{x}}_j)/\mathrm{\δ}j|\frac{Pearson}{CorrelationAnalysis}|{\mathrm{\Δ}}_K=\[(X_{m,k}-X_{n,k})-\stackrel{\‾}{X}\]/{\mathrm{\δ}}_k|;$

通过上述公式得出变量R，R_nm表示成分n在m指标上的相关系数，其中R表示变量关联矩阵，r表示相关系数；

通过R确定药效相关成分对药效指标的作用，其中0.5＜|r|≤1表示显著相关，从而筛选出中药药效物质基础。

本发明的有益效果：

针对现有问题，为了解决现有筛选中药有效成分时间周期长、耗费大、成本高等问题，本实验以茵陈蒿汤为例，采用UPLC/MS建立体内分析指纹图谱，基于四氯化碳致大鼠肝损伤模型，采用代谢组学手段研究茵陈蒿汤治疗作用，找到与药效相关的指纹峰(给药后)或成分群，通过相关性分析PCMS方法研究茵陈蒿汤抗肝损伤的药效物质基础。

本发明提供了一种能够快速、简单、准确、耗费小、成本低且通用性较好的筛选中药药效物质基础的方法，该法能够有效确定药效相关成分，并能体现多成分对药效指标综合作用的特点，为揭示中药方剂物质基础、筛选主要成分提供有效手段。

附图说明

图1是实施例一中茵陈蒿汤效应相关组分对细胞AST、ALT活性的影响图，其中□表示ALT，表示AST，D表示6,7-二甲氧基香豆素，G表示京尼平苷，R表示大黄酸，D+G表示6,7-二甲氧基香豆+京尼平苷，D+R表示6,7-二甲氧基香豆+大黄酸，R+G表示大黄酸+京尼平苷，DGR表示6,7-二甲氧基香豆素、大黄酸和京尼平苷组成的新组方。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式筛选茵陈蒿汤药效物质基础的方法，按以下步骤进行：

一、茵陈蒿汤体内成分峰面积建立：

(1)供试品的制备：称取18g茵陈蒿加水1400mL煮沸，保持沸腾煎煮至700mL，加入9g栀子和6g大黄，再保持沸腾煎煮10min，煎煮液纱布过滤，滤液浓缩至茵陈蒿浓度为1g/mL，制成冻干粉备用；

(2)体内分析样品的制备：将步骤(1)制备的冻干粉加水配成浓度为0.65g/mL的溶液，以1mL/100g的剂量灌胃给予Wistar雄性大鼠，采用肝门静脉采血法在给药15min后取血，采用固相萃取法纯化后得体内分析样品；

(3)对步骤(2)得到的体内分析样品进行UPLC分离，紫外检测器流出液不经分流直接导入MS/MS质谱系统检测，通过分析各色谱峰的UV、MS、MS/MS数据，鉴定出茵陈蒿汤大鼠血中移行成份21个，测出21个成分的峰面积x_i,j。

二、基于CCL4肝损伤模型的茵陈蒿汤代谢组学生物标记物建立：

(1)样品采集与制备：取大鼠分三组，分别为空白组、模型组和给药组，其中模型组口服体积百分含量为20％的CCL₄油溶液，剂量为1mL/kg，给药组口服给予茵陈蒿汤，茵陈蒿汤剂量为1mL溶液/100g大鼠体重，空白组给予同体积生理盐水，各组每日灌胃给药1次，连续8d，用代谢笼收集12h尿液，尿液收集过程中置于冰中保存，并且各组均肝门静脉采血制备血液样品保存；

(2)样品分析：将尿液和血液样品均于4℃、8000rpm～12000rpm条件下离心5min～10min，取上清液，供UPLC-Q-TOF/MS分析；

其中，该步骤的UPLC条件为：

色谱柱填料ACQUITYUPLC^TMBEHC₁₈，规格为50mm×2.1mm，1.7μm；柱温为35℃；流动相为B相0.1％甲酸乙腈和A相质量百分含量为0.1％甲酸溶液，流速为0.40mL/min～0.60mL/min，检测波长245nm，进样量2.0μL；

其中，质谱条件为：

尿液样品：电喷雾离子源，采用正离子及Tof/MS模式检测；扫描参数：脱溶剂气流量为500L/h～600L/h，温度为300℃，锥孔气流量为50L/h，离子源温度为110℃，毛细管电压为2.5KV，锥孔电压为35V，萃取电压为3.0V，微通道板电压为1600V；每0.1s采集一次；采用亮氨酸-脑啡肽溶液为锁定质量溶液，质量扫描范围为m/z100～1000；

