CN104991016A - 一种生物样本中peg化药物的定量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明为一种生物样本中PEG化药物的定量测定方法，采用液相色谱-飞行时间质谱进行测定，首先制备标准曲线，然后将待测样本进样测定通过标准曲线计算出待测样本中PEG化药物浓度和游离药物的浓度；本发明中质谱条件基于三重串联质谱技术，质谱部分的设定为：第一个质量分析器Q1中不选择母离子，带电粒子全部通过后进入第二个质量分析器Q2；在第二个质量分析器Q2中设置碰撞能量，将带电粒子打碎成碎片离子；在第三个质量分析器离子阱或者飞行时间质量分析器选取稳定的PEG化药物特征碎片离子和游离药物特征碎片离子，来定量PEG化药物和游离药物。本发明针对生物样本中PEG化药物分子量的不唯一性，建立一种定量测定方法，能够同时对生物样本中PEG化药物和游离药物进行分析和定量。

Description

一种生物样本中PEG化药物的定量测定方法

技术领域

   本发明属于药物分析研究技术领域，具体为一种生物样本中PEG化药物的定量测定方法。

背景技术

聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是优良的水溶性高分子化合物，pH中性，无毒，是经FDA批准的少数可以体内注射的合成聚合物之一。小分子药物尤其是抗肿瘤药物普遍存在水溶性差、半衰期短、生物组织分布靶向性差、毒性大等缺陷，极大地限制了其临床应用。PEG亲水性好，没有免疫原性。PEG修饰药物以后，可以明显改善药物分子的水溶性，提高难溶性药物的生物利用度。同时，由于PEG的空间位阻效应，使药物能够缓慢的从结合物的形式中释放出来或者需要在一定的pH或酶存在的条件下才能释放，具有很好的缓释控释作用，因此改善了药物的半衰期，延长了药物在生物体内的作用时间，为减少给药次数和保障用药安全提供了一定的可能性。PEG化药物研究的关键问题在于：PEG化药物引起药效的物质基础是游离出来的小分子药物。因此此类药有两种状态：PEG化药和游离药。对PEG化药物的药代动力学过程分析的主要方法是免疫法和放射性标记法。由于PEG化的药物在体内可能会代谢为游离的药物分子和PEG基团，基于PEG化的抗体无法有效地对PEG化药物以及游离型药物进行区分，而放射性标记法有放射性污染和危害，不适用于人体，因此，这些方法有着明显的局限性。目前，尚没有区分PEG化药物的游离和键合状态，并测定其在血液、组织、细胞中准确含量和动态变化的可信赖的方法。

近年来，迅速发展的液相色谱-串联质谱联用技术（LC-MS/MS）凭借其在定量分析方面的出色表现，为药物的药代动力学研究提供了良好的解决方案。建立一种PEG化小分子药物的生物质谱绝对定量方法，对PEG化药物的药代动力学和药效、药理研究，有着非常重要的意义。LC-MS/MS定量的流程是：色谱分离、离子、质荷比（m/z）扫描、选择特定m/z进行定量。在众多扫描方式中，三重四级杆质量分析器的多重反应监测模式（MRM）选择性好，灵敏度高，已经成为LC-MS/MS分析中最常用的定量方式。这种模式的定量思路是：离子化、第一个四级杆（Q1）：选择一个特定的离子作为母离子，并只允许这一种离子通过、第二个四级杆（Q2）：母离子被碰撞能量打成碎片、第三个四级杆（Q3）：从产生的碎片中选择一个响应高且稳定的碎片作为子离子、测定选择的母子离子对的含量。所以这种模式必须在知道待测化合物母离子和子离子的准确m/z的前提下才能进行。

而PEG是由一系列以乙二醇为基本单元组成的高分子混合物，其分子量不是唯一的值，而是以某个聚合度的分子量平均值为中心呈正态分布，如：PEG 4000其实是以分子量4000为中心呈正态分布的多种分子量PEG分子的混合物； PEG600、PEG4000、PEG6000、PEG10000均为多种分子量PEG分子的混合物；因此这给以待测化合物目标分子量为基础的LC-MS/MS定量分析带来了挑战。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，建立一种可以同时测定PEG化药物的游离药物和键合药物的不依赖于分析物母离子分子质量的非传统生物质谱绝对定量方法，该测定方法不受PEG化药物中PEG分子量不同的影响，简便易行，准确可靠。本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