血液样品：脱溶剂气流量为450L/h～650L/h，其余参数与尿液样品参数相同；

(3)CCL₄诱导大鼠肝损伤模型生物标记物的确定：将各组生化指标的数值用SPSS17.0分析，确定相应数据组的生物标记物，在尿液代谢组中确定20个具有显著贡献率的生物标记物，在血液代谢组中确定12个具有显著贡献率的生物标记物；其中尿液代谢组中20个生物标记物为C₁₀H₂₂O₈、C₁₄H₁₈O₅、C₁₄H₁₈N₂O₄、C₉H₇NO₂、C₁₆H₃₁NO₂、C₁₆H₁₂O₅、C₁₂H₁₆N₂O₃、C₁₂H₁₈N₂O₃、C₁₆H₃₁NO₅、C₁₂H₂₀N₄O₅、C₂₄H₃₄O₂、C₂₆H₄₃NO₆、C₁₀H₇NO₃、C₂₄H₃₄O₂、C₂₄H₃₆O₃、C₆H₇N₅O、C₅H₉NO₃、C₂₄H₃₂O₂、C₁₁H₂₀N₂O₃和C₁₅H₂₂O₃；血液代谢组中12个生物标记物为C₃H₅NO₃、C₁₆H₁₈N₃O₃、C₈H₁₀O₆、C₂₀H₃₆N₆O₂、C₁₀H₈O、C₂₆H₃₇NO₃、C₂₄H₃₄O₂、C₃₃H₄₉NO₄、C₈H₄O₃、C₁₂H₁₃NO₂、C₂₄H₃₆O₃和C₂₂H₄₀O₄；

三、PCMS研究方法的建立：

(1)血清中外源性中药化学成分信息数据的标准化：

设有i个评价对象，j个评价指标，通过下述公式得到峰面积标准化y_i,j，

$y_{i,j}=(x_{i,j}-{\stackrel{\‾}{x}}_j)/{\mathrm{\δ}}_j,$

其中为指标j的平均值，δ_j为指标j的标准差，x_i,j为步骤一得到的茵陈蒿汤大鼠血中移行成份的21个峰面积。

(2)代谢生物标记物的相对强度的数据标准化：

设对于步骤二中的生物标记物指标k，给药组治疗前后指标值分别为X_n,k、X_m,k，将这两个治疗前后代谢物指标值进行标准化计算：

${\mathrm{\Δ}}_K=\[\left(X_{m,k}-X_{n,k}\right)-\stackrel{\‾}{X}\]/{\mathrm{\δ}}_k$

其中△_K为步骤二中的生物标记物标准化处理之后数据；X_m,k为步骤二中的生物标记物指标k治疗后的相对强度；X_n,k为步骤二中的生物标记物指标k治疗前的相对强度；为步骤二中的生物标记物指标k的平均值；δ_k为指标k的标准差。

(3)变量相关分析：

$|y_{i,j}=(x_{i,j}-{\stackrel{\‾}{x}}_j)/\mathrm{\δ}j|\frac{Pearson}{CorrelationAnalysis}|{\mathrm{\Δ}}_K=\[(X_{m,k}-X_{n,k})-\stackrel{\‾}{X}\]/{\mathrm{\δ}}_k|;$

通过上述公式得出变量R，R_nm表示成分n在m指标上的相关系数，其中R表示变量关联矩阵，r表示相关系数；

通过R确定药效相关成分对药效指标的作用，其中0.5＜|r|≤1表示显著相关，从而筛选出中药药效物质基础。

本实施方式的有益效果：

本实施方式提供了一种能够快速、简单、准确、耗费小、成本低且通用性较好的筛选中药药效物质基础的方法，该法能够有效确定药效相关成分，并能体现多成分对药效指标综合作用的特点，为揭示中药方剂物质基础、筛选主要成分提供有效手段。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二中所述的将尿液和血液样品均于4℃、10000rpm条件下离心5min。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二中所述的UPLC条件为：流动相为B相0.1％甲酸乙腈和A相质量百分含量为0.1％甲酸溶液，流速为0.50mL/min。其它与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中所述的尿液样品：电喷雾离子源，采用正离子及Tof/MS模式检测；扫描参数：脱溶剂气流量为600L/h。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤二中所述的血液样品：脱溶剂气流量为500L/h。其它与具体实施方式一至四之一相同。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例一：

本实施例筛选茵陈蒿汤药效物质基础的方法，按照以下步骤进行：

一、茵陈蒿汤体内成分峰面积建立：

1实验材料

1.1仪器

美国WatersAcquity^TMUPLC液相色谱仪(四元梯度泵-在线真空脱气机-自动进样器-二极管阵列检测器-柱温箱)；美国MicromassQ-TOFmicro^TM四极杆-飞行时间质谱(电喷雾离子源-正负离子扫描方式-Lockspray)；MassLynxV4.1工作站；固相萃取柱(SPE，WatersOasis^RHLB3cc60mg)；KDC-160HR高速低温离心机。

1.2动物

Wistar大鼠，雄性，体重200～240g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。室温饲养，动物自由摄食饮水。实验前24h禁食，自由饮水。

2实验方法

2.1分析条件

2.1.1色谱条件

色谱柱：ACQUITYUPLC^TMBEHC₁₈column(50mm×2.1mmi.d.，1.7μm，WatersCorp，Milford，USA)；流速：0.40mL/min；柱温：45℃；流动相：A:0.1％甲酸-水溶液，流动相B：0.1％甲酸-乙腈溶液；梯度洗脱程序(如表1所示)。二极管阵列检测器全波长扫描，紫外检测器流出液不经分流直接导入质谱系统检测。

表1梯度洗脱程序表

2.1.2质谱条件

电喷雾离子源(ESI)，采用正负离子扫描检测；脱溶剂气流量为600L/h，脱溶剂温度为300℃，雾化气流量为100L/h，离子源温度为110℃，毛细管电压正离子扫描为3200V，负离子扫描为2800V，锥孔电压为35V，微通道板电压为2300V，碰撞能为3V，碰撞气为氩气，碰撞室压力小于2.8×10^-3mbar；每0.1s采集一次谱图，每次采集0.48s；准确质量校正采用亮氨酸-脑啡肽(leucine-enkephalin，[M+H]⁺＝556.2771；[M-H]^-＝554.2615)溶液，校正溶液进样速度为100μL·min^-1，校正频率为5s；扫描方式为全扫描，质量扫描范围m/z100～900。

2.2供试品的制备

2.2.1茵陈蒿汤水煎液冻干粉的制备

茵陈蒿汤的制备方法为：准确称取18g茵陈蒿，加水1400mL煮沸，保持沸腾煎煮至700mL，加入9g栀子和6g大黄，再保持沸腾煎煮10min，煎煮液纱布过滤，滤液浓缩至约1g/mL，制成冻干粉供实验分析用。

2.2.2体内分析样品的制备

取茵陈蒿汤提取物冻干粉适量，加水配成浓度约0.65g/mL的溶液，以1mL/100g的剂量灌胃给与Wistar雄性大鼠。15min后1％戊巴比妥钠0.15mL/100g腹腔注射麻醉，肝门静脉取血置肝素钠管中，4℃、13,000rpm的条件下离心5min，取上清液，-26℃下冻存备用。取灌胃给与茵陈蒿汤冻干粉15min后的大鼠离心血浆500μL，精密加入10μL磷酸，超声处理1min，涡旋混匀30s后上样到预先以3mL甲醇、3mL水活化平衡好的SPE柱上，分别以1mL水和1mL2％甲醇淋洗，淋洗液弃去，再以2mL100％甲醇洗脱，接取洗脱液，45℃下氮气流吹干，残渣以350μL甲醇溶解，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液5μL供UPLC-MS/MS分析。

3结果

茵陈蒿汤大鼠血中移行成份的确定

通过分析各色谱峰的UV、MS、MS/MS数据，鉴定了茵陈蒿汤大鼠血中移行成份21个(如表2所示)。

表2茵陈蒿汤大鼠血中移行成份的UPLC/MS正负离子扫描数据及结构鉴定结果表

二、基于CCL4肝损伤模型的茵陈蒿汤代谢组学生物标记物建立：

1材料与方法

1.1仪器

美国WatersAcquity^TMUPLC液相色谱仪；美国WatersSynapt^TMHighDefinitionMS(HDMS)System质谱分析系统；MassLynxXS工作站；KDC-160HR高速冷冻离心机。