一种生物样本中PEG化药物的定量测定方法，采用液相色谱-飞行时间质谱进行测定，测定步骤包括：

A. 建立游离药物测定标准曲线和PEG化药物测定标准曲线；

B. 使用液相色谱-飞行时间质谱测定待测样品，通过步骤A所得标准曲线计算出待测样本中游离药物浓度和PEG化药物浓度；

步骤A和步骤B的色谱条件和质谱条件相同，其中质谱条件基于三重串联质谱技术，步骤A和步骤B质谱部分的设定为：第一个质量分析器Q1中不选择母离子，带电粒子全部通过后进入第二个质量分析器Q2；在第二个质量分析器Q2中设置碰撞能量，将带电粒子打碎成碎片离子；在第三个质量分析器离子阱或者飞行时间质量分析器选取稳定的PEG化药物特征碎片离子和游离药物特征碎片离子，来定量PEG化药物和游离药物。

进一步的，所述PEG化药物特征碎片离子为 3个乙二醇重复单元，PEG化药物特征碎片离子m/z为133.083~133.086。

进一步的，所述PEG化药物特征碎片离子m/z为133.08592。

进一步的，所述质谱操作部分第二个质量分析器Q2中碰撞电压为37eV。

进一步的，所述质谱操作部分第二个质量分析器Q2中碰撞电压为70eV。

进一步的，步骤A和步骤B中所述质谱条件为：离子源：ESI离子化源；正离子方式检测；离子喷射电压4000 V；温度550℃；源内气体1：氮气压力40 psi；气体2：氮气压力40 psi；气帘气体：氮气压力30 psi；解簇电压（DP电压）：91 V；扫描方式为TOF MS Scan或者 EMS Scan。

进一步的，步骤A和步骤B中所述色谱条件为：流动相：含体积百分数占0.1%甲酸的水和含体积百分数占0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脱；柱温30℃。

进一步的，所述步骤A具体操作程序为：

1）制备梯度稀释的不同浓度的游离药物标准溶液和PEG化药物标准溶液；

2）将程序1）中所得游离药物标准溶液和PEG化药物标准溶液进样到高效液相色谱-飞行时间质谱中分析；

3）记录色谱图，以游离药物和PEG化药物浓度为横坐标，游离药物和PEG化药物峰面积为纵坐标，用加权W=1/x²最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线。

进一步的，所述步骤B具体操作程序为：

1）于抗吸附管中加入待测样本溶液、内标溶液及预冷的乙腈后涡流混匀，离心后取上清液进样到高效液相色谱-飞行时间质谱中分析；

2）记录色谱图，将程序1）中获取的游离药物和PEG化药物面积代入标准曲线，求得游离药物和PEG化药物浓度。

本发明的优势在于：

1、PEG化药物分子量不唯一，传统的MRM模式不适合具有多个分子量的PEG化药物的分析，本技术针对不同分子量的PEG化药物共有的特异性碎片，在Q2加入碰撞能量，运用串联质谱的TOF MS Scan或者EMS模式对特异型性碎片进行测定，专属性强，灵敏度高，适用范围广。

2、运用PEG化药物的特异性碎片同时对PEG化药物和游离药物进行分析和定量。

下面结合附图及具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1 是本发明中对PEG化药物特异性碎片进行扫描流程图。

图2是大鼠尾静脉给予PEG化阿霉素后阿霉素及PEG化阿霉素血药浓度时间曲线。

图3是阿霉素及PEG化阿霉素典型色谱图。

图4是大鼠尾静脉给予PEG化吉西他滨后吉西他滨及PEG化吉西他滨血药浓度时间曲线。

图5是吉西他滨及PEG化吉西他滨典型色谱图。

具体实施方式

  

实施例1

一种生物样本中PEG化药物的定量测定方法，采用液相色谱-飞行时间质谱进行测定，测定步骤包括：

A.建立游离药物测定标准曲线和PEG化药物测定标准曲线，

B. 使用液相色谱-飞行时间质谱测定待测样品，通过步骤A所得标准曲线计算出待测样本中游离药物浓度和PEG化药物浓度；

步骤A和步骤B的色谱条件和质谱条件相同，其中质谱条件基于三重串联质谱技术，步骤A和步骤B质谱部分的设定为：第一个质量分析器Q1中电压设置为RF (射频电压)only，不选择母离子，带电粒子全部通过后进入第二个质量分析器Q2；在第二个质量分析器Q2中设置碰撞能量，将带电粒子打碎成碎片离子；在第三个质量分析器离子阱或者飞行时间质量分析器选取稳定的PEG化药物特征碎片离子和游离药物特征碎片离子，来定量PEG化药物和游离药物。