1.2动物

Wistar大鼠(清洁级)，雄性，体重为(260±20)g黑龙江中医药大学GLP提供。饲养温度为(24±2)℃，湿度为65％～75％，12h蔽光，12h光照，自由摄食饮水。

1.3样品采集与制备

30只大鼠，随机分为3组，每组10只，分别为空白组、模型组和给药组。其中模型组口服体积百分含量为20％的CCL₄油溶液(剂量为1mL/kg)，给药组口服给予茵陈蒿汤(剂量为1mL溶液/100g大鼠体重)，空白组给予同体积生理盐水。每日下午6点灌胃给药1次，连续8d，用代谢笼收集12h尿液，尿液收集过程中置于冰中保存。各组均肝门静脉采血，离心(4℃、3000r/min，离心15min)分离血清，按试剂盒方法测定ALT、T-BIL、AST、ALP活性，采血后肝门静脉远肝端动脉夹结扎，同时剥离膈下后腔静脉并结扎，肝门静脉近肝端插针，灌注生理盐水，同时剪开前腔静脉，生理盐水灌流1min左右，至肝脏无血色摘取肝脏，冰生理盐水漂洗。称取肝重，计算肝体比。用冰生理盐水制成10％肝组织匀浆液，按试剂盒方法测定SOD、GSH-PX活性及MDA含量。

尿液及血液样品于4℃、10000rpm离心5min，取上清液，供UPLC-Q-TOF/MS分析。

1.4分析条件

1.4.1色谱条件

色谱柱：ACQUITYUPLC^TMBEHC₁₈Column(50mm×2.1mmi.d.,1.7μm，WatersCorp，Milford，USA)；流速：0.50mL/min；柱温：35℃；流动相：A：0.1％甲酸乙腈，B：0.1％甲酸溶液；洗脱程序(如表3和4所示)。进样量：2.0μL，二极管阵列紫外检测器全波长扫描，流出液不经分流直接导入质谱系统检测。

表3梯度洗脱程序表(尿液样品)

表4梯度洗脱程序表(血液样品)

1.4.2质谱条件

尿液样品：电喷雾离子源(ESI)，采用正离子及TofV模式检测；扫描参数：脱溶剂气流量：600L/h，温度为300℃；锥孔气流量：50L/h；离子源温度为110℃，毛细管电压为2.5KV，锥孔电压：35V，萃取电压：3.0V，微通道板电压：1600V；每0.1s采集一次；采用亮氨酸-脑啡肽(leucine-enkephalin,[M+H]⁺＝556.2771)溶液为锁定质量溶液。质量扫描范围：m/z100～1000。

血液样品：脱溶剂气流量为500L/h，其余参数同上述尿液样品的参数。

1.5数据处理

将各组生化指标的数值用SPSS17.0分析，以均数±标准差(Mean±SD)表示，两组相对应生化指标差值均数间比较采用T-Tests检验，P<0.05示有显著性差异。

质谱数据采用MassLynxXS工作站中的MarkerLynx软件进行色谱峰识别匹配，对数据提取和标准化处理后，利用EZinfo2.0软件进行模式识别分析。

2结果及讨论

2.1生化结果

2.1.1茵陈蒿汤对血清中AST、ALT、ALP、TBIL活性的影响

从表5中可以说明，CCl₄组与空白组相比，CCl₄能显著提高大鼠血清中ALT、ALP、AST活性(p<0.01)，说明大鼠已形成急性肝损伤。茵陈蒿汤给药组与CCl₄组相比，茵陈蒿汤组大鼠血清中AST、ALT、ALP活性均显著降低(p<0.05)，TBIL活性无显著性差异，以ALP活性降低最为明显(p<0.01)。说明茵陈蒿汤对CCl₄引起的大鼠急性肝损伤有保护作用，保护程度与剂量成依赖性。

表5茵陈蒿汤对大鼠血清中AST、ALT、ALP、TBIL活性的影响(Mean±SD，n＝10)

(*p<0.05,**p<0.01vsControl；#p<0.05,##p<0.01vsCCl₄)

2.1.2茵陈蒿汤对肝组织匀浆液中MDA含量、SOD、GSH-PX活性及肝体比的影响

从表6可以看出，CCl₄组与空白组相比，大鼠肝组织中MDA含量、SOD、GSH-PX活性和肝体比均有显著性差异(p<0.01)，表明CCl₄通过升高肝体比和MDA含量，降低SOD、GSH-PX活性，造成肝脏损伤。茵陈蒿汤组对MDA含量、SOD、GSH-PX活性和肝体比的影响均有显著性差异(p<0.05)，表明茵陈蒿汤通过提高肝脏的抗氧化能力，清除氧自由基，降低脂质过氧化，减弱CCl₄对肝脏的损伤。

表6茵陈蒿汤对肝组织匀浆液中MDA含量、SOD、GSH-PX活性及肝体比的影响(Mean±SD，n＝10)

(*p<0.05,**p<0.01vsControl；#p<0.05vsCCl₄)

2.2CCL₄诱导大鼠肝损伤模型生物标记物的确定

采用主成分分析的方法，对空白组和模型组代谢物色谱图经标准化处理后的数据进行分析，首先用无监督PCA模式对所有数据进行置信度为0.05水平的筛选，剔除那些离异的数据，判断组间是否有明显的分类趋势，若趋势明显则进行加入分组信息的偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，绘制出反映组间离散程度的Scoreplot及标示离子对离散趋势贡献程度的Loadingplot。为进一步反映和强化组间的离散程度，进行只对两组数据判别的OPLS分析，获得S-plot，以求清晰显示离子对离散趋势贡献程度，结合相关的反应离子贡献度的VIP值，确定相应数据组的生物标记物。结果在尿液代谢组中确定20个，血液代谢组中确定12个具有显著贡献率的生物标记物(如表7所示)。

采用TOF/MS的方法测定标记物的精确质量，得到测定误差范围内的相应化合物的元素组成和相应化合物不饱和度；通过分子式或分子质量检索化合物数据库，得到可能的化合物结构，再结合MS/MS数据筛选出最有可能的一种或几种化合物，最终通过与对照品对比色谱保留行为以及MS/MS数据来确定标记物的化学结构。

表7CCL₄诱导大鼠肝损伤模型生物标记物信息表

注：↑代表模型组中含量增加；↓代表模型组中含量减少；U尿液；B血液

三、PCMS研究方法的建立：

1血清中外源性中药化学成分信息数据(峰面积)的标准化

设有i个评价对象，j个评价指标，通过下述公式得到峰面积标准化y_i,j，

$y_{i,j}=(x_{i,j}-{\stackrel{\&OverBar;}{x}}_j)/{\mathrm{\&delta;}}_j,$

其中为指标j的平均值，δ_j为指标j的标准差，x_i,j为步骤一得到的茵陈蒿汤大鼠血中移行成份的21个峰面积。

2代谢生物标记物的相对强度的数据标准化

设对于步骤二中的生物标记物指标k，给药组治疗前后指标值分别为X_n,k、X_m,k，将这两个治疗前后代谢物指标值进行标准化计算：

${\mathrm{\&Delta;}}_K=\&lsqb;\left(X_{m,k}-X_{n,k}\right)-\stackrel{\&OverBar;}{X}\&rsqb;/{\mathrm{\&delta;}}_k$

其中△_K为步骤二中的生物标记物标准化处理之后数据；X_m,k为步骤二中的生物标记物指标k治疗后的相对强度；X_n,k为步骤二中的生物标记物指标k治疗前的相对强度；为步骤二中的生物标记物指标k的平均值；δ_k为指标k的标准差。

3变量相关分析(Pearson皮尔逊相关方法)

$|y_{i,j}=(x_{i,j}-{\stackrel{\&OverBar;}{x}}_j)/\mathrm{\&delta;}j|\frac{Pearson}{CorrelationAnalysis}|{\mathrm{\&Delta;}}_K=\&lsqb;(X_{m,k}-X_{n,k})-\stackrel{\&OverBar;}{X}\&rsqb;/{\mathrm{\&delta;}}_k|$

通过上述公式得出变量R，R_nm表示成分n在m指标上的相关系数，其中R表示变量关联矩阵，r表示相关系数；

采用变量相关分析方法(SPSS17.0软件)得到入血各成分标准化后的峰面积(自变量)与代谢生物标记物药效指标(因变量)之间的相互关系的密切程度，根据相关系数确定药效相关成分对药效指标的作用(0.5＜|r|≤1显著相关)，从而筛选出中药药效物质基础。