PEG化药物特征碎片离子为 3个乙二醇重复单元，PEG化药物特征碎片离子m/z为133.083~133.086，精确为133.08592。

步骤A和步骤B中所述质谱条件为：Q-Q-Tof/Trap型串联质谱仪，配有ESI离子化源和Analyst数据处理软件；离子源：ESI离子化源；正离子方式检测；离子喷射电压4000 V；温度550℃；源内气体1：氮气压力40 psi；气体2：氮气压力40 psi；气帘气体：氮气压力30 psi；解簇电压（DP电压）：91 V；扫描方式为TOF MS Scan或者 EMS Scan。

步骤A和步骤B中所述色谱条件为：高效液相液相色谱系统；色谱柱：流动相：含体积百分数占0.1%甲酸的水和含体积百分数占0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脱；柱温30℃。

所述步骤A具体操作程序为：

1）制备梯度稀释的不同浓度的游离药物标准溶液和PEG化药物标准溶液；

2）将步程序1）中所得游离药物标准溶液和PEG化药物标准溶液进样到高效液相色谱-飞行时间质谱中分析；

3）记录色谱图，以游离药物和PEG化药物浓度为横坐标，游离药物和PEG化药物峰面积为纵坐标，用加权W=1/x²最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线。

所述步骤B具体操作程序为：

1）于抗吸附管中加入待测样本溶液、内标溶液及预冷的乙腈后涡流混匀，离心后取上清液进样到高效液相色谱-飞行时间质谱中分析；

2）记录色谱图，将程序1）中获取的游离药物和PEG化药物面积代入标准曲线，求得游离药物和PEG化药物浓度。

基于液相色谱-串联质谱（LC-Q-Q-Tof/Trap MS），PEG化药物和游离药物通过液相色谱分离，在质谱四级杆Q2处施加碰撞能量（CE），分析物经能量碰撞产生特异性碎片，利用TOF MS Scan或者EMS Scan模式对特异性碎片进行扫描分析，建立PEG化药物及游离药物稳定、可靠的LC/MS/MS定量方法，具体流程如图1所示。利用PEG化药物作为标准物质进行定量分析建立标准曲线，从而实现特异性碎片的定量。选取PEG化阿霉素、PEG化阿吉西他滨代表PEG化小分子药物，对本方法进行验证，配制不同浓度的PEG化阿霉素标准系列溶液，寻找到PEG化阿霉素的特异性碎片m/z为133.08592（来自于PEG），m/z 361.07068（来自于阿霉素）；PEG化吉西他滨的特异性碎片m/z为133.08592（来自于PEG），m/z 112.0486（来自于吉西他滨）。对PEG化阿霉素及游离阿霉素，PEG化吉西他滨及游离吉西他滨进行定量，并将其应用于大鼠静脉给予PEG化阿霉素之后的药物代谢动力学研究。

实施例2

在实施例1的基础上具体对血浆中PEG化阿霉素进行测定。

一种生物样本中PEG化阿霉素的定量测定方法，

将载药量等同于1mg阿霉素的PEG化阿霉素用1mL生理盐水溶解，大鼠尾静脉给药，采血时间点如下：0、0.05、0.083、0.167、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、12、24、48、72h。测定大鼠尾静脉给予PEG化阿霉素之后血浆中游离阿霉素和PEG化阿霉素的含量，血浆药物浓度时间曲线见图2。

采用液相色谱-飞行时间质谱进行测定，测定步骤包括：

A.阿霉素浓度测定标准曲线和PEG化阿霉素浓度测定标准曲线的制备；

1）利用乙腈-水（1/1,v/v）溶液将阿霉素和PEG化阿霉素储备液分别稀释至0.05、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0 μg/mL；

2）将步骤1）中所得阿霉素标准溶液和PEG化阿霉素标准溶液分别取50 ml进样到高效液相色谱-飞行时间质谱中分析；

3）记录色谱图，图3，以阿霉素和PEG化阿霉素浓度为横坐标，阿霉素和PEG化阿霉素峰面积为纵坐标，用加权W=1/x2最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线，如表1所示。