4结果与讨论

采用PCMS相关分析方法，分别计算21个色谱峰的相对峰面积与代谢生物标记物的相关系数。利用相关系数判断相关关系的密切程度，通常认为：0.5＜|r|≤1呈显著相关。茵陈蒿汤体内入血21个化学成分，其中18个是相关峰。其中6个[峰7(Geniposide)、峰13(6,7-dimethylesculetin)、峰20(Rhein)、峰12(6,8-Dimethoxy-7-hydroxycoumarin)、峰10(5,6-Dimethoxy-7-hydroxycoumarin)、峰11(Quercetin-3-O-glycoside)]呈与代谢生物标记物影响作用显著相关。体现多成分对药效指标的综合作用。峰7(Geniposide)、峰13(6,7-dimethylesculetin)、峰20(Rhein)与效应呈极显著相关。可能是茵陈蒿汤抗肝损伤的药效物质基础。PCSM研究方法可作为揭示中药有效成分的有效手段。对于阐明中药多组分的作用机制和科学内涵、设计及优选给药方案、促进新药开发和药物再评价具有重要意义。

本技术采用绘制Heatmap图，将中药入血化学成分的变化与药效结果联系起来，从而明确药效与成分之间的关系，确定出与药效相关的化学成分群，为全面反映中药复方在体内的移行成分提供依据，突破了传统药物研究模式，具有筛选结果准确、研究时间相对较短的优势。本技术对传统的药效成分筛选方法进行优化，以PCMS技术筛选真正药效成分，该技术可提高有效组分筛选效率，缩短筛选周期。

四、茵陈蒿汤药效相关成分的细胞生物学研究：

基于乙醇诱导原代小鼠肝细胞肝细胞损伤模型，药效验证经PCMS相关分析方法筛选出的与效应呈极显著相关入血成分峰7(Geniposide)、峰13(6,7-dimethylesculetin)、峰20(Rhein)抗肝损伤作用。为PCMS筛选茵陈蒿汤药效相关成分的发现和筛选及评价提供参考依据。

1原代小鼠肝细胞的分离与培养

1.1动物

小鼠，昆明种，雌雄不限，鼠龄3～4个月，由黑龙江中医药大学GLP提供。

1.2分离与培养

(1)用1％戊巴比妥钠麻醉小鼠，用酒精擦拭体表并背位固定。

(2)用75％酒精擦拭鼠腹部，剪掉毛发，更换器械，找到小鼠的肝门静脉，用125mL的Perfusionmedium1灌注，12mL/min，同时剪心放血，清除肝内血液，1min内可见肝脏颜色变浅，持续灌注呈米黄色。

(3)用125mL0.05％胶原酶溶液灌注，12mL/min，肝质变软，压制凹陷不易恢复，然后用剪刀剪下，放置培养皿中。以下操作在冰浴上完成：除去肝脏表面的包膜，7mL左右washingmedium清洗，用移液管轻轻吹打并将细胞悬液吸出，过细胞筛。

(4)4℃、40G离心5min，用移液管吸掉上清液，再用washingmedium清洗一次，4℃、50G离心5min，吸掉上清液，重复3次。

(5)加入贴壁培养液，用移液管将细胞块轻轻吹散后，细胞计数。

(6)最后将细胞接种在孔板上，放入CO₂培养箱中培养。

(7)贴壁4h后，换成全成分培养基中培养。

(8)隔一天一换液。

2MTT检测

2.1原理：MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

2.2实验步骤：

(1)MTT的配制：称取MTT0.5g，溶于100mL的PBS缓冲液中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

(2)取小鼠原代肝细胞，接种在96孔板上，每孔200μL。

(3)5％CO₂、37℃孵育，至细胞单层铺满孔底，更换不含血清的培养基(排除血清对检测指标的干扰)，用200Mm的乙醇培养液(确定造模12h后再次更换200mM的乙醇培养液培养12h以保证在均一条件下造模)，按不同浓度梯度及不同组分配伍的药物给药200μL，孵育24小时。