B. 使用液相色谱-飞行时间质谱测定待测样品，通过步骤A所得标准曲线计算出待测样本中阿霉素浓度和PEG化阿霉素浓度；

按“标准曲线制备”项下操作，制备低、中、高三个浓度（0.1、1.0、10.0 μg/mL）质量控制样品，每浓度至少三样本，根据标准曲线，得出浓度。

计算质量控制样品准确度，具体见表2，考察方法准确性。

步骤A和步骤B的色谱条件和质谱条件相同，其中质谱条件基于三重串联质谱技术，步骤A和步骤B质谱部分的设定为：第一个质量分析器Q1中电压设置为RF (射频电压)only，不选择母离子，带电粒子全部通过后进入第二个质量分析器Q2；在第二个质量分析器Q2中设置碰撞能量，将带电粒子打碎成碎片离子；在第三个质量分析器离子阱或者飞行时间质量分析器选取稳定的PEG化阿霉素特征碎片离子和阿霉素特征碎片离子，来定量PEG化阿霉素和阿霉素。

PEG化药物特征碎片离子为 3个乙二醇重复单元，PEG化药物特征碎片离子m/z 133.08592；阿霉素特征碎片离子m/z 为361.07068。

步骤A和步骤B中所述色谱条件为：高效液相液相色谱系统；色谱柱：300SB C18柱，150 mm×4.6 mm I.D.，5μm粒径；流动相：含体积百分数占0.1%甲酸的水和含体积百分数占0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脱；柱温30℃；流速0.8 ml/min；进样量50ml；

色谱条件中的梯度洗脱，程序见表3，

其中A是含体积百分数占0.1%甲酸的水，B是含体积百分数占0.1%。

步骤A和步骤B中所述质谱条件为：Q-Q-Tof/Trap型串联质谱仪，配有ESI离子化源和Analyst数据处理软件；离子源：ESI离子化源；正离子方式检测；离子喷射电压4000 V；温度550℃；源内气体1：氮气压力40 psi；气体2：氮气压力40 psi；气帘气体：氮气压力30 psi；解簇电压（DP电压）：91 V，碰撞能量（CE电压）：37 eV；扫描方式为TOF MS Scan或者 EMS Scan。

实施例3

在实施例1的基础上具体对血浆中PEG化吉西他滨进行测定。

一种生物样本中PEG化吉西他滨的定量测定方法，

将载药量等同于4mg吉西他滨的PEG化吉西他滨用1mL生理盐水溶解，大鼠尾静脉给药，采血时间点如下：0、0.083h、0.25h、0.75h、1h、1.5h、2h、4 h、6 h、9 h、24 h、36h经大鼠眼眶静脉取血0.5mL，将血浆置于预冷的肝素化EP管中，4℃离心（15000 rpm，5 min），分离血浆，取全部上清，将上清液置于-20℃冰箱保存待测。测定大鼠尾静脉给予PEG化吉西他滨之后血浆中游离吉西他滨和PEG化吉西他滨的含量，血浆药物浓度时间曲线见图4.

采用液相色谱-飞行时间质谱进行测定，测定步骤包括：

A.吉西他汀浓度测定标准曲线和PEG化吉西他汀浓度测定标准曲线的制备；

1）利用乙腈-水（1/1,v/v）溶液将吉西他滨和PEG化吉西他滨储备液分别稀释至0.25、0.5、1.5、5、15、50、150 μg/mL；

2）将步骤1）中所得吉西他汀标准溶液和PEG化吉西他汀标准溶液分别取50 ml进样到高效液相色谱-飞行时间质谱中分析；

3）记录色谱图，图5，以吉西他汀和PEG化吉西他汀浓度为横坐标，吉西他汀和PEG化吉西他汀峰面积为纵坐标，用加权W=1/x2最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线，如表4所示。

B. 使用液相色谱-飞行时间质谱测定待测样品，通过步骤A所得标准曲线计算出待测样本中吉西他汀浓度和PEG化吉西他汀浓度；

按“标准曲线制备”项下操作，制备低、中、高三个浓度（0.5、5、50 μg/mL）质量控制样品，每浓度至少三样本，根据标准曲线，得出浓度。

计算质量控制样品准确度，具体见表5，考察方法准确性。

步骤A和步骤B的色谱条件和质谱条件相同，其中质谱条件基于三重串联质谱技术，步骤A和步骤B质谱部分的设定为：第一个质量分析器Q1中电压设置为RF (射频电压)only，不选择母离子，带电粒子全部通过后进入第二个质量分析器Q2；在第二个质量分析器Q2中设置碰撞能量，将带电粒子打碎成碎片离子；在第三个质量分析器离子阱或者飞行时间质量分析器选取稳定的PEG化吉西他汀特征碎片离子和吉西他汀特征碎片离子，来定量PEG化吉西他汀和吉西他汀。