(4)每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)，继续培养4h。

(5)终止培养，小心吸去孔内培养液。

(6)每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

(7)细胞存活率＝[(试验组吸光度值—空白对照组吸光度值)/对照组吸光度值]×100％。

2.3数据分析及处理：

2.3.1.茵陈蒿汤组分配伍给药浓度研究

在6,7-二甲氧基香豆素浓度为1.8μg/mL，京尼平苷浓度为0.9μg/mL，大黄酸浓度为0.6μg/mL配伍条件给药下，对200mM乙醇培养液诱导的小鼠原代肝细胞损伤的治疗效果最好，所以给药剂量设为6,7-二甲氧基香豆素浓度为1.8μg/mL，京尼平苷浓度为0.9μg/mL，大黄酸浓度为0.6μg/mL。

2.3.2茵陈蒿汤效应相关组分配伍给药对肝细胞损伤的治疗作用

由图1分析可知，模型组与空白组相比，乙醇诱导原代小鼠肝细胞肝细胞损伤能显著提高ALT、AST活性(p<0.01)。茵陈蒿汤效应药效相关组分中AST、ALT活性均显著降低(p<0.05)，各给药组对原代小鼠肝细胞的损伤均有一定治疗作用。由PCSM筛选模型得到的药效相关成分进行了细胞生物学药效验证，说明该发明更具合理性和科学性。PCSM研究方法可作为筛选中药主要有效成分的研究方法。

本发明提供了一种血清中外源性中药成分与内源性标记物变量相关分析用于筛选药效物质基础的方法，提供了一种能够快速、简单、准确、耗费小、成本低且通用性较好的筛选中药药效物质基础的方法，该法能够有效确定药效相关成分，并能体现多成分对药效指标综合作用的特点，为揭示中药方剂物质基础、筛选主要成分提供有效手段。

Claims (5)

1.一种筛选茵陈蒿汤药效物质基础的方法，其特征在于它包括以下步骤：

一、茵陈蒿汤体内成分峰面积建立：

(1)供试品的制备：称取18g茵陈蒿加水1400mL煮沸，保持沸腾煎煮至700mL，加入9g栀子和6g大黄，再保持沸腾煎煮10min，煎煮液纱布过滤，滤液浓缩至茵陈蒿浓度为1g/mL，制成冻干粉备用；

(2)体内分析样品的制备：将步骤(1)制备的冻干粉加水配成浓度为0.65g/mL的溶液，以1mL/100g的剂量灌胃给予Wistar雄性大鼠，采用肝门静脉采血法在给药15min后取血，采用固相萃取法纯化后得体内分析样品；

(3)对步骤(2)得到的体内分析样品进行UPLC分离，紫外检测器流出液不经分流直接导入MS/MS质谱系统检测，通过分析各色谱峰的UV、MS、MS/MS数据，鉴定出茵陈蒿汤大鼠血中移行成份21个，测出21个成分的峰面积x_i,j；

二、基于CCL4肝损伤模型的茵陈蒿汤代谢组学生物标记物建立：

(1)样品采集与制备：取大鼠分三组，分别为空白组、模型组和给药组，其中模型组口服体积百分含量为20％的CCL₄油溶液，剂量为1mL/kg，给药组口服给予茵陈蒿汤，茵陈蒿汤剂量为1mL溶液/100g大鼠体重，空白组给予同体积生理盐水，各组每日灌胃给药1次，连续8d，用代谢笼收集12h尿液，尿液收集过程中置于冰中保存，并且各组均肝门静脉采血制备血液样品保存；

(2)样品分析：将尿液和血液样品均于4℃、8000rpm～12000rpm条件下离心5min～10min，取上清液，供UPLC-Q-TOF/MS分析；

其中，该步骤的UPLC条件为：

色谱柱填料ACQUITYUPLC^TMBEHC₁₈，规格为50mm×2.1mm，1.7μm；柱温为35℃；流动相为B相0.1％甲酸乙腈和A相质量百分含量为0.1％甲酸溶液，流速为0.40mL/min～0.60mL/min，检测波长245nm，进样量2.0μL；

其中，质谱条件为：

尿液样品：电喷雾离子源，采用正离子及Tof/MS模式检测；扫描参数：脱溶剂气流量为500L/h～600L/h，温度为300℃，锥孔气流量为50L/h，离子源温度为110℃，毛细管电压为2.5KV，锥孔电压为35V，萃取电压为3.0V，微通道板电压为1600V；每0.1s采集一次；采用亮氨酸-脑啡肽溶液为锁定质量溶液，质量扫描范围为m/z100～1000；

血液样品：脱溶剂气流量为450L/h～650L/h，其余参数与尿液样品参数相同；

(3)CCL₄诱导大鼠肝损伤模型生物标记物的确定：将各组生化指标的数值用SPSS17.0分析，确定相应数据组的生物标记物，在尿液代谢组中确定20个具有显著贡献率的生物标记物，在血液代谢组中确定12个具有显著贡献率的生物标记物；其中尿液代谢组中20个生物标记物为C₁₀H₂₂O₈、C₁₄H₁₈O₅、C₁₄H₁₈N₂O₄、C₉H₇NO₂、C₁₆H₃₁NO₂、C₁₆H₁₂O₅、C₁₂H₁₆N₂O₃、C₁₂H₁₈N₂O₃、C₁₆H₃₁NO₅、C₁₂H₂₀N₄O₅、C₂₄H₃₄O₂、C₂₆H₄₃NO₆、C₁₀H₇NO₃、C₂₄H₃₄O₂、C₂₄H₃₆O₃、C₆H₇N₅O、C₅H₉NO₃、C₂₄H₃₂O₂、C₁₁H₂₀N₂O₃和C₁₅H₂₂O₃；血液代谢组中12个生物标记物为C₃H₅NO₃、C₁₆H₁₈N₃O₃、C₈H₁₀O₆、C₂₀H₃₆N₆O₂、C₁₀H₈O、C₂₆H₃₇NO₃、C₂₄H₃₄O₂、C₃₃H₄₉NO₄、C₈H₄O₃、C₁₂H₁₃NO₂、C₂₄H₃₆O₃和C₂₂H₄₀O₄；

三、PCMS研究方法的建立：

(1)血清中外源性中药化学成分信息数据的标准化：

设有i个评价对象，j个评价指标，通过下述公式得到峰面积标准化y_i,j，

$y_{i,j}=(x_{i,j}-{\stackrel{\&OverBar;}{x}}_j)/{\mathrm{\&delta;}}_j,$

其中为指标j的平均值，δ_j为指标j的标准差，x_i,j为步骤一得到的茵陈蒿汤大鼠血中移行成份的21个峰面积；

(2)代谢生物标记物的相对强度的数据标准化：

设对于步骤二中的生物标记物指标k，给药组治疗前后指标值分别为X_n,k、X_m,k，将这两个治疗前后代谢物指标值进行标准化计算：

${\mathrm{\&Delta;}}_K=\&lsqb;(X_{m,k}-X_{n,k})-\stackrel{\&OverBar;}{X}\&rsqb;/{\mathrm{\&delta;}}_k$

其中△_K为步骤二中的生物标记物标准化处理之后数据；X_m,k为步骤二中的生物标记物指标k治疗后的相对强度；X_n,k为步骤二中的生物标记物指标k治疗前的相对强度；为步骤二中的生物标记物指标k的平均值；δ_k为指标k的标准差；

(3)变量相关分析：

$|y_{i,j}=(x_{i,j}-{\stackrel{\&OverBar;}{x}}_j)/\mathrm{\&delta;}j|\frac{Pearson}{CorrelationAnalysis}|{\mathrm{\&Delta;}}_K=\&lsqb;(X_{m,k}-X_{n,k})-\stackrel{\&OverBar;}{X}\&rsqb;/{\mathrm{\&delta;}}_k|;$

通过上述公式得出变量R，R_nm表示成分n在m指标上的相关系数，其中R表示变量关联矩阵，r表示相关系数；

通过R确定药效相关成分对药效指标的作用，其中0.5＜|r|≤1表示显著相关，从而筛选出中药药效物质基础。

2.根据权利要求1所述的一种筛选茵陈蒿汤药效物质基础的方法，其特征在于步骤二中所述的将尿液和血液样品均于4℃、10000rpm条件下离心5min。

3.根据权利要求1所述的一种筛选茵陈蒿汤药效物质基础的方法，其特征在于步骤二中所述的UPLC条件为：流动相为B相0.1％甲酸乙腈和A相质量百分含量为0.1％甲酸溶液，流速为0.50mL/min。

4.根据权利要求1所述的一种筛选茵陈蒿汤药效物质基础的方法，其特征在于步骤二中所述的尿液样品：电喷雾离子源，采用正离子及Tof/MS模式检测；扫描参数：脱溶剂气流量为600L/h。

5.根据权利要求1所述的一种筛选茵陈蒿汤药效物质基础的方法，其特征在于步骤二中所述的血液样品：脱溶剂气流量为500L/h。