PEG化药物特征碎片离子为 3个乙二醇重复单元，PEG化药物特征碎片离子m/z 133.08592；吉西他汀特征碎片离子m/z 为112.0486。

步骤A和步骤B中所述色谱条件为：高效液相液相色谱系统；色谱柱：300SB C18柱， 50 mm×2.1mm I.D.，5μm粒径；流动相：含体积百分数占0.1%甲酸的水和含体积百分数占0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脱；柱温30℃；流速0.4 ml/min；进样量50ml。

色谱条件中的梯度洗脱，程序见表6。

其中A是含体积百分数占0.1%甲酸的水，B是含体积百分数占0.1%甲酸的乙腈。 

步骤A和步骤B中所述质谱条件为：Q-Q-Tof/Trap型串联质谱仪，配有DuoSpray^TM离子化源和Analyst数据处理软件；离子源：DuoSpray^TM离子化源；正离子方式检测；离子喷射电压4000 V；温度550℃；源内气体1：氮气压力40 psi；气体2：氮气压力40 psi；气帘气体：氮气压力30 psi；解簇电压（DP电压）：91 V；碰撞能量（CE电压）：70 eV；扫描方式为TOF MS Scan或者 EMS Scan。

Claims (9)

1.一种生物样本中PEG化药物的定量测定方法，其特征在于：采用液相色谱-飞行时间质谱进行测定，测定步骤包括：

A. 建立游离药物测定标准曲线和PEG化药物测定标准曲线；

B. 使用液相色谱-飞行时间质谱测定待测样品，通过步骤A所得标准曲线计算出待测样本中游离药物浓度和PEG化药物浓度；

步骤A和步骤B的色谱条件和质谱条件相同，其中质谱条件基于三重串联质谱技术，步骤A和步骤B质谱部分的设定为：第一个质量分析器Q1中不选择母离子，带电粒子全部通过后进入第二个质量分析器Q2；在第二个质量分析器Q2中设置碰撞能量，将带电粒子打碎成碎片离子；在第三个质量分析器离子阱或者飞行时间质量分析器选取稳定的PEG化药物特征碎片离子和游离药物特征碎片离子，来定量PEG化药物和游离药物。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述PEG化药物特征碎片离子m/z为133.083~133.086。

3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于：所述PEG化药物特征碎片离子m/z为133.08592。

4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述质谱操作部分第二个质量分析器Q2中碰撞电压为37eV。

5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述质谱操作部分第二个质量分析器Q2中碰撞电压为70eV。

6.根据权利要求1~5中任意一项所述的测定方法，其特征在于：步骤A和步骤B中所述质谱条件为：离子源：ESI离子化源；正离子方式检测；离子喷射电压4000 V；温度550℃；源内气体1：氮气压力40 psi；气体2：氮气压力40 psi；气帘气体：氮气压力30 psi；解簇电压：91 V；扫描方式为TOF MS Scan或者 EMS Scan。

7.根据权利要求1~5中任意一项所述的测定方法，其特征在于：步骤A和步骤B中所述色谱条件为：流动相：含体积百分数占0.1%甲酸的水和含体积百分数占0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脱；柱温30℃。

8.根据权利要求1~5中任意一项所述的测定方法，其特征在于：所述步骤A具体操作程序为：

1）制备梯度稀释的不同浓度的游离药物标准溶液和PEG化药物标准溶液；

2）将程序1）中所得游离药物标准溶液和PEG化药物标准溶液进样到高效液相色谱-飞行时间质谱中分析；

3）记录色谱图，以游离药物和PEG化药物浓度为横坐标，游离药物和PEG化药物峰面积为纵坐标，用加权W=1/x²最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线。

9.根据权利要求8所述的测定方法，其特征在于：所述步骤B具体操作程序为：

1）于抗吸附管中加入待测样本溶液、内标溶液及预冷的乙腈后涡流混匀，离心后取上清液进样到高效液相色谱-飞行时间质谱中分析；

2）记录色谱图，将程序1）中获取的游离药物和PEG化药物面积代入标准曲线，求得游离药物和PEG化药物浓度。